生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇的優(yōu)化策略

陳繼良，蔡林洋

（湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068）

化石燃料是一種不可再生能源，隨著化石燃料的日益枯竭，可再生能源受到了越來越多的關(guān)注，而生物丁醇具有可再生性、熱值高、蒸氣壓低、腐蝕性小等[1]優(yōu)點(diǎn)，可以替代部分的化石燃料，受到了廣泛的關(guān)注。丁醇的生產(chǎn)方式主要有化學(xué)合成法與生物發(fā)酵法，化學(xué)合成法主要有丙烯羰基合成法與乙醛醇醛縮合法[2]，原料的來源依然是化石燃料，而生物發(fā)酵法利用葡萄糖、纖維素、淀粉等可再生的物質(zhì)作為原料，通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇，具有可再生的優(yōu)勢。糧食安全一直是國家關(guān)注的重點(diǎn)，隨著發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展，糧食類原料價(jià)格不斷在提高，越來越多的非糧原料被投入到丁醇的生產(chǎn)中，如稻草[3]，甚至有一些是工業(yè)生產(chǎn)的廢棄物，如生產(chǎn)乙醇的廢糟[4]。這些原料存在成分復(fù)雜，營養(yǎng)成分及比例不適宜，淀粉與還原糖含量低，抑制物多等問題；加上菌株對原料的利用能力差，對溶劑的耐受能力差，嚴(yán)格厭氧等問題。另外，沒有合適的發(fā)酵工藝相匹配，導(dǎo)致在丁醇發(fā)酵過程中存在菌株無法正常生長、副產(chǎn)物過多、丁醇產(chǎn)量低等問題[5]。該文將從菌種、培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)工藝三個(gè)方面總結(jié)一些已有的生產(chǎn)丁醇的優(yōu)化策略，為改善發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇與提高丁醇生產(chǎn)效益提供參考。

1 優(yōu)化菌種

1.1 高產(chǎn)菌株的篩選

近些年來，分離篩選丁醇生產(chǎn)菌的工作一直在進(jìn)行，新發(fā)現(xiàn)菌株盡管在丁醇的產(chǎn)量上很難有提高，但是菌株擁有的新性狀有利于在丁醇發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用，提高生產(chǎn)效益，一些丁醇生產(chǎn)菌的報(bào)道情況如表1所示。

表1 一些丁醇生產(chǎn)菌的報(bào)道Table 1 Partial report of butanol producing strains

誘變育種是在已經(jīng)獲得了能夠生產(chǎn)丁醇的菌的基礎(chǔ)上，通過添加誘變劑的方式來提高菌的遺傳物質(zhì)在復(fù)制過程中的錯(cuò)配機(jī)率，并將這些發(fā)生變異的遺傳信息遺傳給后代，通過一定的分離篩選手段得到具有優(yōu)良性狀的菌的育種方式，一些丁醇生產(chǎn)菌誘變育種的報(bào)道見表2。誘變育種操作簡單，被廣泛的運(yùn)用在菌種的改良中，通過這種方式有一定的機(jī)率可以得到性狀優(yōu)良的菌株，但是突變結(jié)果具有隨機(jī)性，無意義的突變占絕大部分，試驗(yàn)的盲目性大，工作量也龐大。

表2 一些丁醇生產(chǎn)菌誘變育種的報(bào)道Table 2 Partial report on mutation breeding of butanol producing strains

1.2 代謝途徑的分子修飾或改造

野生型丁醇生產(chǎn)菌最常被報(bào)道的代謝產(chǎn)物有乙醇、乙酸、丙酮、丁酸、丁醇這些物質(zhì)，這些物質(zhì)的產(chǎn)生途徑如圖1所示，每種代謝產(chǎn)物都需要利用前體物質(zhì)丙酮酸去合成，因此，減少副產(chǎn)物的生成與增加丁醇的生成是提高丁醇產(chǎn)量的一個(gè)重要方向。另外，菌株專性厭氧，對丁醇的耐受能力不高也是丁醇生產(chǎn)工業(yè)的一個(gè)障礙[16]。目前，主要從兩個(gè)方面修飾或改造菌種的代謝途徑：一種是從碳源的流向入手，改造糖酵解途徑（embden-meyerhof pathway，EMP）代謝途徑，使用于丙酮-丁醇-乙醇（acetone-butanol-ethanol，ABE）合成的前體物質(zhì)過表達(dá)，阻斷丙酮、乙酸及丁酸這些副產(chǎn)物的代謝途徑，減少碳源流入副產(chǎn)物，一定程度上可以將更多的碳源流入到生成丁醇的代謝中；另一種是提高菌株對發(fā)酵環(huán)境的適應(yīng)能力，解除其他基因?qū)w生長與產(chǎn)物合成的抑制作用，如提高菌株對丁醇的耐受性與對氧氣的耐受能力，使菌株更加適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境，從而達(dá)到改善發(fā)酵的作用。一些通過分子手段修飾或改造代謝途徑的報(bào)道見表3。

圖1 丁醇生產(chǎn)菌的代謝途徑[24]Fig.1 Metabolic map of butanol-producing bacteria

表3 部分關(guān)于代謝途徑通過分子手段修飾或改造的報(bào)道Table 3 Partial report on molecular means of modification or modification of metabolic pathway

相比于傳統(tǒng)的誘變育種，利用分子改造或修飾菌株的方式目的性強(qiáng)，可以促進(jìn)有利于產(chǎn)物生成的基因的表達(dá)，阻斷或抑制非必需的副產(chǎn)物基因的表達(dá)，提高菌株適應(yīng)性。然而丁醇梭菌的代謝途徑復(fù)雜，需要考慮通過基因的過表達(dá)、敲除、重組等方式進(jìn)行修飾改造菌株對其生長代謝帶來的影響。各個(gè)代謝途徑存在著相互聯(lián)系，丁醇梭菌本身專性厭氧，會增加分子試驗(yàn)操作的難度。

1.3 構(gòu)建工程菌株

基因工程手段通常也被用于菌種的改良，該方法能夠借助工程菌的優(yōu)勢。該方法通常是將與丁醇代謝相關(guān)的基因片段導(dǎo)入到特性優(yōu)良的宿主細(xì)胞體內(nèi)，并將導(dǎo)入的基因在宿主細(xì)胞體內(nèi)表達(dá)。通常生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇有兩種途徑[25]，一種是輔酶A（coenzyme A，CoA）依賴途徑，類似于脂肪酸在生物體內(nèi)的合成方式，梭菌先將乙酰CoA合成丁酰CoA，然后將丁酰CoA還原成正丁醇，這是野生菌最常見的丁醇代謝方式，例如丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌與糖乙酸多丁醇菌。該方式也被用于構(gòu)造丁醇生產(chǎn)的工程菌株，如LAN E I等[26]將丁醇的CoA依賴途徑相關(guān)基因?qū)胨{(lán)細(xì)菌中表達(dá)，構(gòu)造了一株能夠利用光能合成丁醇的菌株，其中丁醇產(chǎn)量0.014 5 g/L。ZHANG J等[27]將丁醇的CoA依賴途徑部分基因?qū)肜叶∷崴缶?，?gòu)造了一株對丁醇耐受能力強(qiáng)的菌株，通過分批發(fā)酵丁醇產(chǎn)量達(dá)26.2 g/L；YANG X R等[28]將醛/醇脫氫酶基因（edhE2）引入纖維素分解菌嗜纖維桿菌（Clostridium cellulovorans），其能夠?qū)⒍□?CoA轉(zhuǎn)化為正丁醇和乙酰-CoA轉(zhuǎn)化為乙醇，構(gòu)造的菌株可以直接利用纖維素生產(chǎn)正丁醇，產(chǎn)量為1.42 g/L。另一種是2-酮酸途徑，生物體內(nèi)的蘇氨酸被用于中間產(chǎn)物2-酮丁酸的生產(chǎn)，然后中間產(chǎn)物被脫羧還原產(chǎn)生正丙醇與正丁醇，一般這種途徑用于異源表達(dá)，代謝副產(chǎn)物少，如利用大腸桿菌重組菌株BW25113就是利用這一途徑，丁醇產(chǎn)量達(dá)0.8 g/L[29]。

將涉及丁醇代謝的關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)移到特性優(yōu)良的宿主體內(nèi)進(jìn)行異源表達(dá)，其他方面加以調(diào)整，具有生產(chǎn)丁醇的潛力與可行性。這種生產(chǎn)方式能夠借助宿主細(xì)胞的優(yōu)良特性，使得能夠用于丁醇發(fā)酵的原料種類增多，同時(shí)對發(fā)酵環(huán)境具有強(qiáng)的適應(yīng)能力，然而丁醇代謝相關(guān)的基因在宿主體內(nèi)的兼容性也是不可忽略的，增加了改造的難度。

2 優(yōu)化培養(yǎng)基配方

微生物生產(chǎn)丁醇的代謝網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，通常提高或降低某些物質(zhì)的含量就可以影響某些代謝途徑的表達(dá)量，從而影響丁醇的產(chǎn)量。隨著研究深入，已經(jīng)有報(bào)道表明，適量地添加氨基酸[30]、醋酸銨[31]、丁酸根[32]、乙酸根[33]、鋅離子、鈣離子、鐵離子[34]等對丁醇產(chǎn)量有提高的作用，各物質(zhì)存在相互影響，適宜的物質(zhì)配比能夠得到更高的丁醇產(chǎn)量。借助數(shù)理統(tǒng)計(jì)工具就可以通過少量的試驗(yàn)數(shù)據(jù)模擬生物發(fā)酵過程，建立發(fā)酵的數(shù)學(xué)模型。再借助分析工具分析模型就能得到培養(yǎng)基中影響顯著的成分及其適宜的添加量，從而達(dá)到提升丁醇產(chǎn)量的目的。

2.1 回歸分析模擬優(yōu)化

響應(yīng)面是回歸分析模型之一，是一個(gè)基于二次二階的數(shù)學(xué)模型。將試驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)用于擬合一個(gè)二次多項(xiàng)式模型方程式，通過顯著性檢驗(yàn)與方差分析（analysis of variance，ANOVA），分析參數(shù)及其相互作用對輸出結(jié)果的影響[35]，用相關(guān)系數(shù)R2值評估多項(xiàng)式模型的可靠性。通過擬合的多項(xiàng)式方程通過繪制三維表面圖，可以觀察到兩兩因素之間的相互作用關(guān)系，通過回歸方程可以精確得到最優(yōu)的培養(yǎng)基配方及相應(yīng)的預(yù)測結(jié)果。NAJEEB K N S等[36]采用中心組合設(shè)計(jì)來提高丁醇的產(chǎn)量，以木薯為原料，按照中心組合設(shè)計(jì)添加葡萄糖與丁酸以及調(diào)整C/N比例，將試驗(yàn)結(jié)果用于擬合模型，按照模型得出添加葡萄糖與丁酸含量以及調(diào)整C/N比例分別是50 g/L、10 g/L、12.8，預(yù)測的丁醇產(chǎn)量13.82 g/L，發(fā)酵驗(yàn)證的丁醇產(chǎn)量是13.87 g/L，高于優(yōu)化前的最高產(chǎn)量9.48 g/L。

2.2 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模擬與遺傳算法優(yōu)化

人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是一種人工模擬大腦運(yùn)行用于處理某種信息的系統(tǒng)，被用于廣泛運(yùn)用于微生物的培養(yǎng)基優(yōu)化上[37-38]。遺傳算法則是模擬自然進(jìn)化，在合理范圍內(nèi)隨機(jī)產(chǎn)生培養(yǎng)基配方，并將這些配方帶入訓(xùn)練有素的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，多次篩選變異之后，就能得到一個(gè)相對較優(yōu)的優(yōu)化結(jié)果以及相應(yīng)的配方。相比于響應(yīng)面來說，采用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模預(yù)測結(jié)合遺傳算法優(yōu)化具有更高的準(zhǔn)確性，SALIM N等[39]使用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對菌株Trichoderma harzianum建立發(fā)酵模型，采用遺傳算法從模型中找到最優(yōu)培養(yǎng)的條件，蛋氨酸酶預(yù)測值是33.76 U/mg，預(yù)測的配方是乳糖、L-蛋氨酸、KH2PO4、K2HPO4、ZnCl2分別加13.9 g/L、11.37 g/L、1.58 g/L、3.98 g/L、0.01 g/L。某些物質(zhì)對于菌的影響來說并非符合二次連續(xù)函數(shù)模型，閾值函數(shù)的加入適用于處理這類非連續(xù)的數(shù)學(xué)模型，其擬合的模型能夠更加吻合生物發(fā)酵的特征。

3 優(yōu)化發(fā)酵工藝

除了優(yōu)化培養(yǎng)基配比外，丁醇梭菌的培養(yǎng)工藝同樣重要。菌株對丁醇的耐受性沒有很大提高[40]，限制了丁醇產(chǎn)量的進(jìn)一步提高；越來越多的非糧原料用于丁醇的生產(chǎn)，存在菌株對原料的利用能力差的問題，各種處理會釋放原料中的抑制物，都會影響丁醇的生產(chǎn)[41]，采用合適的培養(yǎng)工藝可以緩解這些問題。

3.1 產(chǎn)物原位提取

丁醇梭菌的代謝產(chǎn)物有許多，如乙醇、乙酸、丙酮、丁酸、丁醇等，其中丁醇對菌株的抑制性最大，正丁醇影響膜的脂質(zhì)組成，流動性與電位，并且能夠中斷細(xì)胞的磷脂雙分子層[42]。原位提取是一個(gè)避免高濃度產(chǎn)物對菌體有毒害作用的方式，將發(fā)酵產(chǎn)物丁醇脫離發(fā)酵體系，這樣能夠?qū)崿F(xiàn)在營養(yǎng)物質(zhì)足夠的情況下，菌株能夠源源不斷地生產(chǎn)丁醇。一種方式是利用一些物質(zhì)對于水與丁醇的溶劑度不同構(gòu)建雙相系統(tǒng)，如利用丁醇易溶于有機(jī)溶劑可以液-液萃取[43]、活性炭對丁醇吸附丁醇能力強(qiáng)，可以用吸附[44]、丁醇比水易溶于空氣，通過通氣的方式將丁醇攜帶出發(fā)酵體系，可以用氣提[45]等。另一種是利用一些材料對水和丁醇的選擇透過性不同可以將丁醇從發(fā)酵體系中分離，如膜蒸發(fā)[46]、滲透[47]與反向滲透[48]。原位提取能夠很好回避丁醇對菌的毒害作用，然而最大的問題在于尋找合適的提取分離體系，要求溶劑收集相能夠?qū)Πl(fā)酵產(chǎn)生的溶劑溶解度足夠大，并與發(fā)酵液互不相溶，對菌體無毒無害，易于分離，或者材料對丁醇的選擇透過性高，其營養(yǎng)物質(zhì)不能透過膜。

3.2 共培養(yǎng)發(fā)酵

目前報(bào)道的用于生產(chǎn)丁醇的菌絕大多數(shù)是厭氧菌，以木質(zhì)纖維素為原料進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方式受到了越來越多的關(guān)注。木質(zhì)纖維素難以被丁醇梭菌所利用，水解過程會產(chǎn)生大量的抑制物[41]，通過與其他微生物共培養(yǎng)，可以為丁醇梭菌制造厭氧環(huán)境[49]，更重要的是讓其他微生物先行分解這類難以利用的大分子物質(zhì)為一些容易吸收利用營養(yǎng)物質(zhì)，中間代謝產(chǎn)物，生長因子等[50]，協(xié)助丁醇梭菌對原料中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，同時(shí)，協(xié)助分解一些抑制物，從而達(dá)到提高丁醇產(chǎn)量的目的。ALEJANDRA G O R等[51]使用龍舌蘭水解液作為原料，丙酮丁醇梭菌與枯草芽孢桿菌共培養(yǎng)丁醇產(chǎn)量達(dá)8.2 g/L，而丙酮丁醇梭菌單獨(dú)發(fā)酵產(chǎn)量是6 g/L，提高了36.7%。LI L等[52]使用甘蔗糖蜜作為原料，將拜氏梭菌與酪丁酸梭菌共發(fā)酵生產(chǎn)丁醇產(chǎn)量達(dá)12.1 g/L，而單獨(dú)使用拜氏梭菌發(fā)酵產(chǎn)量是11.2 g/L，提高了8%。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，通過丁醇梭菌與其他菌共培養(yǎng)的方式生產(chǎn)丁醇的產(chǎn)量，高于直接在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加這些物質(zhì)的方式與直接發(fā)酵的方式，一方面原因是人為添加這些物質(zhì)的時(shí)機(jī)沒有共培養(yǎng)微生物代謝產(chǎn)生的好；另一方面是受技術(shù)水平的限制，共培養(yǎng)微生物產(chǎn)生的一些物質(zhì)對丁醇梭菌產(chǎn)丁醇有提高作用，但由于其含量極低，在其以往的研究過程中并沒有被發(fā)現(xiàn)，這類物質(zhì)在培養(yǎng)基上的添加往往會被忽略掉。

一些研究發(fā)現(xiàn)，在食物匱乏或者營養(yǎng)物質(zhì)不全的條件下，丁醇梭菌能夠與其他菌互利共生，兩者不僅能夠在體外進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)代謝產(chǎn)物的交換，而且還能夠進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)中的物質(zhì)交換。SAIDA B等[53]研究發(fā)現(xiàn)，丙酮丁醇梭菌與脫硫弧菌能夠互換細(xì)胞質(zhì)中的物質(zhì)，脫硫弧菌的存在使得丙酮丁醇梭菌生長的更好。

3.3 兩階段發(fā)酵

大多數(shù)的丁醇梭菌在生產(chǎn)丁醇的過程中存在著產(chǎn)酸與產(chǎn)醇兩個(gè)階段，產(chǎn)醇階段可以利用產(chǎn)酸階段產(chǎn)生的部分有機(jī)酸轉(zhuǎn)化為醇[54]。也有研究表明，將有機(jī)酸在發(fā)酵前加入培養(yǎng)基中，可以提高丁醇梭菌對丁醇的耐受性，提高丁醇的產(chǎn)量[55]。分階段發(fā)酵就是利用產(chǎn)酸菌先將部分難以分解利用的碳源轉(zhuǎn)化為丁醇梭菌容易吸收利用的有機(jī)酸，然后丁醇梭菌將這些酸轉(zhuǎn)化為丁醇；另外，產(chǎn)酸菌還可以降解原料中存在的一些抑制物，促進(jìn)丁醇梭菌的生長代謝。LI J Z等[56]使用稻草作為生產(chǎn)丁醇的原料，先利用產(chǎn)酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乙酸與丁酸，然后利用拜氏梭菌發(fā)酵生產(chǎn)丁醇，丁醇產(chǎn)量高達(dá)13.8 g/L，高于直接使用拜氏梭菌對原料進(jìn)行發(fā)酵的方式，還高于在原料上添加乙酸、丁酸再使用拜氏梭菌發(fā)酵的方式。相比共培養(yǎng)來說，可以避免其他菌對丁醇梭菌產(chǎn)生抑制作用，但是分階段發(fā)酵的操作工藝相對復(fù)雜，同時(shí)也會帶來發(fā)酵周期的延長。

4 結(jié)論與展望

生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇一直是一個(gè)研究的熱點(diǎn)，真正用于工業(yè)生產(chǎn)還存在著菌株對產(chǎn)物耐受性差，對原料利用能力差，對發(fā)酵環(huán)境適應(yīng)能力差，副產(chǎn)物多等問題。這些問題可以從三個(gè)方面找到緩解的策略：

性狀優(yōu)良的菌種用于發(fā)酵是高產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的前提，自然界篩選與誘變育種的操作簡單，是得到性狀優(yōu)良生產(chǎn)菌的重要途徑，今后的探索依然會繼續(xù)。隨著丁醇梭菌代謝方面的研究深入，分子生物學(xué)的快速發(fā)展，代謝途徑修飾改造或者丁醇代謝基因異源表達(dá)的技術(shù)越來越成熟，生產(chǎn)菌株可以通過這些方式獲得優(yōu)良的特性，在提高菌株對產(chǎn)物的耐受性，對原料的利用，對發(fā)酵環(huán)境的適應(yīng)，減少副產(chǎn)物的產(chǎn)量，增加目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量等方面具有廣泛的應(yīng)用前景，菌種改良的目標(biāo)比較明確，依舊是今后研究的一個(gè)熱點(diǎn)方向。

隨著研究的深入，越來越多的非糧原料用于丁醇生產(chǎn)，成分的多樣性，原料的更新，需要不斷優(yōu)化配比，今后，借助各種處理工具優(yōu)化培養(yǎng)基配比的方式將繼續(xù)。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與遺傳算法適合解決一類優(yōu)化的問題，在其他生物的培養(yǎng)基配比優(yōu)化方面優(yōu)于回歸分析，推動該方法在丁醇生產(chǎn)中在培養(yǎng)基配比優(yōu)化上的運(yùn)用。

面對復(fù)雜的發(fā)酵環(huán)境，發(fā)酵工藝依然是一個(gè)研究的熱點(diǎn)，尤其是菌株對發(fā)酵產(chǎn)物丁醇的耐受性難以提高的情況下，原位提取工藝結(jié)合其他的發(fā)酵工藝是一個(gè)值得借鑒考慮的工藝優(yōu)化方式，將會有更多的研究。