ZD制劑對(duì)馬急性軟組織損傷模型的作用

楊珊珊，李云章，王 煜，羅園渠，蔣瑞東，劉 偉，程 波，任書男

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

賽馬比賽中的損傷主要是肢蹄的軟組織損傷，有效的治療馬匹肢蹄病能夠?yàn)橘愂卤ｑ{護(hù)航，提高馬匹福利和畜主利益。急性軟組織損傷包括皮膚、皮下組織、肌肉、肌腱、韌帶、關(guān)節(jié)、腱鞘、黏液囊等組織的損傷[1-2]。馬匹的常見軟組織損傷疾病有肌腱炎、骨膜炎、肌肉挫傷、韌帶炎、關(guān)節(jié)炎、腱鞘、黏液囊炎等[3]。肌肉狀態(tài)影響馬匹、運(yùn)動(dòng)員在賽場上的表現(xiàn)、高水平運(yùn)動(dòng)員馬匹的競技水平和骨骼肌的狀態(tài)有著密不可分的關(guān)系[4]。傳統(tǒng)獸醫(yī)學(xué)在臨床治療馬軟組織損傷方面有著悠久的歷史，且流傳很多治療效果良好的中獸藥驗(yàn)方。ZD制劑是治療馬屬動(dòng)物肢蹄軟組織損傷的經(jīng)驗(yàn)方劑，在臨床應(yīng)用中取得較好的療效，前期在小鼠模型上發(fā)現(xiàn)ZD制劑有抗炎鎮(zhèn)痛、降低毛細(xì)血管通透性、改善微循環(huán)、縮短組織修復(fù)時(shí)間的作用[5-6]。前期在馬的骨骼肌、肌腱損傷模型上驗(yàn)證了ZD制劑的療效[7]。本試驗(yàn)建立馬急性軟組織損傷模型，采用非介入性的超聲診斷、紅外熱像技術(shù)觀察、評(píng)估ZD制劑對(duì)馬骨骼肌挫傷的作用，為進(jìn)一步探明ZD制劑的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物和試劑 ZD制劑，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)臨床獸醫(yī)系自制；ZD制劑由乳香、沒藥、紅花等12味中藥組成，軟膏基質(zhì)有甘油、三乙醇胺、山梨酸鉀、醫(yī)用凡士林、單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、液體石蠟、冰片、醫(yī)用氮酮。經(jīng)過煎藥、低壓濃縮制成中藥原液，后使用保濕劑、乳化劑、防腐劑等將水相和油相進(jìn)行乳化，制成水包油的膏劑；按摩軟膏，神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，國藥準(zhǔn)字Z27020377；靜松靈，蘭州正豐制藥有限責(zé)任公司產(chǎn)品，批號(hào)2012-280031579；空白膏藥為ZD制劑不加中藥原液，軟膏基質(zhì)相同，由生理鹽水制成空白膏藥。

1.1.2 儀器設(shè)備 傳感器，啟勵(lì)傳感系統(tǒng)工程有限公司產(chǎn)品；紅外熱成像儀，F(xiàn)luke公司產(chǎn)品；繩索、獸用B超機(jī)、超聲線陣探頭，Esaote Mylab30產(chǎn)品；耦合劑，天津市西苑寺生產(chǎn)；皮膚取樣器(P1050)，Acuderm Inc公司產(chǎn)品。

1.1.3 試驗(yàn)用動(dòng)物 20匹蒙古馬由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物園提供，體重250 kg±50 kg。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型的構(gòu)建 將試驗(yàn)用馬隨機(jī)分為4組，分別為模型組和正常組，模型組進(jìn)行造模，正常組不進(jìn)行造模。模型組分為試驗(yàn)藥物組，陽性藥物組，陰性對(duì)照組。陰性對(duì)照組給予不含ZD制劑中藥原液的空白膏藥，試驗(yàn)藥物組給予自制ZD制劑膏藥，陽性藥物組給予按摩乳，造模部位12 h內(nèi)出現(xiàn)明顯腫脹，有淤血點(diǎn)出現(xiàn)，局部發(fā)熱。造模后2 h于損傷處涂抹藥物，每天1次，連續(xù)用藥30 d，藥物厚度約5 mm。

將馬隨機(jī)分為2組，模型組和正常組。正常對(duì)照組不進(jìn)行造模。模型組馬匹左側(cè)肩部臂部剃毛，靜松靈鎮(zhèn)靜后，對(duì)馬進(jìn)行保定，用重物從高處自由落下，錘擊肩部肌肉，排列錘擊，重復(fù)操作，每點(diǎn)4次，制作急性軟組織損傷模型。造模部位12 h內(nèi)出現(xiàn)明顯腫脹，淤血，局部發(fā)熱。通過傳感器測量其平均撞擊受力，得出瞬時(shí)應(yīng)力為78.84 N/cm2±15.22 N/cm2。

1.2.2 血清檢測 造模前、后對(duì)馬進(jìn)行頸靜脈采血，靜置，離心分離血清，置-20℃保存，檢測乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)，谷草轉(zhuǎn)氨酶 (aspartate transaminase,AST)，肌酸激酶(creatine kinase,CK)的含量。

1.2.3 損傷部位形態(tài)學(xué)觀察 對(duì)馬匹靜脈注射靜松靈鎮(zhèn)靜，倒臥保定，肩部臂部剃毛，無菌操作，用皮膚取樣器依次在造模前、后12 h進(jìn)行肌肉取樣。組織用中性福爾馬林固定，制作石蠟切片，染色鏡檢，觀察并記錄。

1.2.4 馬模型超聲觀察 將動(dòng)物拉入六柱欄，用推子剔除體表毛，用肥皂水清洗檢查部位，并用清水沖洗掉肥皂，涂抹耦合劑。實(shí)施超聲機(jī)檢查。掃描受損部位和對(duì)側(cè)健康部位的肌肉，對(duì)比兩側(cè)肌肉灰度，皮下組織厚度。

1.2.5 損傷部位紅外熱成像拍攝 紅外熱成像評(píng)估，提前30 min將動(dòng)物拉入室內(nèi)，關(guān)閉門窗，使室內(nèi)無空氣對(duì)流，拍攝部位據(jù)鏡頭2 m。待動(dòng)物安靜后，進(jìn)行拍攝，每個(gè)部位拍攝3次，記錄損傷部位與健康部位溫度差值。

2 結(jié)果

2.1 造模后血液檢測

由表1可知，造模前兩組比較，差異不顯著(P>0.05)；造模后1 d，模型組血清中LDH含量顯著增加，模型組和正常組比較，差異極顯著(P<0.01)。

由表2可知，造模前模型組和正常組的AST含量差異不顯著(P>0.05)；造模后模型組血清中的AST含量升高，正常組血清中的AST含量始終處于正常范圍內(nèi)。造模后1 d，模型組血清中AST含量和正常組比較差異顯著(P<0.05)。

由表3可知，造模前模型組和正常組的CK含量差異不顯著(P>0.05)；造模后模型組的CK數(shù)值明顯升高，差異極顯著(P<0.01)，造模后1 d模型組和正常組比較差異極顯著(P<0.01)。

表1 各組馬血清中LDH的變化

注：與正常組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

Note：* means the difference is significant at the 0.05 level compared to normal group; ** means the difference is significant at the 0.01 level.

表2 各組馬血清中AST的變化

注：與正常組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

Note：* means the difference is significant at the 0.05 level compared to normal group; ** means the difference is significant at the 0.01 level.

表3 血清中肌酸激酶含量

注：與正常組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

Note:* means the difference is significant at the 0.05 level compared to normal group; ** means the difference is significant at the 0.01 level.

2.2 損傷部位肌肉切片的光鏡觀察

正常肌肉表現(xiàn)為肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞膜完整無破裂，包漿染色均勻一致，細(xì)胞形體結(jié)構(gòu)完整，無變性、無炎性滲出及炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。肌纖維排列整齊，大小基本一致。未見充血、水腫(圖1A)。損傷后12 h可見肌細(xì)胞變性壞死，肌纖維溶解甚至斷裂，肌纖維間隙明顯增寬，大量炎性滲出，大量血細(xì)胞離開血管在肌纖維中(圖1B)。

2.3 超聲評(píng)價(jià)軟組織損傷

由圖2和圖3可知，造模后12 h，皮下組織回聲降低，厚度明顯增大，肌肉回聲降低；造模后1 d，皮下組織、肌肉腫脹減輕，但腫脹依然明顯，肌肉組織紋理不清晰；造模后3 d，皮下組織、肌肉腫脹減輕，肌肉回聲升高；造模后5 d和7 d，肌肉、皮下組織回聲有所升高；造模后15 d，皮下組織、肌肉略有腫脹，厚度無明顯變化。

2.4 皮下組織腫脹變化

皮下組織腫脹變化見表4，造模前、后12 h，組間差異不顯著(P>0.05)；損傷前期(1、3、5、7、15 d)，陰性對(duì)照組的皮下組織腫脹大于試驗(yàn)藥物組、陽性藥物組；損傷后期(21 d)，陰性對(duì)照組的腫脹不如試驗(yàn)藥物組和陽性藥物組。

2.5 肌肉回聲變化

肌肉超聲圖像見圖3，記肌肉灰度變化為x，即造模前肌肉灰度值減去造模后肌肉灰度值：x=對(duì)側(cè)肌肉灰度值-造模前肌肉灰度值。

灰度變化趨勢見表5。造模后2 h試驗(yàn)藥物組、陰性對(duì)照組及陽性藥物組差異不顯著(P>0.05)。造模后三組的肌肉灰度值均顯著下降，在3 d灰度值達(dá)到最低，直到21 d灰度值逐漸上升。造模后1、3、5、7 d試驗(yàn)藥物組、陽性藥物組和陰性對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，試驗(yàn)藥物組和陽性藥物差異不顯著(P>0.05)；造模后15 d，試驗(yàn)藥物組、陽性藥物組和陰性對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，試驗(yàn)藥物組和陽性藥物組比差異極顯著(P<0.01)；造模后21 d，三組組間差異不顯著(P>0.05)，且試驗(yàn)藥物組、陽性藥物組的灰度均大于造模前各自的灰度值，陰性藥物組的灰度值仍低于造模前的灰度值。

A.造模前肌肉；B.造模后12 h肌肉 A.Normal muscle before modeling；B. Muscle injury 12 h after modeling圖1 造模前后圖片F(xiàn)ig.1 Histological sections before and after modeling

A.造模后12 h; B.造模后1 d; C.造模后3 d; D.造模后15 d

A.12 h after modeling; B.1 d after modeling; C. 3 d after modeling;D.15 d after modeling

圖2不同時(shí)間段損傷部位超聲圖像

Fig.2 Ultrasound images of muscles at different periods of time

A.試驗(yàn)藥物組造模前; B.陽性藥物組造模前; C.陰性對(duì)照組造模前; D.試驗(yàn)藥物組造模后2 h; E.陽性藥物組造模后2 h; F.陰性對(duì)照組造模后2 h; G.試驗(yàn)藥物組造模后1 d; H.陽性藥物組造模后1 d; I.陰性對(duì)照組造模后1 d; J.試驗(yàn)藥物組造模后3 d; K.陽性藥物組造模后3 d; L.陰性對(duì)照組造模后3 d; M.試驗(yàn)藥物組造模后7 d; N.陽性藥物組造模后7 d; O.陰性對(duì)照組造模后7 d

A.Normal of test group before modeling; B.Normal of positive group before modeling; C.Normal of negative group before modeling; D.2 h of test group after modeling; E.2 h of positive group after modeling; F.2 h of negative group after modeling; G.1 d of test group after modeling; H.1 d of positive group after modeling; I.1 d of negative group after modeling; J.3 d of test group after modeling; K.3 d of positive group after modeling; L.3 d of negative group after modeling; M.7 d of test group after modeling; N.7 d of positive group after modeling; O.7 d of negative group after modeling

圖3試驗(yàn)各階段超聲圖像縱切面

Fig.3 Longitudinal sections of ultrasound images at different stages

續(xù)圖3

P.試驗(yàn)藥物組造模后15 d; Q.陽性藥物組造模后15 d; R.陰性對(duì)照組造模后15 d; S.試驗(yàn)藥物組造模后21 d; T.陽性藥物組造模后21 d; U.陰性對(duì)照組造模后21 d

P.15 d of test group after modeling; Q.15 d of positive group after modeling; R.15 d of negative group after modeling; S.21 d of test group after modeling; T.21 d of positive group after modeling; U.21 d of negative group after modeling

圖3 試驗(yàn)各階段超聲圖像縱切面

注：與陰性對(duì)照組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與陽性藥物組相比,#表示P<0.05,##表示P<0.01。

Note:* means the difference is significant at the 0.05 level; ** means the difference is significant at the 0.01 level compared to negative group; #means the difference is significant at the 0.05 level compared to positive group; ## means the difference is significant at the 0.01leval compared to positive group.

表5 肌肉灰度變化趨勢

注：與陰性對(duì)照組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與陽性藥物組相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01；@表示該灰度值高于造模前灰度值，未標(biāo)明的表示該灰度值小于造模前的灰度值。

Note：* means the difference is significant at the 0.05 level; ** means the difference is significant at the 0.01 level compared to negative group; # means the difference is significant at the 0.05 level compared to positive group; ## means the difference is significant at the 0.01 level compared to positive group; @means the muscle grey scale is higher than that before modeling.

2.6 紅外熱成像溫度的變化

結(jié)果見圖4和表6，試驗(yàn)初期，試驗(yàn)藥物組、陽性藥物組、陰性對(duì)照組的皮膚局部溫度均升高，陰性對(duì)照組的溫度變化顯著高于試驗(yàn)藥物組、陽性藥物組；損傷后期，陰性對(duì)照組、試驗(yàn)藥物組、陽性藥物組溫度均降低，陰性對(duì)照組局部溫度降低程度顯著高于試驗(yàn)藥物組和陽性藥物組。造模后1 d，試驗(yàn)藥物組、陽性藥物組與陰性對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)；造模后3 d，試驗(yàn)藥物組、陽性藥物組和陰性對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)，試驗(yàn)藥物組和陽性藥物組比較差異不顯著(P>0.05)；造模后5 d，試驗(yàn)藥物組、陽性藥物組和陰性對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，試驗(yàn)藥物組和陽性藥物組相比差異極顯著(P<0.01)；造模后7 d，試驗(yàn)藥物組、陽性藥物組相比陰性對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，試驗(yàn)藥物組和和陽性藥物組無顯著差異(P>0.05)；造模后16 d試驗(yàn)藥物組和陰性對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，陽性藥物組相比陰性對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，試驗(yàn)藥物組和陽性藥物組無顯著差異(P>0.05)。

2.7 局部腫脹觀察

正常組不造模，肉眼觀察試驗(yàn)藥物組、陽性藥物組、陰性對(duì)照組造模損傷部位腫脹情況(圖5和表7)，1 d時(shí)3個(gè)組局部均明顯腫脹，差異不顯著。造模后3 d，試驗(yàn)藥物組、陽性藥物組、陰性對(duì)照組消腫明顯，但是陰性對(duì)照組腫脹仍明顯；造模后5 d，試驗(yàn)藥物組、陽性藥物組為輕微腫脹，陰性對(duì)照組腫脹仍比各藥物組明顯。造模后7 d，試驗(yàn)藥物組、陽性藥物組、陰性對(duì)照組可見腫脹消失；造模后16 d，4組損傷部位恢復(fù)正常。

2.8 臨床觀察

造模后1 d馬匹受損部位肌肉出現(xiàn)明顯腫脹，局部溫度顯著高于其他部位，觸診躲閃，馬匹精神稍沉郁，運(yùn)動(dòng)出現(xiàn)跛行。造模后3 d馬匹精神狀況逐漸改善，局部位溫度還高于正常部位，局部腫脹稍緩解，跛行。造模后7 d馬匹精神狀況良好，局部溫度比正常部位偏高，跛行減輕；在造模后16 d，馬匹精神狀況良好，造模部位腫脹消失，局溫正常，跛行消失。

3 討論

3.1 模型的建立

構(gòu)建客觀合理的軟組織損傷模型是研究馬肢蹄軟組織損傷的重要基礎(chǔ)。損傷程度和該部位受到的應(yīng)力有關(guān)，通過傳感器反復(fù)測試，得出重物的最大應(yīng)力是78.84 N/cm2±15.22 N/cm2。制作急性軟組織損傷模型。急性軟組織損傷包括皮膚、肌肉挫傷。其病理形態(tài)與運(yùn)動(dòng)賽馬發(fā)生急性軟組織損傷病理學(xué)形態(tài)非常相似。急性軟組織損傷模型伴隨著紅、腫、熱、痛的特征，在超聲圖像上顯示皮下組織厚度增加。在紅外熱溫度上顯示局部溫度顯著升高。在肌細(xì)胞受損后引起CK、LDH、AST的釋放。CK主要存在于心肌、骨骼肌及腦組織，肌肉損傷數(shù)小時(shí)就能明顯升高，AST存在于組織細(xì)胞中，LDH以LDH-5的形式存在骨骼肌細(xì)胞的胞質(zhì)中，造模后模型組血清的CK值變化極顯著，LDH值變化顯著，AST值變化不如CK、LDH顯著，這和它在組織中的分布有關(guān)相符。CK、AST、LDH是肌肉損傷后血清中出現(xiàn)可參考指標(biāo)，表明馬軟組織損傷模型造模成功。

3.2 肌肉超聲回聲的變化

超聲圖像的變化可以反應(yīng)損傷的嚴(yán)重性和持續(xù)性。軟組織損傷因?yàn)檠[等原因表現(xiàn)低回聲液體聚集。低回聲液體在分析軟件中表現(xiàn)為灰度值降低。再生組織出現(xiàn)在損傷部位回聲強(qiáng)度增加，在圖像分析軟件表現(xiàn)為灰度值升高。超聲圖像可以顯示出相對(duì)應(yīng)的炎癥程度、液體含量、纖維化等病理變化過程。

組織的厚度變化和灰度值的變化可作為監(jiān)測肌肉損傷后恢復(fù)指標(biāo)。在急性損傷中，伴隨著皮下組織出血，超聲圖像上顯示皮下組織厚度增加。急性軟組織損傷有大量炎性滲出物，肌肉的超聲圖像呈現(xiàn)灰度值顯著下降。本試驗(yàn)的超聲灰度評(píng)測結(jié)果顯示，試驗(yàn)藥物組的肌肉灰度下降程度低于陰性對(duì)照組，這可能和試驗(yàn)藥物組在抑制炎性產(chǎn)物滲出，降低炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織的再生有關(guān)。試驗(yàn)藥物組的皮下組織消腫情況優(yōu)于陰性對(duì)照組，這可能和試驗(yàn)藥物組早期抑制炎癥反應(yīng)，減輕局部腫脹有關(guān)。

超聲診斷可以配合活檢技術(shù)，可確定損傷位置。超聲診斷對(duì)馬急性軟組織損傷可提供一種非介入性的、可靠的診斷方法,可為進(jìn)一步研究ZD制劑對(duì)皮下、肌肉組織的修復(fù)提供一定的理論依據(jù)。

3.3 紅外熱成像

紅外熱成像技術(shù)可以通過體表溫度的變化闡明局部血液循環(huán)的變化，局部受損充血，血流量增加伴隨溫度的增加，紅外熱成像儀采集體表溫度的變化，并以圖像形式直觀顯示。

由表6可以看出，試驗(yàn)藥物組和陽性藥物組在損傷后的7 d內(nèi)，與陰性對(duì)照組比較溫度明顯降低，這可能和試驗(yàn)藥物的抗炎作用有關(guān)。在損傷后16 d，試驗(yàn)藥物組和陽性藥物組的局部溫度高于陰性對(duì)照組，這可能和試驗(yàn)藥物在后期通過重建局部微循環(huán)，加速血流，提高局部溫度有關(guān)。分析紅外熱成像溫度，通過對(duì)損傷與健康兩側(cè)部位熱成像圖進(jìn)行比較。數(shù)據(jù)顯示，ZD制劑能夠在損傷早期降低局部溫度，后期提高損傷部位的溫度，這可能和炎癥急性期降低毛細(xì)血管通透性，抑制炎癥因子的釋放有關(guān)，在炎癥后期改善局部微循環(huán)，增加血流量和血流速度，進(jìn)行局部修復(fù)，最終達(dá)到治療效果。

A.試驗(yàn)藥物組造模8 h; B.陽性藥物組造模8 h; C.陰性對(duì)照組造模8 h; D.試驗(yàn)藥物組造模1 d; E.陽性藥物組造模1 d; F.陰性對(duì)照組造模1 d；G.試驗(yàn)藥物組造模3 d; H.陽性藥物組造模3 d; I.陰性對(duì)照組造模3 d; J.試驗(yàn)藥物組造模5 d; K.陽性藥物組造模5 d; L.陰性對(duì)照組造模5 d; M.試驗(yàn)藥物組造模7 d; N.陽性藥物組造模7 d; O.陰性對(duì)照組造模7 d; P.試驗(yàn)藥物組造模16 d; Q.陽性藥物組造模16 d; R.陰性對(duì)照組造模16 d

A.8 h after modeling of test group; B.8 h after modeling of positive group; C.8 h after modeling of negative group; D.1 d after modeling of test group; E.1 d after modeling of positive group; F.1 d after modeling of negative group；G.5 d after modeling of test group; H.3 d after modeling of positive group; I.3 d after modeling of negative group; J.5 d after modeling of test group; K.5 d after modeling of positive group; L.5 d after modeling of negative group; M.7 d after modeling of test group; N.7 d after modeling of positive group; O.7 d after modeling of negative group; P.16 d after modeling of test group; Q.16 d after modeling of positive group; R.16 d after modeling of negative group

圖4 損傷部位紅外熱成像圖像

注：與陰性對(duì)照組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與陽性藥物組相比#表示P<0.05,##表示P<0.01。

Note：* means the difference is significant at the 0.05 level;** means the difference is significant at the 0.01 level compared to negative group;# means the difference is significant at the 0.05 level,## means the difference is significant at the 0.01 level compared to positive group.

A.造模前試驗(yàn)藥物組; B.造模前陽性藥物組; C.造模前陰性對(duì)照組; D.試驗(yàn)藥物組造模2 h; E.陽性藥物組造模2 h; F.陰性對(duì)照組造模2 h

A.Test group before modeling; B.Positive group before modeling; C.Negative group before modeling; D. 2 h of test group after modeling; E. 2 h of positive group after modeling; F.2 h of negative group after modeling

圖5 損傷肌肉局部觀察

注：+表示腫脹程度，其中+越多，腫脹則越嚴(yán)重；-表示無明顯腫脹。

Note :+ means the degree of swelling, the more + added ,the more swelling degree;- means no obvious swelling.

臨床觀察表明ZD制劑對(duì)急性軟組織損傷有明顯治療效果。超聲結(jié)果顯示ZD制劑在急性軟組織損傷中對(duì)皮下組織腫脹的消除、肌肉灰度的恢復(fù)有良好的作用。紅外熱成像技術(shù)顯示ZD制劑可以在炎癥早期顯著降低損傷部位的溫度，在炎癥后期提高損傷部位的溫度，真正起到消腫止痛、去腐生肌、活血化瘀的作用，對(duì)軟組織損傷的修復(fù)效果良好。

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