新型燃料生物丁醇研究進展

汪江波，孔 博，蔡林洋，王 浩，張瑞景，蔡鳳嬌，徐 健

（湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心 發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068）

由于全球能源危機和化石燃料供應(yīng)有限，可再生能源受到越來越多的關(guān)注。生物燃料作為當(dāng)前研究最熱且最廣泛的新能源之一，是以生物質(zhì)作為載體，產(chǎn)生固、液、氣等綠色可持續(xù)發(fā)展的能源[1]。目前應(yīng)用最多的生物燃料是生物柴油和生物乙醇，生物丁醇與乙醇相比具有腐蝕性低、蒸汽壓力低、可以與汽油以任意比例混合等優(yōu)點[2]，因此受到了廣泛的關(guān)注。工業(yè)上生產(chǎn)丁醇主要采用化學(xué)合成和生物發(fā)酵兩種方法，化學(xué)合成法主要包括羰基合成法和醇醛縮合法，但是這些方法反應(yīng)條件復(fù)雜，對技術(shù)和設(shè)備要求較高。生物發(fā)酵法是以淀粉和糖質(zhì)等為原料，利用丁醇梭菌生產(chǎn)丁醇，與化學(xué)合成法相比具有眾多優(yōu)勢，包括投資小、技術(shù)設(shè)備要求低、發(fā)酵條件溫和等[3]。發(fā)酵法因其產(chǎn)物為丙酮（acetone）、丁醇（butanol）和乙醇（ethanol），所以又稱之為ABE發(fā)酵。ABE發(fā)酵分為產(chǎn)酸和產(chǎn)溶劑兩個階段：發(fā)酵初期，菌體迅速繁殖，并產(chǎn)生大量有機酸（乙酸、丁酸），使發(fā)酵液酸度迅速升高，同時伴隨生產(chǎn)CO2和H2兩種氣體；當(dāng)菌體繁殖到平穩(wěn)期，酸度達到一定值后（pH達到4.3～4.5），進入產(chǎn)溶劑期，此時有機酸被菌體還原，酸度開始降低，同時產(chǎn)生溶劑（丙酮、丁醇、乙醇）[4]。目前，發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇面臨的三個主要問題是（1）菌株對氧的耐受性低。用于ABE發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的菌株大多是厭氧菌，在發(fā)酵時要提供一個嚴(yán)格厭氧的環(huán)境，大大增加了試驗和操作成本，因此提高丁醇生產(chǎn)菌株的耐氧能力是降低丁醇生產(chǎn)成本的關(guān)鍵措施之一；（2）生產(chǎn)原料成本高。研究表明，丁醇發(fā)酵過程中原料成本占總成本的70%～80%[5]，廉價且易于利用的原料是丁醇發(fā)酵所需的；（3）丁醇的轉(zhuǎn)化率和濃度低。目前，從自然界中篩選得到的丁醇生產(chǎn)菌通過ABE發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的產(chǎn)量一般不超過20 g/L，轉(zhuǎn)化率低于0.3 g/g[6]。造成這種現(xiàn)象的原因是發(fā)酵生成的溶劑（尤其是丁醇）對丁醇生產(chǎn)菌有致命的毒害作用，造成丁醇轉(zhuǎn)化率和濃度較低，因此微生物對丁醇耐受性低是阻礙發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇的最大瓶頸之一。本文從丁醇生產(chǎn)菌對氧的耐受性、發(fā)酵原料的選擇、丁醇生產(chǎn)菌對溶劑的耐受性差導(dǎo)致的丁醇轉(zhuǎn)化率和濃度低以及丁醇的原位提取等方面綜述了生物丁醇生產(chǎn)的研究現(xiàn)狀，討論了ABE發(fā)酵存在的問題并提出改進策略，以期為丁醇生產(chǎn)菌株的定向改造及發(fā)酵過程控制優(yōu)化提供借鑒。ABE發(fā)酵代謝途徑如下：

①丙酮酸：鐵氧還蛋白氧化還原酶；②硫解酶；③β-羥丁酰CoA脫氫酶；④丁烯酰CoA水解酶；⑤丁酰CoA脫氫酶；⑥CoA轉(zhuǎn)移酶；⑦乙酸激酶；⑧輔酶A轉(zhuǎn)移酶。

1 丁醇生產(chǎn)菌對氧的耐受性

用于ABE發(fā)酵的梭菌大多屬于專性厭氧菌，氧對于這些細菌是有害甚至是致命的，當(dāng)有氧氣存在時，細胞內(nèi)容易產(chǎn)生性質(zhì)不穩(wěn)定的會破壞各種具有生物活性的大分子，對細胞造成致命的傷害[7]。最新研究表明，在產(chǎn)丁醇梭菌中存在一類調(diào)控蛋白稱為過氧化物還原機制調(diào)節(jié)抑制因子（peroxide repressor，PerR），在有氧環(huán)境下，它們可以抑制厭氧梭菌啟動自身的氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)來清除氧和活性氧，導(dǎo)致它們無法在有氧環(huán)境下生存[8]。利用關(guān)鍵基因過表達或基因敲除技術(shù)對產(chǎn)丁醇梭菌進行遺傳改造，可以提高菌株的耐氧能力以及丁醇產(chǎn)量。裴建新等[9]研究應(yīng)用Ⅱ組內(nèi)含子敲除技術(shù)敲除丙酮丁醇梭菌perR（超氧化物阻遏蛋白）基因，對突變菌株進行搖瓶發(fā)酵試驗，突變菌株提高了對分子氧的耐受能力，降低厭氧環(huán)境要求，在生產(chǎn)發(fā)酵過程中可降低成本。肖川[8]利用二型內(nèi)含子插入法成功敲除拜氏梭菌產(chǎn)溶劑退化菌株Clostridium beijerinckiDS中參與過氧化物還原機制調(diào)節(jié)的PerR抑制子基因Cbei_1336，獲得一株耐氧的兼性厭氧突變株，該突變株不但可以在有氧環(huán)境中生長良好，與出發(fā)菌株相比，丙酮和丁醇質(zhì)量濃度分別提高至4.7 g/L和10.01 g/L。

2 生物丁醇發(fā)酵原料

2.1 淀粉質(zhì)原料

富含淀粉的物質(zhì)是生產(chǎn)生物燃料的第一代原料，如玉米、木薯等（表1）。將這些原料經(jīng)預(yù)處理得到富含還原糖的水解液，然后經(jīng)ABE發(fā)酵、發(fā)酵液精餾后得到正丁醇[10]。宋鋼等[11]利用木薯粉發(fā)酵生產(chǎn)丁醇，結(jié)果表明最佳培養(yǎng)基為木薯粉120 g/L，乙酸銨6 g/L，此時5 L發(fā)酵罐中丁醇產(chǎn)量達到13.5 g/L，總?cè)軇┻_到22.8 g/L。雖然富含淀粉的物質(zhì)是丁醇發(fā)酵的良好底物，但生物燃料生產(chǎn)對這些底物需求的增加也提高了這些原料的價格，因此需要尋找廉價且適宜的原料用于丁醇的生產(chǎn)。

表1 不同菌株和底物的丁醇發(fā)酵情況Table1 Butanol fermentation of different strains and substrates

2.2 木質(zhì)纖維素

木質(zhì)纖維素是生產(chǎn)生物燃料的第二代原料，是典型的高效發(fā)酵基質(zhì)的良好替代品。但是，從這些木質(zhì)纖維素材料中獲得可發(fā)酵性糖是非常困難的，木質(zhì)纖維素在用作發(fā)酵底物之前，需要經(jīng)過物理、化學(xué)或生物預(yù)處理，同時會產(chǎn)生弱酸類、呋喃類和酚類化合物等對微生物有毒害作用的副產(chǎn)物[12]。MAGALHAES B L等[13]從甘蔗秸稈水解液中篩選出產(chǎn)丁醇的梭狀芽孢桿菌，通過優(yōu)化培養(yǎng)基提高了該菌對木質(zhì)纖維素水解物的耐受性，避免在水解物中過早的停止發(fā)酵，并使菌株能在79%的純木質(zhì)纖維素水解物中培養(yǎng)，最終總?cè)軇┊a(chǎn)量達到10.22 g/L。目前阻礙大規(guī)模利用木質(zhì)纖維素作為生物丁醇發(fā)酵基質(zhì)的直接因素是預(yù)處理過程成本過高，因此迫切需要開發(fā)從木質(zhì)纖維素生物質(zhì)中獲得可發(fā)酵糖的有效技術(shù)，以獲得比玉米等易水解原料更低的成本優(yōu)勢。

2.3 微藻和甘油

微藻是生產(chǎn)生物燃料的第三代原料，利用微藻生產(chǎn)生物丁醇，具有廣闊的前景[13]。微藻含有的碳水化合物主要是以淀粉的形式存在的，經(jīng)過簡單的酸處理或者堿處理就可以獲得大量的還原糖。微藻中含有較少半纖維素和木質(zhì)素，這可以降低預(yù)處理成本。纖維素原料預(yù)處理時，會釋放出一系列的有害物質(zhì)，干擾發(fā)酵過程，而微藻生物質(zhì)酸水解產(chǎn)物只含有微量的糠醛和5-羥甲基糠醛（0.5 g/L）。研究表明，丁醇發(fā)酵的菌株可以耐受1 g/L糠醛和2 g/L 5-羥甲基糠醛，因此微藻水解液不會對丁醇發(fā)酵產(chǎn)生影響，是發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的理想原料[14]。微藻預(yù)處理技術(shù)主要有四種，包括熱處理、機械處理、化學(xué)和生物（酶法）方法。WANG Y等[15]以小球藻（Chlorella vulgaris）JSC-6作為原料，利用C.acetobutylicumATCC824生產(chǎn)丁醇，先經(jīng)過1%NaOH處理再經(jīng)過3%硫酸處理得到小球藻的水解液，經(jīng)分批培養(yǎng)后得到13.1 g/L的丁醇。

甘油是一種重要的可再生碳源，在工業(yè)生產(chǎn)中被廣泛用作發(fā)酵的底物。以甘油為唯一碳源進行發(fā)酵的第一個溶劑生產(chǎn)菌是巴氏梭菌，甘油通過磷酸化和氧化兩種途徑，部分轉(zhuǎn)化為可用于糖酵解途徑的二羥基丙酮磷酸鹽（dihydroxyacetone phosphate，DHAP）[10]。粗甘油用于生產(chǎn)丁醇的主要問題是雜質(zhì)的抑制作用，在酯交換后，甘油通常含有不同濃度的甲醇（生物柴油甲基化過程的殘留物）、硫酸鹽或氯鹽、游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）、脂肪酸甲酯（fatty acid methyl ester，F(xiàn)AME）和肥皂（作為氫氧化物酯交換催化劑和FFA的副產(chǎn)品）。解決這種抑制作用的方式有兩種，第一種是通過粗甘油的純化來消除這種抑制作用，但是會增加成本；另一種方式是獲得對粗甘油有適應(yīng)能力的菌株，但是該菌株只適應(yīng)于一種特定類型的粗甘油，對于含有其他雜質(zhì)的粗甘油也可能有毒性。因此，可以選擇固定化微生物及其凝膠基質(zhì)的保護，消除粗甘油的毒性作用[16]。VLADIMIR K等[17]研究以甘油為原料，利用巴氏梭菌生產(chǎn)丁醇，采用固定化細胞重復(fù)分批發(fā)酵并與自由細胞發(fā)酵對比，結(jié)果表明采用聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）顆粒固定化細胞發(fā)酵明顯縮短了發(fā)酵時間，丁醇產(chǎn)率提高了6.3倍。

3.4 食品廢棄物

目前，從食品廢棄物中生產(chǎn)丁醇受到了廣泛的關(guān)注。與昂貴的淀粉質(zhì)原料相比，利用食品廢棄物生產(chǎn)丁醇，不僅能解決環(huán)境問題，也為丁醇生產(chǎn)提供了廉價的原材料。SIREN L G等[18]以西米果仁渣為原料，經(jīng)酶解后通過丙酮丁醇梭菌進行ABE發(fā)酵，研究發(fā)現(xiàn)將西米果仁渣水解物增至50 g/L時，加入0.5 g/L酵母菌抽提物，ABE產(chǎn)量為8.84 g/L。王永林等[19]利用糖乙酸丁酸梭菌N1-4，將餐廚垃圾直接發(fā)酵生產(chǎn)丁醇，在固液比1∶1（g∶mL）的條件下，餐廚垃圾直接發(fā)酵丁醇產(chǎn)量達到12.1 g/L，證明了餐廚垃圾發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的可行性。QIU Z D等[20]分離出一種可以自主分泌淀粉酶并生產(chǎn)丁醇的梭狀芽孢桿菌（Closridiumsp.）HN4，在食品廢棄物中添加碳酸鈣和吐溫80可以顯著提高菌株的淀粉酶表達能力，在進行分批發(fā)酵和原位提取后丁醇產(chǎn)量達到35.63 g/L。

3 丁醇轉(zhuǎn)化率和濃度

ABE發(fā)酵生產(chǎn)丙酮、丁醇、乙醇等有機溶劑，其中丁醇對細胞傷害最大，由于丁醇生產(chǎn)菌對丁醇的耐受性差導(dǎo)致丁醇轉(zhuǎn)化率和濃度低。有機溶劑對大多數(shù)微生物都具有毒害作用，它們會在細胞膜中積累并破壞其結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細胞內(nèi)的離子和代謝物丟失，pH和膜電位發(fā)生改變，最終導(dǎo)致細胞死亡[30]。但在一些情況下，微生物也可以通過自身的抗性機制在有機溶劑中存活，例如細菌可以通過細胞膜修飾來降低溶劑的滲透性；溶劑進入細胞會引發(fā)應(yīng)激反應(yīng)，其中涉及許多分子伴侶，一些微生物還可以通過降解化合物產(chǎn)生能量來對抗溶劑的毒性，外排泵也對細胞中去除有機溶劑起關(guān)鍵作用[31]。丁醇生產(chǎn)菌對丁醇的耐受機制如圖1所示。（1）細胞膜：在亞致死濃度下（通常為5～15 g/L），丁醇引發(fā)復(fù)雜的應(yīng)激反應(yīng)，包括膜流動性的增加、膜脂中飽和/不飽和脂肪酸比例發(fā)生變化；當(dāng)丁醇質(zhì)量濃度＞15 g/L時會導(dǎo)致膜功能受損，三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）泄露和pH梯度被破壞，最終導(dǎo)致細胞死亡[32]。因此可以通過改變膜的生理特性或轉(zhuǎn)運系統(tǒng)來抵御丁醇脅迫，例如增加外膜的脂多糖含量使細胞表面疏水性降低，阻礙有毒疏水化合物進入胞質(zhì)等。（2）外排泵：天然的外排系統(tǒng)不能結(jié)合丁醇使之排出胞外，而定位于細胞質(zhì)膜上的轉(zhuǎn)運蛋白耐藥結(jié)節(jié)細胞分化（resistance-nodulation-cell division，RND）外排泵能將胞內(nèi)有毒化合物泵出胞外。FISHER M A等[33]的研究結(jié)果表明，改變RND家族的外排泵的AcrB蛋白中的一個氨基酸時，能夠有效地排出丁醇，證明定向進化改變外排泵底物特異性，是有效的排出丁醇的一種方法。（3）應(yīng)激蛋白過表達：丁醇生產(chǎn)菌所產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)在許多方面與熱休克所產(chǎn)生的應(yīng)激相似，因此它也可能與各種熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）的產(chǎn)生有關(guān)，這些熱休克蛋白參與蛋白質(zhì)折疊、運輸、修復(fù)受損或錯誤折疊的蛋白質(zhì)的過程，并且具有分子伴侶的活性。研究發(fā)現(xiàn)GroESL伴侶體系過表達，丁醇耐受性和產(chǎn)量提高，并可由丙酮丁醇梭菌（C.acetobutylicum）ATCC 824中調(diào)控的6S RNA過表達觸發(fā)。過表達HSPs、GrpE和HtpG也可顯著提高C.acetobutylicumATCC 824的丁醇耐受性[32]。（4）其他調(diào)控機制：有研究表明添加微量鋅離子一方面增強菌體對數(shù)生長、碳源利用、有機酸重吸收及溶劑代謝，提高丁醇產(chǎn)率；另一方面增強菌體對甲酸、乙酸、丁酸及丁醇的脅迫耐受性，有效緩解代謝遲滯，丁醇耐受水平得到提高[34]。

圖1 丁醇生產(chǎn)菌對丁醇的主要耐受機制Fig.1 Main tolerance mechanism of butanol-producing strain to butanol

目前提高菌株對于丁醇的耐受性主要有三種方式：（1）物理或化學(xué)誘變；（2）基因改造；（3）人工馴化。LI H G等[35]通過分離和連續(xù)富集的方法獲得一株耐丁醇突變株SE36，與野生菌株相比突變株對丁醇的耐受能力從20 g/L提高到35 g/L，經(jīng)發(fā)酵后的丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量分別比野生菌提高了24.3%和23.6%。SHU B L等[36]為獲得耐溶劑性和產(chǎn)丁醇能力較強的菌株，采用亞硝基胍誘導(dǎo)與基因組重排相結(jié)合的誘變方法，在連續(xù)四輪基因組重組之后，重組菌株C.acetobutylicumGS4-3表現(xiàn)出較強發(fā)酵性能，優(yōu)化后丁醇產(chǎn)量為20.1 g/L，丁醇產(chǎn)率為0.35 g/（L·h），分別比野生型菌株GX01增加了23.3%和40.0%。

4 丁醇分離提取技術(shù)

4.1 吸附

吸附是通過將丁醇吸附到合適的表面吸附劑上，然后增加溫度或使用置換劑濃縮丁醇溶液，從而選擇性地從發(fā)酵液中分離丁醇的方法。在選擇合適的吸附劑時，需要考慮許多因素：吸附速率、吸附容量、易降解性，對所需產(chǎn)品的選擇性和成本等[37-38]，目前常用的吸附材料主要有活性炭、聚合樹脂、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）等。XUE C等[39]研究了各種吸附劑對丁醇的吸附性能，發(fā)現(xiàn)活性炭對于丁醇的吸附效果最佳，通過活性炭原位吸附和補料分批發(fā)酵得54.6 g/L丁醇，與沒加吸附劑的對比，產(chǎn)量增加了230%。吸附法能耗低、操作簡單，但對丁醇吸附容量較低，仍需要進一步通過其他方法濃縮丁醇。

4.2 液液萃取

液液萃取法（liquid-liquid extraction，LLE）是通過選擇對微生物毒性較低的水不溶性萃取劑，并與發(fā)酵液混合，選擇性的提取丁醇的方法。在選擇萃取劑時要考慮三個因素：萃取劑對每個產(chǎn)品（尤其是丁醇）的分配系數(shù)、選擇性和毒性[40]。研究發(fā)現(xiàn)，越是對丁醇有較高的分配系數(shù)的液體萃取劑對細胞的毒性就越大。因此，影響液液萃取法對丁醇進行萃取分離的一個關(guān)鍵因素是萃取劑的毒性。潘賀鵬等[41]研究利用小麥淀粉廢水生產(chǎn)生物丁醇，通過考察丁醇發(fā)酵的影響因素，得出最佳培養(yǎng)基條件，在7 L發(fā)酵罐中結(jié)合生物柴油進行萃取發(fā)酵，總?cè)軇┖投〈籍a(chǎn)量分別達到29.38 g/L和15.13 g/L，相比萃取之前分別提高了27%和12%。液液萃取可以直接從發(fā)酵液中提取丁醇，而不需要移除底物、水或者營養(yǎng)物質(zhì)。但是在使用過程中也會出現(xiàn)一些問題，例如：萃取劑的毒性、乳狀液的形成、萃取過程中生物質(zhì)的積累等，因此液液萃取法的工業(yè)化應(yīng)用目前仍受到一定限制。

4.3 滲透汽化

滲透汽化是利用膜對液體混合物中各組分的溶解與擴散速度的不同而實現(xiàn)分離的過程。所用膜主要包括高聚物膜、陶瓷膜和液體膜等。其中，聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）膜由于其超疏水性以及良好的熱穩(wěn)定性和機械穩(wěn)定性而被廣泛研究。WU H等[42]采用PDMS-陶瓷復(fù)合膜在丁醇分批發(fā)酵過程中進行原位提取，丁醇產(chǎn)量提高33%。滲透汽化作為一種新型膜分離技術(shù)具有選擇性高、能耗低、產(chǎn)品純度高等優(yōu)勢，但是其分離性能很大程度上是取決于膜的性質(zhì)，由于生物分子、介質(zhì)成分和細胞引起的膜污染會導(dǎo)致滲透汽化性能下降[56]，一定程度上限制了其工業(yè)化應(yīng)用，高性能膜的制備和發(fā)現(xiàn)還需要更多的研究。

4.4 氣提

氣提法是通過向發(fā)酵液中通入無氧氮或發(fā)酵氣體（H2和CO2），從而脫去丙酮、丁醇和乙醇的方法[37]。CAI D等[43]以甜高粱汁為原料，采用連續(xù)氣提補料分批發(fā)酵，最終獲得丁醇質(zhì)量濃度達到112.9 g/L。EZEJI T C等[44]利用拜氏梭菌BA101進行間歇式發(fā)酵與氣提相結(jié)合的方法生產(chǎn)丁醇，經(jīng)發(fā)酵后丁醇產(chǎn)量達到151.7 g/L。氣提法操作簡單、適用范圍廣、設(shè)備能耗低、與發(fā)酵耦合可以實現(xiàn)在線同時分離，但是處理效率會受到載氣回收速率、氣泡大小和消泡劑等眾多影響，因此有待進一步研究。

4.5 混合提取

吸附、氣提、液液萃取以及滲透汽化等方法都能在一定程度上回收丁醇，但是由于ABE發(fā)酵中丁醇質(zhì)量濃度通常小于20 mg/L，這些分離技術(shù)對丁醇的純化沒有足夠的選擇性。因此，根據(jù)現(xiàn)有的資料，從技術(shù)和經(jīng)濟的角度來看，需要進行更多的研究來開發(fā)一種綜合工藝，使用一種或多種不同的提取方式的組合，從發(fā)酵液中分離丁醇。LU K M等[45]采用新型的原位萃取-氣體汽提工藝結(jié)合ABE發(fā)酵，在發(fā)酵過程中首先用油醇提取丁醇，同時在油醇相中對丁醇進行氣提，最終的得到丁醇質(zhì)量濃度為93～113 g/L。CAI D等[46]為提高丁醇質(zhì)量濃度，降低產(chǎn)品分離成本，建立了氣提-滲透蒸發(fā)（gas stripping-pervaporation，GS-PV）一體化工藝，將間歇滲透汽化技術(shù)與補料分批ABE發(fā)酵氣提系統(tǒng)相結(jié)合，獲得丁醇質(zhì)量濃度為482.55 g/L，丁醇回收率達到98.8%。

表2 不同分離提取方法的丁醇發(fā)酵情況Table 2 Butanol fermentation with different separation and extraction methods

5 展望

丁醇作為一種燃料具有廣闊的發(fā)展前景，它可以成為替代汽油的可再生能源。丁醇發(fā)酵存在原料成本高、菌株對氧以及溶劑的耐受性差導(dǎo)致的丁醇轉(zhuǎn)化率和濃度低等缺點，使得丁醇發(fā)酵的競爭力低于其他生物燃料的生產(chǎn)。但是這些障礙正在通過以下方式得到改善：（1）通過篩選出耐氧能力強的菌株，或者通過過表達、敲除/下調(diào)以及在代謝途徑中插入編碼關(guān)鍵酶的基因等方法來提高產(chǎn)丁醇菌的耐氧性和丁醇產(chǎn)量；（2）尋找廉價且易于水解的原料作為丁醇發(fā)酵底物，或是利用廢棄物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇（3）利用基因工程和代謝工程技術(shù)，解除代謝過程中可能存在的產(chǎn)物或者中間產(chǎn)物抑制，提高菌種對丁醇的耐受性，強化丁醇生產(chǎn)中的關(guān)鍵酶，弱化丙酮、乙醇的生成代謝途徑，提高丁醇在溶劑中比例；（4）采用混合提取的策略，彌補單一提取方法的不足，消除發(fā)酵過程中丁醇的抑制作用，提高丁醇的回收率。