超臨界C0₂提取延胡索乙素最優(yōu)工藝條件探索

劉雷 祁俊生 梁克中 陳書(shū)鴻 黃美英 周濃

摘要：文章通過(guò)設(shè)計(jì)四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，探索超臨界CO2流體萃取法提取延胡索乙素的最優(yōu)工藝條件。利用SFE-CO2法提取延胡索中的延胡索乙素；利用HPLC法測(cè)定萃取物中延胡索乙素的含量。經(jīng)實(shí)驗(yàn)探究，確定的最佳工藝條件為：延胡索粒度為30目，萃取壓力20Mpa，萃取溫度45℃，改性劑為飽和Ca（OH）2溶液，夾帶劑為藥材1.5倍量的95%乙醇。該工藝穩(wěn)定可行，可用于延胡索乙素的提取。

關(guān)鍵詞：延胡索；延胡索乙素；超臨界C02流體萃取法；高效液相色譜法

延胡索（Corydalis yanhusuo），又名元胡、玄胡、元胡索等，為大宗常用中藥，屬“浙八味”之一。塊莖為著名常用中藥，具有活血散瘀、行氣止痛的功效。其內(nèi)含有延胡索甲素、延胡索乙素等20多種生物堿[1]。延胡索乙素又名鹽酸四氫巴馬丁，四氫掌葉防己堿。熔點(diǎn)在147～149℃，遇光受熱顏色漸變深。中國(guó)藥典（2015年版一部）以延胡索乙素為指標(biāo)，對(duì)延胡索藥材規(guī)定了TLC定性鑒別和HPLC含量測(cè)定方法，己成為延胡索及其制劑進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要依據(jù)[2]。

超臨界CO2流體萃取法是國(guó)際上較先進(jìn)的物理萃取技術(shù)，陳峰[3]、包瑋鴛[4]等分別從萃取壓力、萃取溫度等因素設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，探索SFE-CO2法提取延胡索乙素的最優(yōu)工藝條件。此外，在延胡索乙素提取過(guò)程中，SFE-CO2法與醇回流提取法等傳統(tǒng)的提取方法相比較，工藝穩(wěn)定可行，優(yōu)于其他傳統(tǒng)提取方法[5]。本研究在前人工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究超臨界CO2流體萃取過(guò)程中各項(xiàng)參數(shù)對(duì)延胡索乙素萃取率的影響，進(jìn)而探究其更為完善的最佳工藝條件。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與藥劑

HA120-50-01超臨界萃取裝置（江蘇南通華安超臨界萃取有限公司），LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津集團(tuán)），DZF-6050MBE型電熱恒溫真空干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），SB-5200DTN型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），RVIO基本型立式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（IKA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀公司），CP225D型分析天平（德國(guó)Sartorius公司）。

延胡索藥材（浙江東陽(yáng)），延胡索乙素對(duì)照品（批號(hào)：110726-210213，中國(guó)食品藥品檢定研究院），延胡索對(duì)照藥材（批號(hào)：120928-201208，中國(guó)食品藥品檢定研究院），工業(yè)二氧化碳（萬(wàn)州區(qū)三牧氣體有限公司），其余試劑均為分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1延胡索乙素的SFE-CO2法提取

選取延胡索塊莖若干，清洗，40℃條件下烘干，粉碎，制備大、中、小3個(gè)梯度延胡索粉末若干以備用。

精密稱取相應(yīng)粒度的延胡索粉末200g，與適量的堿性飽和Ca（OH）2溶液混合拌勻，于25℃恒溫條件下密閉保存24 h。裝入1L的萃取釜中，啟動(dòng)超臨界萃取裝置，萃取釜壓力、溫度按正交表L9（34）設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行設(shè)定。當(dāng)分離釜I壓力達(dá)到6Mpa、溫度達(dá)到40℃，分離釜Ⅱ壓力達(dá)到4Mpa、溫度達(dá)到30℃，CO2流量基本穩(wěn)定在20～40 kg/h后，從夾帶劑泵處注入95%的乙醇，夾帶劑用量依據(jù)正交表L9（34）設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行選擇。穩(wěn)定萃取2.5 h后，依次關(guān)閉裝置閥門(mén)，停止萃取。期間間隔一段時(shí)間用潔凈大燒杯于分離釜I和分離釜Ⅱ處收集萃取物。

1.2.2延胡索乙素的HPLC法測(cè)定

用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將所收集的萃取液濃縮蒸干，待蒸干瓶溫度降低至接近室溫后，加入80%的甲醇溶液溶解，利用超聲波震蕩至壁上無(wú)殘留后，定容至50 mL容量瓶中，靜置，取上層澄清液進(jìn)行液相色譜測(cè)定。

色譜條件：色譜柱為Durashell C18色譜柱（250 mmx4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相A相為乙腈―水（92：8），B相為0.2%冰醋酸溶液（用三乙胺調(diào)節(jié)pH至5.05），進(jìn)行梯度洗脫（0～15 min，20% A→20% A；15～35 min，20% A→80% A）：檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm；柱溫為35℃；體積流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為20μL[6]。按照上述色譜條件進(jìn)行分析，各成分分離度良好，對(duì)照品和樣品HPLC圖如圖l所示。

2 結(jié)果與分析

2.1單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)

通過(guò)單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)，探索在超臨界CO2流體萃取過(guò)程中，藥材粒度、堿化劑、萃取壓力、萃取溫度4個(gè)關(guān)鍵因素對(duì)延胡索乙素提取率的影響，為后續(xù)正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)提供一個(gè)合理的數(shù)值范圍。

2.1.1藥材粒度對(duì)延胡索乙素提取率的影響

精密稱取30、50、70、90目延胡索粉末各200g，用飽和Ca（OH）2溶液密閉浸泡24 h，裝入1L的萃取釜中，設(shè)置萃取釜壓力為15 Mpa，溫度為40℃，其余步驟同“1.2實(shí)驗(yàn)方法”所述。本次單因素實(shí)驗(yàn)以所測(cè)得延胡索乙素含量（mg/g）為指標(biāo)，旨在考察延胡索藥材的不同粒度對(duì)提取效果的影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出當(dāng)延胡索目數(shù)為30目時(shí)，延胡索乙素提取率較高。

2.1.2有無(wú)堿化試劑對(duì)延胡索乙素提取率的影響

本實(shí)驗(yàn)在改性劑的選擇中，從基于環(huán)境友好型溶劑考慮，放棄選用如三乙胺、氨水-乙醇溶液等與生物堿相容性較高但對(duì)環(huán)境有污染的化學(xué)試劑作為改性劑，選用飽和Ca（OH）2溶液作堿化試劑。其優(yōu)勢(shì)有兩點(diǎn)：其一，Ca（OH）2屬于無(wú)機(jī)堿性溶液，除對(duì)延胡索乙素這種生物堿具有堿化效果外，對(duì)不銹鋼萃取釜的腐蝕性也相對(duì)其他有機(jī)溶劑較?。黄涠?，Ca（OH）2溶液還可去除粘液性物質(zhì)，對(duì)減少萃取液色譜圖中的雜質(zhì)峰數(shù)量有一定作用。

稱取6份30目延胡索粉末各200g，分為甲、乙兩組，甲組使用飽和Ca（OH）2溶液浸泡24h進(jìn)行預(yù)處理，乙組不做任何堿化處理。分別按照2.1.1中提及的相關(guān)參數(shù)及方法條件提取3次，合并3次提取液，蒸干濃縮，HPLC測(cè)定，計(jì)算萃取率。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用飽和Ca（OH）2溶液浸泡的延胡索樣品萃取率為0.81mg/g，未做任何堿化處理的取率為0.72mg/g，對(duì)比可知，樣品堿化后萃取的效果優(yōu)于未做堿化處理的。

2.1.3萃取壓力對(duì)延胡索乙素提取率的影響

稱取12份延胡索粉末（30目）各200g，分別在萃取釜設(shè)定壓力為10Mpa、25Mpa、40Mpa、55Mpa的條件下提取3次，其余條件均依照2.1.1中提及的相關(guān)參數(shù)及方法進(jìn)行。合并3次提取液，蒸干濃縮，HPLC測(cè)定，計(jì)算萃取率。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，25 Mpa條件下提取效果較好。

2.1.4萃取溫度對(duì)延胡索乙素提取率的影響

稱取12份30目延胡索粉末各200 g，分別在萃取釜設(shè)定溫度為25℃、45℃、65℃的條件下提取3次，其余條件均依照2.1.1中提及的相關(guān)參數(shù)及方法進(jìn)行。合并3次提取液，蒸干濃縮，HPLC測(cè)定，計(jì)算萃取率。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，35℃條件下提取效果較好。

2.1.5萃取過(guò)程中夾帶劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)在夾帶劑的選擇中，基于延胡索乙素的理化性質(zhì)及無(wú)毒環(huán)保性考慮，選取乙醇作為萃取夾帶劑。

2.2正交實(shí)驗(yàn)

2.2.1正交因素水平確定

依據(jù)超臨界制CO2流體萃取工藝特點(diǎn)，以及上述單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取萃取壓力（A）、藥材粒度（B）、萃取溫度（C）、夾帶劑用量（D）4個(gè)因素，每個(gè)因素各取3個(gè)水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以所得萃取物中延胡索乙素的含量作為考察指標(biāo)。具體因素水平如表1所示。

2.22實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)處理

按照上述L。（34）正交實(shí)驗(yàn)因素水平表，共進(jìn)行了9組實(shí)驗(yàn)，每組設(shè)3個(gè)平行。正交實(shí)驗(yàn)有關(guān)數(shù)據(jù)及其計(jì)算結(jié)果如表2所示。

2.2.3方差分析

用SPSS軟件（22.0）對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行方差分析，以延胡索乙素含量為考察指標(biāo)，方差分析結(jié)果如表3所示。

從上述正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中可以得出，最佳萃取條件為AIB2C3D2；因素的主次順序?yàn)椋築>D>A>C，故B2D2AIC3為超臨界CO2流體萃取的最佳實(shí)驗(yàn)條件，即：延胡索粒度為30目；夾帶劑為藥材質(zhì)量的1.5倍量；萃取壓力為20 MPa；萃取溫度為45℃。

2.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

稱取30目a、b、c3份延胡索粉末各200g，按上述最佳工藝條件進(jìn)行萃取，測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果顯示，a、b、c3組萃取率分別為1.08、1.16、1.23 mg/g，由此可知，延胡索乙素的提取率在3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中均處于較高水平，說(shuō)明該工藝穩(wěn)定可行。

3 結(jié)語(yǔ)

本研究在前人研究工作的基礎(chǔ)上，另辟蹊徑，在萃取溫度、萃取壓力、藥材粒度與改性劑用量之間構(gòu)建新的排列組合關(guān)系，在結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)探尋上述4個(gè)要素條件下的最優(yōu)工藝條件。

經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)探究發(fā)現(xiàn)，用SFE-CO2法提取延胡索乙素，相較于索氏提取法、醇回流提取法、以及超聲波一甲醇回流提取法（藥典法）等傳統(tǒng)提取工藝，具有操作溫度低、耗能低、時(shí)間短、有效成分含量高、無(wú)有機(jī)殘留等優(yōu)點(diǎn)。該工藝方法穩(wěn)定可行，可擴(kuò)展到“中試”生產(chǎn)當(dāng)中，并可作為中藥材重要有效成分提取的一種高效的方法。

采用本研究中正交實(shí)驗(yàn)所探究的最優(yōu)工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，測(cè)得每克延胡索藥粉含有延胡索乙素達(dá)1.23 mg，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的提取工藝，也優(yōu)于同類型SFE-CO，法的提取效果[7]。在A383C2D1組實(shí)驗(yàn)中，萃取效率陡然降低，究其原因，可能是由于在使用高目數(shù)，高壓力的條件下，因藥材研磨程度較細(xì)，與夾帶劑乙醇溶液混合后，加之在最大設(shè)定壓力的沖擊下，萃取物質(zhì)以稠狀形式存在，堵塞了萃取釜的聯(lián)通孔隙，以至C02流通不暢，造成最終萃取效率較低。

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