生物丁醇代謝工程的研究進(jìn)展

戴宗杰，董紅軍，朱 巖，張延平，李 寅

(1.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230026;2.中國科學(xué)院 微生物研究所，北京 100101)

化石能源的不斷減少及環(huán)境問題的日益加重，迫使人們尋找可持續(xù)的方法來維持世界的發(fā)展。利用可再生資源生產(chǎn)石油基化學(xué)品是一種重要的可持續(xù)發(fā)展途徑。丁醇作為一種大宗化學(xué)品，既是生產(chǎn)許多化合物的重要原料，也是一種潛在的動(dòng)力燃料或者燃料添加劑。相對(duì)于燃料乙醇，丁醇具有更高的能量密度，更強(qiáng)的疏水性，同時(shí)不具有腐蝕性，可以延長運(yùn)輸管道的使用壽命，可以直接使用而無需改造現(xiàn)有的動(dòng)力引擎［1］。所以近年來，利用生物法生產(chǎn)丁醇受到人們的普遍關(guān)注。

ABE(acetone-butanol-ethanol)發(fā)酵是生物法生產(chǎn)丁醇的最主要方法，這一方法已經(jīng)有近百年的歷史。工業(yè)上用來生產(chǎn)丁醇的菌株主要有丙酮丁醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum)、拜 氏 梭 菌 (C.beijerinckii、C. saccharoperbutylacetonicum 和 C.saccharobutylicum)等菌株，其中對(duì)丙酮丁醇梭菌的研究最為深入。1992年，Mermelstein等［2］第一次實(shí)現(xiàn)了對(duì)丙酮丁醇梭菌ATCC 824的遺傳改造。2001年，丙酮丁醇梭菌基因組測序完成［3］。此后，通過代謝工程改造丙酮丁醇梭菌生產(chǎn)丁醇取得了巨大的進(jìn)步。

然而，與其他模式菌株相比，丙酮丁醇梭菌缺乏高效的遺傳改造工具。同時(shí)，作為革蘭氏陽性厭氧菌，丙酮丁醇梭菌的遺傳操作更加復(fù)雜。近年來，許多研究組在其他模式菌株中成功構(gòu)建了來源于丙酮丁醇梭菌的丁醇生產(chǎn)途徑［4－9］，一些新的丁醇生物合成途徑也被設(shè)計(jì)出來［10－11］。筆者對(duì)代謝工程改造丙酮丁醇梭菌和其他模式微生物生產(chǎn)丁醇進(jìn)行總結(jié)，比較了不同微生物生產(chǎn)丁醇的問題，并展望了生物丁醇的未來發(fā)展方向。

1 利用丙酮丁醇梭菌生產(chǎn)丁醇

丙酮丁醇梭菌是生產(chǎn)丁醇的天然菌株，其丁醇代謝途徑已經(jīng)得到了充分解析，如圖1所示。通過糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸，在丙酮酸鐵氧化還原蛋白的作用下生成CO2和乙酰輔酶A。2個(gè)乙酰輔酶A分子通過硫解酶聚合形成乙酰乙酰輔酶A，乙酰乙酰輔酶A經(jīng)過還原、脫水、再還原三步催化之后生成丁酰輔酶A，然后在醇脫氫酶的作用下產(chǎn)生丁醇。這一丁醇生產(chǎn)途徑稱為梭菌丁醇途徑。丙酮丁醇梭菌在產(chǎn)生丁醇的過程中也會(huì)產(chǎn)生一些副產(chǎn)物，主要包括乙酸、丁酸、乙醇和丙酮，并且會(huì)釋放出H2以及CO2。

圖1 經(jīng)典的丙酮丁醇梭菌代謝途徑Fig.1 Classical metabolic pathway of Clostridium acetobutylicum

隨著丙酮丁醇梭菌遺傳改造工具的發(fā)展，特別是II型內(nèi)含子技術(shù)在丙酮丁醇梭菌中的成功應(yīng)用，使得快速定向改造代謝支路成為可能。pta基因和ack基因是生產(chǎn)乙酸的2個(gè)必須基因，其中Pta蛋白將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為乙酰磷酸，然后通過乙酸激酶(Ack)產(chǎn)生乙酸。Lehmann等［12］的工作顯示，pta 基因突變體的丁醇生產(chǎn)能力沒有明顯變化;而另外一個(gè)研究組用II型內(nèi)含子的方法插入失活了pta基因，pta基因突變體的丁醇生產(chǎn)能力卻提高了46%［13］。ack基因突變體的丁醇產(chǎn)量提高了16%，乙醇產(chǎn)量則提高了63%［14］;另外一項(xiàng)研究也顯示了類似的結(jié)果［15］。

從丁酰輔酶A到丁酸也需要2個(gè)酶的催化，分別是ptb基因編碼的丁酰磷酸轉(zhuǎn)移酶和buk基因編碼的丁酸激酶。ptb基因突變體的乙醇產(chǎn)量達(dá)到12 g/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生型菌株，而丁醇的產(chǎn)量下降到了8 g/L［16］。但是 Jang 等［13］的工作顯示，ptb 基因突變體的乙醇產(chǎn)量只有0.9 g/L，而丁醇的最終質(zhì)量濃度為13.9 g/L。這種差異的原因還不清楚，可能是由于基因插入失活的位點(diǎn)不同，導(dǎo)致蛋白酶活有差異;另外發(fā)酵條件的區(qū)別也可能是原因之一。生成丁酸的第二個(gè)酶丁酸激酶也有類似的研究。當(dāng)該酶基因被插入失活后，丁醇的產(chǎn)量達(dá)到15.2 g/L，比對(duì)照菌株的產(chǎn)量提高了29%［13］。

丙酮丁醇梭菌的另外一個(gè)代謝支路是產(chǎn)生丙酮，該支路包括2個(gè)酶:?；D(zhuǎn)移酶和乙酰乙酸脫羧酶，分別由ctfAB基因和adc基因編碼。其中ctfA基因突變體喪失了丙酮生成能力，其丁醇和乙醇的生成能力相比對(duì)照菌株也下降很多;而adc基因突變體依然可以產(chǎn)生少量的丙酮，產(chǎn)醇表現(xiàn)則類似于ctfA基因突變體［12］。這一結(jié)果和另外2個(gè)研究結(jié)果類似［15，17］。ctfB 基因突變體的代謝表型類似于ctfA基因突變體［13］。之所以產(chǎn)丙酮途徑被敲除后產(chǎn)醇量降低，是因?yàn)楸赏緩胶退嵛帐邱盥?lián)的，而酸吸收又與產(chǎn)醇相關(guān)聯(lián)。

當(dāng)丙酮生成途徑被阻遏后，酸吸收能力減弱，產(chǎn)醇能力相應(yīng)被削弱。Jang等［13］將通過酸吸收產(chǎn)醇的途徑稱為冷通道(cold channel)，將乙酰輔酶A到丁酰輔酶A然后生成丁醇的途徑稱為熱通道(hot channel)。將酸產(chǎn)生途徑中的pta基因和buk基因進(jìn)行了雙敲除，增強(qiáng)熱通道的代謝流，同時(shí)表達(dá)醇脫氫酶 adhE1的突變體，該突變體對(duì) NADH和NADPH都有很好的親和力，從而增強(qiáng)了對(duì)熱通道的驅(qū)動(dòng)力。該研究中丁醇的產(chǎn)量提高到了18.9 g/L，對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到31.2%。相對(duì)于野生型菌株，這2個(gè)指標(biāo)分別提高了160%和245%。這也是迄今為止通過代謝工程手段獲得的丁醇產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率最高的丙酮丁醇梭菌突變體。

2 利用大腸桿菌生產(chǎn)丁醇

大腸桿菌作為一種典型的模式菌株，其遺傳背景、遺傳改造工具和遺傳改造過程相比于丙酮丁醇梭菌都更加清晰、更加豐富、更加容易。近些年來，利用大腸桿菌生產(chǎn)丁醇取得了巨大的進(jìn)步。不僅丁醇產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率達(dá)到了丙酮丁醇梭菌的水平，而且在代謝途徑優(yōu)化和設(shè)計(jì)方面也獲得許多成功，為微生物生產(chǎn)丁醇提供了新的方向。以下從3種丁醇生成途徑詳細(xì)介紹利用大腸桿菌生產(chǎn)丁醇的最新進(jìn)展，大腸桿菌中優(yōu)化的梭菌產(chǎn)丁醇途徑如圖2所示。

2.1 優(yōu)化的梭菌途徑

圖2 大腸桿菌中優(yōu)化的梭菌產(chǎn)丁醇途徑Fig.2 Optimized clostridial butanol production pathway in E.coli

James Liao研究組首先實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中生產(chǎn)丁醇。丙酮丁醇梭菌產(chǎn)丁醇途徑中的hbd、crt、bcd、etfAB和adhE2基因在大腸桿菌中被成功表達(dá)，同時(shí)表達(dá)大腸桿菌自身的硫解酶基因atoB，打通了丁醇生物合成通道。進(jìn)一步敲除了大腸桿菌內(nèi)部的一些競爭途徑的基因，包括:adhE、ldhA、frdBC、fnr、pta。該重組菌株在 M9培養(yǎng)基中產(chǎn)生了113 mg/L的丁醇，在豐富培養(yǎng)基TB同時(shí)添加甘油的條件下，該菌株可以生成552 mg/L的丁醇［4］。

為了進(jìn)一步提高丁醇產(chǎn)量，催化糠醛輔酶A到丁酰輔酶A的Bcd/EtfAB蛋白復(fù)合體被替換為來自齒垢密螺旋體(Treponema denticola)的Ter，因?yàn)榍罢叩拇呋磻?yīng)是可逆的，而后者不可逆，從而可以增強(qiáng)丁醇代謝流。同時(shí)表達(dá)了大腸桿菌自身的硫解酶基因phaA和丙酮酸脫氫酶復(fù)合體aceEF-lpd操縱子，在沒有對(duì)宿主菌自身進(jìn)行改造的情況下，大腸桿菌的丁醇產(chǎn)量達(dá)到了4.65 g/L［18］。這與丙酮丁醇梭菌野生型丁醇產(chǎn)量13 g/L相比仍有較大差距。

在進(jìn)一步的工作中，James Liao研究組將增強(qiáng)NADH和乙酰輔酶A的供給作為兩個(gè)驅(qū)動(dòng)力引入大腸桿菌，以增強(qiáng)丁醇代謝流。他們在大腸桿菌中表達(dá)甲酸脫氫酶，催化丙酮酸甲酸裂解酶生成甲酸的同時(shí)，形成還原力NADH，并敲除菌體自身消耗還原力的途徑:琥珀酸生成途徑、乳酸生成途徑和乙醇生成途徑(ΔadhE、ΔldhA、ΔfrdBC)。菌體為了保持氧化還原的平衡，必須通過產(chǎn)生丁醇來消耗過多的NADH。他們還敲除了大腸桿菌自身的pta基因，增加乙酰輔酶A的供給。另外，他們還將Bcd/EtfAB蛋白復(fù)合體替換為Ter蛋白，以進(jìn)一步增強(qiáng)丁醇代謝流。該重組突變體在豐富培養(yǎng)基TB同時(shí)添加甘油的條件下，丁醇產(chǎn)量達(dá)到15 g/L［19］。

2.2 脂肪酸β氧化反轉(zhuǎn)途徑

脂肪酸β氧化反轉(zhuǎn)途徑類似于梭菌途徑，該途徑是將脂肪酸β氧化途徑逆轉(zhuǎn)，將途徑中的丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丁醇。但是在正常代謝過程中，脂肪酸β氧化途徑是用來降解長鏈脂肪酸的，而該途徑需要在脂肪酸作為C源的情況下才能被激活。為了利用非脂肪酸C源(例如葡萄糖)通過該途徑生產(chǎn)丁醇，必須對(duì)大腸桿菌C源代謝、脂肪酸代謝相關(guān)的調(diào)節(jié)基因以及脂肪酸β氧化途徑的代謝基因進(jìn)行改造(圖3)。

圖3 脂肪酸β氧化反轉(zhuǎn)產(chǎn)丁醇途徑動(dòng)態(tài)Fig.3 Butanol producing pathway by fatty acid β oxidation

Gonzalez研究組通過引入fadR和atoC(c)2個(gè)突變體，實(shí)現(xiàn)了在非脂肪酸存在情況下β氧化系統(tǒng)fad和ato調(diào)節(jié)子的組成型表達(dá);將大腸桿菌自身的crp基因替換為cAMP不依賴的突變體crp*，解除了葡萄糖為C源時(shí)對(duì)β氧化相關(guān)酶的C代謝阻遏;敲除arcA基因，解除了ArcA蛋白對(duì)β氧化相關(guān)操縱子的抑制。此外，還敲除了乙醇、乙酸和琥珀酸等大腸桿菌中丙酮酸的其他代謝支路(包括基因pta、adhE和frdA)。但是在這種遺傳背景下，重組大腸桿菌并不能生產(chǎn)丁醇。為了生成丁醇，表達(dá)了大腸桿菌自身的硫解酶和醇脫氫酶，最好的組合產(chǎn)生了1.9 g/L丁醇和1.2 g/L乙醇。為了減少乙醇產(chǎn)量，敲除了大腸桿菌自身的利于乙醇生成的醇脫氫酶EutE和YqhD，該重組菌株在搖瓶產(chǎn)生了2.2 g/L的丁醇;在發(fā)酵罐中產(chǎn)生了14 g/L丁醇，對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了33%［11］。

2.3 2 -酮酸脫羧途徑

2 -酮酸是氨基酸代謝中間體，在2 -酮酸脫羧酶的作用下生成相應(yīng)的醛，然后通過醇脫氫酶生成相應(yīng)的醇。2-酮戊酸是丁醇生成的直接前體，2-酮戊酸由2 -酮丁酸通過IPMS碳鏈延伸途徑形成。2-酮丁酸有2種生成途徑:蘇氨酸途徑和檸蘋酸途徑，如圖4所示。

圖4 2-酮酸脫羧產(chǎn)丁醇途徑Fig.4 Butanol producing pathway by 2-keto acid decarboxylation

2.3.1 通過蘇氨酸途徑、IPMS碳鏈延伸途徑和2-酮酸脫羧途徑產(chǎn)丁醇

James Liao研究組首先在大腸桿菌中過表達(dá)了2種2 -酮酸脫羧酶Kivd和Aro10，這2種重組菌株分別產(chǎn)生0.016 g/L和0.007 g/L丁醇。為了提高丁醇的前體2 -酮戊酸的量，負(fù)責(zé)將L -蘇氨酸化為2 -酮丁酸的IlvA蛋白被過表達(dá);同時(shí)IPMS碳鏈延伸途徑也被過表達(dá)，這樣就可以將2-酮丁酸轉(zhuǎn)化為2-酮戊酸。通過該步優(yōu)化，該大腸桿菌重組菌可產(chǎn)生0.04 g/L丁醇。將L-蘇氨酸作為底物加入培養(yǎng)基后，丁醇產(chǎn)量達(dá)到0.24 g/L。為了解除底物2-酮異戊酸、2-酮-3-甲基戊酸和2-酮-4-甲基戊酸對(duì)IPMS碳鏈延伸途徑和2-酮酸脫羧途徑的競爭性影響，ilvD基因被敲除，這樣丁醇產(chǎn)量達(dá)到了0.67 g/L［10］。

Shen等［20］也利用該途徑生產(chǎn)丁醇，不過 ilvD基因沒有被敲除。表達(dá)了thrAfbrBC基因，從而解除了由L-蘇氨酸導(dǎo)致的蘇氨酸代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄沉默，以及L-蘇氨酸對(duì)ThrA蛋白的反饋抑制。在敲除了蘇氨酸代謝競爭途徑的2個(gè)基因metA和tdh以及其他代謝支路(ilvB、ilvI和adhE)后，丁醇產(chǎn)量達(dá)到了1 g/L。

2.3.2 通過檸蘋酸途徑、IPMS碳鏈延伸途徑和2-酮酸脫羧途徑產(chǎn)丁醇

除了可以通過蘇氨酸產(chǎn)生丁醇的前體2 酮丁酸外，檸蘋酸途徑也可以生成2-酮丁酸。在檸蘋酸合酶作用下，丙酮酸和乙酰輔酶A縮合形成檸蘋酸，然后通過蛋白LeuCD和LeuB催化形成2 酮丁酸。2-酮丁酸通過IPMS碳鏈延伸途徑和2 酮酸脫羧途徑產(chǎn)生丁醇。為了提高檸蘋酸合酶在大腸桿菌中的酶活，研究者利用定向進(jìn)化的方法篩選出了最佳的檸蘋酸合酶突變體，同時(shí)解除代謝之路(ΔilvB和ΔilvI)的競爭作用，最終的丁醇產(chǎn)量達(dá)到524 mg/L［21］。

3 利用其他模式菌株生產(chǎn)丁醇

除了在大腸桿菌這種常見的模式微生物中進(jìn)行丁醇生產(chǎn)外，其他常見模式微生物也被用來生產(chǎn)丁醇。Keasling研究組首先在釀酒酵母實(shí)現(xiàn)了丁醇的產(chǎn)生。之所以選擇釀酒酵母作為改造宿主，是因?yàn)獒劸平湍傅倪z傳背景清楚、遺傳改造工具成熟、工業(yè)化經(jīng)驗(yàn)豐富而且具有很高的丁醇耐受性。他們組合了來源于不同微生物的酶，來構(gòu)建優(yōu)化的梭菌丁醇途徑。其中最好的組合是來自釀酒酵母自身的硫解酶Ergi0、來自丙酮丁醇梭菌的3 -羥基丁酰輔酶A脫氫酶Hbd和醇脫氫酶AdhE2以及來源于山丘鏈霉菌的丁酰輔酶A脫氫酶Ccr。采用該組合構(gòu)建的重組釀酒酵母，可產(chǎn)生2.5 mg/L的丁醇［22］。

假單胞菌和芽胞桿菌是天然的溶劑耐受菌株［23］。Nielsen 等［9］選擇惡臭假單胞菌和枯草芽胞桿菌進(jìn)行丁醇代謝改造。其中表達(dá)了來源于丙酮丁醇梭菌的 thil、hbd、crt、bcd、etfAB 和 adhE1 基因的重組惡臭假單胞菌，在含有甘油的培養(yǎng)基中產(chǎn)生122 mg/L 丁醇。表達(dá) thil、hbd、crt、bcd、etfAB 和adhE2基因的重組枯草芽胞桿菌，在含有甘油的培養(yǎng)基中可以產(chǎn)生24 mg/L丁醇。

乳酸菌也是一種常見的模式微生物，該菌的遺傳背景清楚，遺傳操作成熟而且丁醇耐受性強(qiáng)。其中短乳桿菌底物利用更加廣泛，可以同時(shí)利用五碳糖和六碳糖。研究者將來源于丙酮丁醇梭菌的thil、hbd、crt、bcd、etfAB 基因?qū)攵倘闂U菌中，利用其自身的醇脫氫酶。重組短乳桿菌可以利用葡萄糖產(chǎn)生300 mg/L 丁醇［7］。

除了這些異養(yǎng)微生物被改造產(chǎn)丁醇，自養(yǎng)微生物藍(lán)藻也被代謝改造產(chǎn)丁醇。藍(lán)藻通過光合作用進(jìn)行生長的同時(shí)，固定CO2產(chǎn)丁醇，理論上具有更低的成本。Lan等［5］將優(yōu)化的梭菌途徑(atoB、hbd、crt、ter和adhE2)導(dǎo)入集球藻 PCC 7942中，該藻最終產(chǎn)生了14.5 mg/L丁醇。為了進(jìn)一步提高丁醇產(chǎn)量，ATP驅(qū)動(dòng)力被引入該藻中。研究者首先將乙酰輔酶A通過乙酰輔酶A羧化酶轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A，這是一個(gè)消耗ATP的不可逆反應(yīng)，然后通過脫羧將丙二酰輔酶A與乙酰輔酶A聚合為乙酰乙酰輔酶A。再將梭菌途徑中依賴NADH的脫氫酶替換為依賴NADPH的脫氫酶，最終優(yōu)化的代謝重組藍(lán)藻可以產(chǎn)生30 mg/L 丁醇［7］。

4 丁醇代謝改造中存在的問題

實(shí)現(xiàn)生物丁醇的商業(yè)化生產(chǎn)，是這些研究工作的最終目的。盡管目前釀酒酵母、短乳桿菌、惡臭假單胞菌、枯草芽胞桿菌以及藍(lán)藻的丁醇產(chǎn)量都很低，但是這些微生物都有不同的優(yōu)勢，或者對(duì)廉價(jià)底物的利用能力很強(qiáng)，或者對(duì)丁醇有很高的耐受性。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，可以預(yù)見這些宿主生物合成丁醇的能力會(huì)不斷提高。

雖然大腸桿菌的丁醇生產(chǎn)能力已經(jīng)達(dá)到野生丙酮丁醇梭菌的水平，同時(shí)具有更高的丁醇轉(zhuǎn)化率，但是利用大腸桿菌產(chǎn)丁醇還是存在一些問題。首先，這些大腸桿菌產(chǎn)丁醇的研究工作中所用的培養(yǎng)都是豐富的培養(yǎng)基。因此進(jìn)一步改造大腸桿菌底物利用性是非常必要的。最重要的一點(diǎn)是，在大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)丁醇過程中有2個(gè)階段:好氧生長和微好氧產(chǎn)丁醇。好氧發(fā)酵對(duì)于工業(yè)應(yīng)用會(huì)消耗更多能量，增加生產(chǎn)成本。所以將這兩階段發(fā)酵改造為厭氧發(fā)酵是大腸桿菌產(chǎn)丁醇代謝改造的重要方向。

對(duì)于丙酮丁醇梭菌來說，一個(gè)最重要的問題就是如何將傳統(tǒng)的兩階段發(fā)酵(產(chǎn)酸期和產(chǎn)醇期)改造為同型丁醇發(fā)酵。從計(jì)量學(xué)上來說，1 mol葡萄糖產(chǎn)生1 mol丁醇，其氧化還原是平衡的，其中的難點(diǎn)是如何改造氫酶。因?yàn)樗缶陨淼臍涿笗?huì)消耗還原力產(chǎn)生H2。雖然以前的工作已經(jīng)證明抑制氫酶活性可以提高丁醇選擇性［24－25］，但是到目前為止，還沒有完全敲除或者抑制氫酶的報(bào)道。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究顯示氫酶在指數(shù)生長期表達(dá)，其后的表達(dá)一直受到抑制［26］。因此，闡明氫酶表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制將會(huì)為改造氫酶提供新的改造方法。在指數(shù)生長期增加還原力消耗途徑也許也可以為敲除氫酶提供幫助。

由于ABE發(fā)酵中原料成本占總成本的80%左右［27］，原料成本很大程度上制約了生物丁醇的持續(xù)生產(chǎn)，從而導(dǎo)致生物丁醇市場競爭力弱。利用便宜的工農(nóng)業(yè)廢棄物例如玉米芯、秸稈、廢甘油、含碳?xì)怏w(CO2/CO)等，都有可能降低生物丁醇的原料成本，增加生物丁醇對(duì)石化丁醇的市場競爭力，從而推動(dòng)生物丁醇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。近些年來許多工作已經(jīng)利用木質(zhì)纖維素水解液生產(chǎn)丁醇。中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所楊晟研究組對(duì)丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌的木糖利用能力進(jìn)行改造，實(shí)現(xiàn)了對(duì)木質(zhì)纖維素水解液中葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的共利用，同時(shí)菌株的丁醇轉(zhuǎn)化率也得到了提高［27－29］。除了木質(zhì)纖維素水解液，合成氣也是一種非常有利用前景的原料。利用合成氣生產(chǎn)乙醇已經(jīng)進(jìn)入商業(yè)化階段［30］。也有文獻(xiàn)報(bào)道一些微生物可以利用合成氣產(chǎn)丁醇［31－33］，雖然丁醇產(chǎn)量很低，但由于原料供應(yīng)方便，這將是一個(gè)非常有競爭力的研究方向。

綜上所述，將大腸桿菌的好氧發(fā)酵產(chǎn)丁醇改造為厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁醇、將丙酮丁醇梭菌兩階段發(fā)酵改造為同型丁醇發(fā)酵，是下一步代謝工程改造的重要方向。另外，降低原料成本，利用合成氣生產(chǎn)丁醇將是代謝工程改造的另一個(gè)重要方向。有理由期待，在這些方向取得突破，將有助于推動(dòng)生物丁醇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

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