丙酮丁醇梭菌復(fù)合誘變及發(fā)酵廢棄物原料產(chǎn)生物丁醇的研究

毛碧飛,袁麗霞 陳祥松 孫立潔 朱微微 吳金勇 劉偉偉

摘要[目的]通過(guò)廢棄資源的再利用研究可替代的新型生物燃料——丁醇的發(fā)酵培養(yǎng)基。[方法]對(duì)菌株Clostridium acetobutylicum CGMCC 1.0134進(jìn)行紫外誘變和磁場(chǎng)與Fe2+共同誘變，獲得1株丁醇產(chǎn)量高和穩(wěn)定性好的優(yōu)良突變株Clostridium acetobutylicum UM-80，采用不同的廢棄原料考察該突變菌株的發(fā)酵性能，并篩選出合適的性?xún)r(jià)比高的培養(yǎng)基。[結(jié)果]突變株UM-80發(fā)酵產(chǎn)丁醇和總?cè)軇ū?、丁醇、乙醇）分別為9.04、17.95 g/L，較原始菌株分別提高了5.12%、4.12%。單獨(dú)的蕨根是較好的丁醇發(fā)酵原料，當(dāng)蕨根醪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時(shí)發(fā)酵液中丁醇濃度最高為5.50 g/L。當(dāng)高山被孢霉與蕨根共同發(fā)酵時(shí)發(fā)酵液中丁醇最高產(chǎn)量為6.50 g/L。[結(jié)論]蕨根與高山被孢霉的復(fù)合培養(yǎng)基是較好的生物丁醇發(fā)酵培養(yǎng)基。

關(guān)鍵詞丙酮丁醇梭菌；復(fù)合誘變；廢棄物原料；丁醇

中圖分類(lèi)號(hào)S216文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）05-0001-03

Abstract[Objective] The aim was to study better fermentation medium for new type biofuel butanol through recycling waster resources.[Method] Clostridium acetobutylicum UM80， a mutant with high butanol yield and good stability， was obtained by ultraviolet mutagenesis and comutagenesis with Fe2+ by Clostridium acetobutylicum CGMCC 1.0134.Then the different fermentation materials were used to study the fermentation performance of the mutant strains， and the suitable medium with high cost performance was found out. [Result] The yield of butanol and total solvent （acetone， butanol， ethanol） were 9.04 and 17.95 g/L， respectively， which were 5.12% and 4.12% higher than those of the original strain. The fern root was the best raw material for the fermentation of butanol； when the mass fraction of fern root was 15%， the concentration of butanol in fermentation broth was 5.50 g/L. When the cofermentation of Mortierella alpina and fern root， the highest yield was 6.50 g/L.[Conclusion] The cofermentation of Mortierella alpina and fern root is better fermentation medium for butanol.

Key wordsClostridium acetobutylicum；Compound mutagenesis；Waste raw material；Butanol

基金項(xiàng)目合肥物質(zhì)科學(xué)技術(shù)中心方向項(xiàng)目培育基金（2014FXCX006）；安徽省淮南市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014A15）；中國(guó)科學(xué)院合肥分院等離子體物理研究所科學(xué)基金（DSJJ-15-YY02）。

作者簡(jiǎn)介毛碧飛（1991—），女，安徽銅陵人，碩士研究生，研究方向：微生物育種及發(fā)酵工藝。

通訊作者：袁麗霞，工程師，博士，從事生物質(zhì)能源與開(kāi)發(fā)利用研究；劉偉偉，副教授，博士，從事生物質(zhì)能源與開(kāi)發(fā)利用研究。

收稿日期2016-12-28

隨著化石燃料資源供給日益緊張以及人類(lèi)環(huán)境保護(hù)意識(shí)的不斷提高，生物質(zhì)成為全球優(yōu)先發(fā)展的戰(zhàn)略[1]。乙醇被認(rèn)為是一種可替代的燃料物質(zhì)。除乙醇之外，丁醇被認(rèn)為是另一種潛在的可替代的新型生物燃料，無(wú)論是燃燒值還是辛烷值，與汽油最為接近[2]。此外，丁醇還具備許多優(yōu)于生物乙醇的特點(diǎn)，如親水性弱、腐蝕性小、便于管道輸送，且能與汽油任意比混合，無(wú)需對(duì)汽車(chē)發(fā)動(dòng)機(jī)進(jìn)行改造，將是替代汽油最理想的生物燃料。

近年來(lái)，由于人口增長(zhǎng)、耕地減少、生物煉制行業(yè)迅速發(fā)展等因素的影響，糧食類(lèi)原料的價(jià)格不斷攀升，導(dǎo)致丁醇發(fā)酵的生產(chǎn)成本大幅提高[3]。研究者采用多種非糧作物或農(nóng)業(yè)廢棄物為原料進(jìn)行丁醇發(fā)酵，包括木薯、玉米秸稈等[4]。筆者采用紫外和磁場(chǎng)與Fe2+共同誘變的復(fù)合誘變選育丙酮丁醇高產(chǎn)突變株，并探討了使用蕨根、蘋(píng)果渣、餐廚廢棄物進(jìn)行發(fā)酵，同時(shí)在蕨根中添加高山被孢霉干菌體進(jìn)行了共同發(fā)酵，以期尋找較好的替代原料。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。菌株Clostridium acetobutylicum CGMCC 1.0134購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏中心。

1.1.2培養(yǎng)基。

PYG培養(yǎng)基：多胨5.0 g，胰胨5.0 g，酵母提取物10.0 g，葡萄糖10.0 g，鹽溶液40 mL（鹽溶液配方：CaCl2 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，K2HPO4 1.0 g，KH2PO4 10.0 g，NaHCO3 10.0 g，NaCl 2.0 g，蒸餾水1 L），蒸餾水960 mL，瓊脂5.0 g，pH 6.5～7.0，121 ℃滅菌20 min。

篩選培養(yǎng)基 Ⅰ：TYA培養(yǎng)基添加少量刃天青（氧化還原指示劑）。篩選培養(yǎng)基 Ⅱ：PYG培養(yǎng)基中的葡萄糖用可溶性淀粉替換，添加少量2-脫氧-D-葡萄糖[5]。

種子培養(yǎng)基：5%的玉米醪。發(fā)酵培養(yǎng)基：15%的玉米醪[6]。

1.2方法

1.2.1紫外誘變。

將培養(yǎng)48 h平板上的菌全部刮下，置于鋪滿(mǎn)玻璃珠的50 mL 0.9%生理鹽水中，得30 mL原始單孢子懸液。將單孢子懸液用0.9%生理鹽水或無(wú)菌水調(diào)整濃度為1.5×108個(gè)/mL。加3 mL單孢子懸液于直徑9 cm平皿中，開(kāi)蓋置于15 W紫外燈30 cm處照射，在暗室邊攪拌邊照射0、90、180、270、360 s，用黑布包裹，置于黑暗處至少2 h。誘變結(jié)束后，用無(wú)菌水稀釋孢子懸液至濃度為1×10-5、1×10-6、1×10-7個(gè)/mL，混合均勻，每個(gè)濃度菌懸液各涂3塊平板，37 ℃培養(yǎng)5 d，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)并計(jì)算致死率[6]。

1.2.2磁場(chǎng)誘變和Fe2+共同誘變。

將培養(yǎng)48 h平板上的菌全部刮下，置于鋪滿(mǎn)玻璃珠的50 mL 0.9%生理鹽水中，得30 mL原始單孢子懸液。將單孢子懸液用0.9%生理鹽水或無(wú)菌水調(diào)整濃度為1.5×108個(gè)/mL。單孢子菌懸液分別加入0.001%、0.010%、0.050%、0.100%、1.000%的Fe2+溶液，置于0.5 T磁場(chǎng)中37 ℃搖床培養(yǎng)進(jìn)行誘變。誘變結(jié)束后，用無(wú)菌水稀釋孢子懸液至濃度為1×10-5、1×10-6、1×10-7個(gè)/mL，每個(gè)濃度菌懸液各涂3塊平板，37 ℃培養(yǎng)5 d，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)并計(jì)算致死率。CK：菌懸液直接在37 ℃下厭氧培養(yǎng)3 d；CK1：菌懸液置于0.5 T磁場(chǎng)中3 h，然后置于37 ℃下厭氧培養(yǎng)3 d；CK2：向菌懸液分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0001%、0010%、0.050%、0.100%、1.000%的Fe2+溶液，再置于05 T磁場(chǎng)中3 h，然后置于37 ℃厭氧培養(yǎng)3 d。

1.2.3高產(chǎn)突變菌株的可視化篩選。

在篩選培養(yǎng)基 Ⅰ 上進(jìn)行初篩，將涂布后的平板倒置于厭氧培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)72 h，挑取生長(zhǎng)較好的單菌落繼續(xù)培養(yǎng)，進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.4遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)。

將篩選得到的高產(chǎn)丁醇菌接到種子培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)3 d作為F1代，然后連續(xù)繼代6次，得到F2、F3、F4、F5、F6、F7代，并且在繼代的同時(shí)將各代菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h，采用氣相色譜測(cè)定發(fā)酵液中丙酮、丁醇和乙醇含量，根據(jù)測(cè)定結(jié)果判斷其穩(wěn)定性。

1.2.5發(fā)酵液中溶劑及有機(jī)酸濃度測(cè)定方法。

采用氣相色譜測(cè)定。氣相色譜條件：色譜柱為安捷倫HP-INNOWAX，30 m×0.25 mm；檢測(cè)器為FID；N2為載氣，流速為35 mL/min，H2流速為30 mL/min，空氣流速為400 mL/min；初始柱溫為40 ℃，升至70 ℃，保留1 min，升至140 ℃，然后升至200 ℃；進(jìn)樣口溫度為160 ℃；檢測(cè)器溫度為220 ℃；進(jìn)樣量為0.4 μL，內(nèi)標(biāo)法定量[7]。

1.2.6發(fā)酵液殘?zhí)菧y(cè)定。

采用SBA-40D生物傳感分析儀測(cè)定葡萄糖濃度。

1.2.7生物量測(cè)定。

采用TCA反復(fù)凍溶法測(cè)定。

1.2.8致死率計(jì)算。

致死率=誘變前活菌數(shù)-誘變后活菌數(shù)〖〗誘變前活菌數(shù)×100%

2結(jié)果與分析

2.1誘變及突變株的篩選

2.1.1紫外誘變劑量的選擇。

由圖1可知，紫外照射時(shí)間增加，菌體的致死率也隨之升高。在初期致死率升高較快，但在60 s之后，隨著照射時(shí)間的增加菌體致死率變化幅度逐漸下降。60 s時(shí)，致死率已達(dá)85.0%；150 s時(shí)，致死率達(dá)976%。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，致死率在80.0%～90.0%的處理效果較佳，所以選擇致死率為85.0%時(shí)的60 s作為處理時(shí)間。

2.1.2磁場(chǎng)與Fe2+共同誘變的劑量選擇。

由圖2可知，單獨(dú)的Fe2+對(duì)菌體生長(zhǎng)有一定的抑制作用，但單獨(dú)的磁場(chǎng)對(duì)菌體無(wú)抑制作用。當(dāng)磁場(chǎng)和Fe2+共同作用菌體時(shí)，對(duì)菌體生長(zhǎng)有嚴(yán)重的抑制作用。由圖3可知，當(dāng)Fe2+濃度達(dá)0050%時(shí)，致死率在850%以上。因此，以濃度0050%作為Fe2+誘變劑量。

2.1.3可視化篩選。

刃天青是氧化還原指示劑，通過(guò)刃天青的變色情況可以得到菌產(chǎn)還原力的情況，當(dāng)菌產(chǎn)還原力強(qiáng)時(shí)刃天青呈無(wú)色，當(dāng)菌產(chǎn)還原力弱時(shí)呈紅色。因?yàn)楸〈妓缶谏a(chǎn)丁醇的代謝途徑中需要還原力的參與，所以當(dāng)菌產(chǎn)還原力的能力強(qiáng)時(shí)，可以間接判定菌的產(chǎn)丁醇能力強(qiáng)。同時(shí)刃天青培養(yǎng)基對(duì)菌株生長(zhǎng)有抑制作用，試驗(yàn)結(jié)果表明，050 g/L刃天青的添加量為其對(duì)菌株的最小抑制濃度，所以采用0.50 g/L刃天青對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行菌初篩。2-脫氧-D葡萄糖（DOG）是淀粉的分解代謝阻遏物，若菌能在有2-脫氧-D葡萄糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，說(shuō)明菌克服了分解代謝阻遏，過(guò)量表達(dá)淀粉酶。試驗(yàn)結(jié)果表明，2-脫氧-D葡萄糖010 g/L的添加量為其對(duì)菌株的最小抑制濃度，所以采用010 g/L 2-脫氧-D葡萄糖對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行菌初篩。

2.1.4高產(chǎn)丁醇突變株的選育及突變株UM-80遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)。

出發(fā)菌株紫外誘變后經(jīng)篩選培養(yǎng)基初篩和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩后，獲得1株性能優(yōu)良的突變株，命名為Clostridium acetobutylicum UM-80。在玉米醪發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵72 h，丁醇產(chǎn)量為9.04 g/L，總?cè)軇┊a(chǎn)量為17.95 g/L。丁醇和總?cè)軇┑漠a(chǎn)量較原始菌株分別提高了5.12%和4.12%。突變株UM-80經(jīng)6次傳代獲得的7代菌株（F1～F7）發(fā)酵特性無(wú)明顯變化，說(shuō)明該突變菌株遺傳穩(wěn)定性好，適合進(jìn)一步研究。

2.2高產(chǎn)突變株UM-80發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1種齡對(duì)發(fā)酵的影響。

由圖4可知，UM-80在24～42 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，54 h菌體濃度達(dá)到最高，但在60 h時(shí)菌的濃度迅速下降，有可能是菌受到溶劑毒害，裂解死亡。接種時(shí)，選取36 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌作為種液。

2.2.2蕨根醪初始濃度對(duì)發(fā)酵的影響。

調(diào)整蕨根醪初始濃度，其他成分不變，研究蕨根醪初始濃度對(duì)溶劑產(chǎn)量的影響。由圖5可知，當(dāng)蕨根醪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時(shí)，發(fā)酵液中丁醇濃度最高，為5.50 g/L；當(dāng)蕨根醪濃度低于15%時(shí)，發(fā)酵液丁醇產(chǎn)量較低，可以推測(cè)此時(shí)發(fā)酵液中碳源、氮源及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不充分，發(fā)酵溶劑產(chǎn)量不高；當(dāng)蕨根醪濃度大于15%時(shí)，丁醇產(chǎn)量開(kāi)始下降，此時(shí)很可能是蕨根醪黏稠度增大，影響發(fā)酵液傳質(zhì)過(guò)程。

2.2.3不同濃度高山被孢霉干菌體和蕨根醪對(duì)發(fā)酵的影響。

蕨根中含豐富的淀粉，但缺乏其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。高山被孢霉干菌體來(lái)自于中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院等離子體物理研究所實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵廢棄物，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、油脂、其他生長(zhǎng)因子等。該研究將高山被孢霉干菌

體添加到蕨根醪培養(yǎng)基中，考察其對(duì)發(fā)酵的影響。由圖6可知，當(dāng)高山被孢霉干菌體濃度為0.60 g/L時(shí)，發(fā)酵液中丁醇濃度為6.50 g/L。當(dāng)高山被孢霉干菌體的濃度在0～0.60 g/L時(shí)，發(fā)酵液中丁醇產(chǎn)量呈上升趨勢(shì)，可以發(fā)現(xiàn)高山被孢霉干菌體對(duì)于蕨根發(fā)酵丁醇的確有促進(jìn)作用。當(dāng)高山被孢霉干菌體的濃度高于0.60 g/L時(shí)，發(fā)酵液中丁醇濃度呈下降趨勢(shì)，推測(cè)可能是高山被孢霉中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如氮源類(lèi)濃度過(guò)高而無(wú)法被利用，并出現(xiàn)輕微抑制現(xiàn)象。

3結(jié)論

采用紫外線和磁場(chǎng)與Fe2+共同誘變的復(fù)合誘變丙酮丁醇梭菌，同時(shí)結(jié)合有效的篩選，選育出有良好遺傳穩(wěn)定性的高產(chǎn)突變株UM-88。使用玉米醪作為發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量分別為9.04和17.95 g/L。在使用不同濃度蕨根醪作為發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)蕨根醪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時(shí)，發(fā)酵液中丁醇濃度最高為5.50 g/L。當(dāng)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的蕨根醪中添加不同濃度高山被孢霉干菌體，高山被孢霉干菌體濃度為060 g/L時(shí)，發(fā)酵的最終丁醇產(chǎn)量最高為6.50 g/L。

由此可見(jiàn)，蕨根與高山被孢霉的復(fù)合培養(yǎng)基是很好的生物丁醇發(fā)酵培養(yǎng)基，且都是廢棄資源的再利用。

45卷5期毛碧飛等丙酮丁醇梭菌復(fù)合誘變及發(fā)酵廢棄物原料產(chǎn)生物丁醇的研究

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