帝玉露的離體培養(yǎng)及快速繁殖技術(shù)研究

何佳越 劉天樂(lè) 余麗萍 唐玲 黃雪麗

摘要[目的]建立帝玉露的葉片離體快繁體系，為帝玉露商業(yè)化快速生產(chǎn)、種質(zhì)資源的保存及新品種的選育提供技術(shù)支持。[方法]以多肉植物帝玉露不同成熟度葉片為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)、增殖和生根培養(yǎng)，探究不同激素和NaH2PO4濃度對(duì)其愈傷組織誘導(dǎo)、分化及生根移栽的影響。[結(jié)果]帝玉露愈傷誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+2.00 mg/L 6-BA+ 0.20 mg/L NAA，誘導(dǎo)率達(dá)95.00%；愈傷組織最佳分化培養(yǎng)基為MS+1.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA+40.00 mg/L NaH2PO4 ，分化時(shí)間短且分化率最高為 96.70%；最佳壯苗生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.20 mg/L NAA，移栽成活率為96.00%。[結(jié)論]使用成熟葉片作為外植體可以建立帝玉露的快繁體系。

關(guān)鍵詞帝玉露；葉片；組織培養(yǎng)；愈傷組織誘導(dǎo)；快速繁殖

中圖分類號(hào)S604+.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）08-0148-03

Study on Tissue Culture and Rapid Propagation Techniques of Haworthia cooperi var.dielsiana

HE Jiayue1，LIU Tianle2，YU Liping1，HUANG Xueli1* et al（1.College of Agriculture，Sichuan Agricultural University，Chengdu，Sichuan 611130；2.Development School Chengdu No.7 High School，Chengdu，Sichuan 611130；3.College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Chengdu，Sichuan 611130）

Abstract[Objective] Tissue culture and rapid propagation techniques of Haworthia cooperi var.dielsiana were established to provide technical support for commercial rapid production and conservation of the germplasm resources and breeding new varieties.[Method] The effect of different plant growth regulating substances and concentration of NaH2PO4 on callus induction， bud induction， rooting and transplanting were researched by induction， proliferation and rooting culture，by using different maturity leaves of H.cooperi var.ielsiana as explants.[Result] The best callus induction medium was MS +2.00 mg/L 6-BA+ 0.20 mg/L NAA， the callus induction rate was 95.00%； the best bud induction medium was MS+ 1.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA+40.00 mg/L NaH2PO4，which the bud induction time was short and the bud induction rate reached 96.70%； the best rooting medium was 1/2MS + 0.20 mg/L NAA， the transplanting survival rate was 96.00%.[Conclusion]We should use mature leaves as explants to establish the rapid propagation system of H.cooperi var.dielsiana.

Key wordsHaworthia cooperi var.dielsiana；Leaves；Tissue culture；Callus induction；Rapid propagation

帝玉露（Haworthia cooperi var.dielsiana）為獨(dú)尾草科十二卷屬植物，植株整體呈蓮座狀，葉片肉質(zhì)肥厚且頂部有透明的“窗”，“窗”大而透亮，有頂毛，原產(chǎn)于南非，具有較高的觀賞價(jià)值。目前市面上的各玉露品種大多采用側(cè)芽、葉插或砍頭繁殖，但此類方法繁殖系數(shù)低、繁殖周期長(zhǎng)且受限于部分品種單生不易萌發(fā)側(cè)芽，難以滿足市場(chǎng)需求；也有采用玉露種子播種繁殖，但

投入的時(shí)間成本和勞動(dòng)力成本都有所增加，且長(zhǎng)出的實(shí)生苗通常發(fā)生性狀改變，同一批苗的生長(zhǎng)速度及外觀都有差異，因而不適合投放市場(chǎng)。為滿足市場(chǎng)對(duì)十二卷屬植物的需求，有學(xué)者對(duì)該屬植物進(jìn)行了組培快繁的研究[1-8]。在十二卷同屬植物組培快繁體系中，花莖、子房是最主要的外植體。而在十二卷屬植物組培快繁體系中使用幼嫩花莖或子房作為外植體存在較大的局限性，母本植物抽莖開(kāi)花具有季節(jié)性且需要生長(zhǎng)到一定年限才能開(kāi)花，使用其多漿葉片作為外植體鮮有報(bào)道。

使用葉片作為外植體建立帝玉露的組培快繁體系，可能因葉片肉質(zhì)化水分含量高導(dǎo)致滅菌困難及滅菌后成活率低。

目前對(duì)多肉植物玉露的研究涉及品種較少，帝玉露是十二卷屬植物中的經(jīng)典品種，關(guān)于其組培快繁的相關(guān)報(bào)道較少。研究帝玉露葉片作為外植體的組培快繁，對(duì)其商業(yè)化快速生產(chǎn)、種質(zhì)資源的保存及新品種選育有重要意義。該研究以帝玉露葉片作為外植體，探究葉片成熟度對(duì)其產(chǎn)生愈傷的影響和不同激素組合對(duì)其誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響，建立帝玉露組培快繁體系，為工廠化快速繁殖及種質(zhì)資源的保存提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1供試材料帝玉露不同成熟度葉片：成熟的葉片、幼嫩的新生葉片。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1無(wú)菌材料的獲得。將帝玉露不同葉片從植株小心剝離，流水沖洗2～3 h；在無(wú)菌瓶中用75%酒精浸洗10 s，無(wú)菌水清洗4次；用0.1%升汞浸洗8 min，無(wú)菌水清洗4次，切取0.5 cm×0.5 cm的葉片接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

1.2.2培養(yǎng)基不同激素濃度配比的篩選。

1.2.2.1愈傷組織誘導(dǎo)。以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度激素配比，設(shè)置4種誘導(dǎo)培養(yǎng)基：①M(fèi)S + 3.00 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA；②MS + 3.00 mg/L 6-BA + 0.20 mg/L NAA；③MS + 2.00 mg/L 6-BA +0.05 mg/L NAA；④MS + 2.00 mg/L 6-BA + 0.20 mg/L NAA。將滅菌好的葉片接種至4種培養(yǎng)基中，每處理接種10瓶，每瓶4個(gè)外植體，30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.2.2愈傷組織分化。以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度激素配比和NaH2PO4，采用L9（33）正交表安排試驗(yàn)（表1），將愈傷組織接種于培養(yǎng)基中，觀察愈傷組織分化情況，45 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的分化率。

1.2.2.3生根培養(yǎng)。將分化出的新芽分單株接種至以1/2MS為基本培養(yǎng)基并添加不同濃度激素配比的4種培養(yǎng)基中：①1/2MS+ 0.05 mg/L NAA；②1/2MS+ 0.20 mg/L NAA ；③1/2MS+0.05 mg/L IBA；④1/2MS+ 0.20 mg/L IBA。觀察根系生長(zhǎng)情況，30 d后統(tǒng)計(jì)生根率。

1.2.3馴化移栽。將已經(jīng)生根壯苗的試管苗進(jìn)行馴化移栽。移栽前將培養(yǎng)瓶置于室外煉苗4 d后，取出植株，洗凈培養(yǎng)基后晾干待植。基質(zhì)為泥炭、蛭石和珍珠巖按3∶1∶1混合，用百菌清800倍液消毒，將晾干后組培苗栽植至種植盤內(nèi)，成活前避免過(guò)量澆水導(dǎo)致?tīng)€根。日常管理中澆水見(jiàn)干見(jiàn)濕、可少量施用緩釋肥，栽培環(huán)境避免陽(yáng)光直射和過(guò)于蔭蔽。30 d后統(tǒng)計(jì)成活率，成活率=成活且生長(zhǎng)正常的苗數(shù)/移栽的苗數(shù)×100%。

1.3培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基pH 5.8，培養(yǎng)溫度（25±2） ℃，愈傷組織誘導(dǎo)前期黑暗培養(yǎng)10 d，其余階段光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時(shí)間12 h/d。

1.4觀測(cè)指標(biāo)及數(shù)據(jù)處理

愈傷組織誘導(dǎo)階段，觀測(cè)其誘導(dǎo)率及愈傷生長(zhǎng)情況；愈傷組織分化階段統(tǒng)計(jì)分化出芽時(shí)間、分化率及芽生長(zhǎng)情況；不定根誘導(dǎo)階段，觀測(cè)生根情況及生根率。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，同一列數(shù)值后不同小寫和大寫字母分別表示差異達(dá)0.05和0.01顯著水平。

2結(jié)果與分析

2.1葉片成熟度與發(fā)生愈傷組織的關(guān)系

經(jīng)過(guò)重復(fù)愈傷試驗(yàn)，在相同激素配比的培養(yǎng)基中，不同成熟度的帝玉露葉片愈傷發(fā)生時(shí)間有所不同，最先出愈的是幼嫩新葉，較最晚出愈的成熟老葉提前15 d左右，但愈傷少，成熟老葉產(chǎn)生的愈傷較多，但其污染率較新葉稍高。

2.2愈傷組織誘導(dǎo)

由表2可知，培養(yǎng)30 d后，培養(yǎng)基①和②中的愈傷組織生長(zhǎng)量較大，但質(zhì)地較疏松，呈黃白色或淡黃色，并產(chǎn)生一定程度玻璃化現(xiàn)象，在后續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中逐漸褐化。培養(yǎng)基③和④均能誘導(dǎo)質(zhì)地較佳的愈傷組織，但培養(yǎng)基④中的誘導(dǎo)率較培養(yǎng)基③誘導(dǎo)率高29.00%以上。培養(yǎng)基④中愈傷質(zhì)地較致密，呈黃綠色（圖1），外植體繼續(xù)培養(yǎng)后，所有愈傷組織生長(zhǎng)速度快，質(zhì)地較致密，顏色濃綠。由此可見(jiàn)，不同激素濃度配比對(duì)帝玉露誘導(dǎo)率的影響有顯著差異，對(duì)愈傷品質(zhì)的影響較為明顯，培養(yǎng)基④為愈傷誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基。

2.3愈傷組織分化

將前期誘導(dǎo)的愈傷組織黃綠色部分在無(wú)菌條件下切成0.5 cm×0.5 cm的愈傷塊，分別轉(zhuǎn)接至9種不同的分化培養(yǎng)基（表1）中繼續(xù)培養(yǎng)，30 d后愈傷組織繼續(xù)生長(zhǎng)且逐步開(kāi)始分化出芽，芽生長(zhǎng)情況見(jiàn)表3。結(jié)果表明，1、2、3、5、8、9號(hào)培養(yǎng)基中的愈傷組織在30～40 d內(nèi)不同程度地在芽點(diǎn)部位形成叢生芽，4、6、7號(hào)培養(yǎng)基中始終未見(jiàn)芽的形成。1、2號(hào)培養(yǎng)基中的愈傷組織生長(zhǎng)情況較佳，分化出的芽數(shù)量較多，5號(hào)和9號(hào)培養(yǎng)基中的效果相近。綜合分析可知，不同濃度激素和NaH2PO4配比處理間對(duì)愈傷分化的影響差異顯著，1（圖2）、2號(hào)培養(yǎng)基中的愈傷分化情況較佳，但從分化時(shí)間來(lái)看，1號(hào)培養(yǎng)基中分化出芽時(shí)間較短，可見(jiàn)1號(hào)培養(yǎng)基為愈傷組織最佳分化培養(yǎng)基。

2.4生根培養(yǎng)及馴化移栽

待分化出的芽長(zhǎng)到3～4片葉時(shí)，用鑷子將芽從愈傷組織掰下并插入生根培養(yǎng)基，沒(méi)入培養(yǎng)基深度約為植株1/3。培養(yǎng)30 d后，大部分植株產(chǎn)生數(shù)量、長(zhǎng)度、粗細(xì)不等的根系。不同處理生根率、平均根數(shù)、平均根長(zhǎng)及根的生長(zhǎng)情況均有所不同（表4），NAA和IBA對(duì)帝玉露生根影響差異不顯著，但不同濃度激素處理差異顯著。0.05 mg/L NAA和IBA能誘導(dǎo)根的形成，生根率分別為77.50%和72.50%，根生長(zhǎng)狀態(tài)較差；0.20 mg/L NAA和IBA處理，生根率均在90.00%以上。但從平均根數(shù)及根的生長(zhǎng)情況來(lái)看，0.20 mg/L NAA效果最佳，平均根數(shù)達(dá)4.8條，根較長(zhǎng)且粗壯（圖 3）。經(jīng)過(guò)生根壯苗的組培苗進(jìn)行馴化移栽效果較好（圖 4），成活率為96.00%。

3討論與結(jié)論

不同成熟度的帝玉露葉片對(duì)其發(fā)生愈傷有一定關(guān)系。成熟葉片的有機(jī)物質(zhì)積累較多，產(chǎn)生愈傷多、品質(zhì)較好，但生長(zhǎng)處于停滯階段，生命活動(dòng)較緩慢，所以發(fā)生愈傷的時(shí)間較晚。由于成熟葉片位置更低，直接接觸土壤或基質(zhì)，使其滅菌較為困難，故更容易發(fā)生污染。新生幼嫩葉片的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累較少，產(chǎn)生愈傷量相對(duì)較少，生長(zhǎng)旺盛，則其發(fā)生愈傷的時(shí)間更早。幼嫩葉片所處位置被外圍葉片包裹，與外界環(huán)境相對(duì)隔離，所以更容易得到無(wú)菌材料。但取用新生葉片對(duì)于母本植株影響較大，且其發(fā)生的愈傷品質(zhì)不及成熟葉片，綜合考慮使用植株底部的成熟葉片作為外植體更合適。激素是植物外植體愈傷組織誘導(dǎo)及分化的關(guān)鍵因子之一，不同的激素配比，其愈傷誘導(dǎo)及分化差異顯著[9-10]。帝玉露愈傷組織的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS + 2.00 mg/L 6-BA +0.20 mg/L NAA，與朱天華等的研究一致[11]，愈傷組織在低濃度的6-BA和NAA配比中增殖和分化情況較好，產(chǎn)生大量?jī)?yōu)質(zhì)愈傷組織，并配合較高濃度NaH2PO4有利于分化出芽，且芽的長(zhǎng)勢(shì)較好，與張燕珍[12]對(duì)卷莢相思的研究結(jié)果一致。試驗(yàn)中較高濃度的6-BA、NAA和不同濃度的NaH2PO4處理大多也能誘導(dǎo)出芽，只是誘導(dǎo)率及芽的狀態(tài)之間存在差異。在生根培養(yǎng)中使用1/2MS培養(yǎng)基取得了較好效果， 印證了大多數(shù)植物的生根能力在大量元素和微量元素濃度降低至1/2的培養(yǎng)基中更高這一結(jié)論 [13]。有報(bào)道多肉植物使用葉片作為外植體會(huì)因葉片水分多，滅菌后存活困難[14]。該研究表明，帝玉露的肉質(zhì)多漿葉片作為外植體進(jìn)行滅菌后并不受影響，幼嫩及成熟的葉片均能誘導(dǎo)出愈傷組織。以帝玉露葉片作為外植體建立組培快繁體系可避免使用花莖或子房作為外植體的時(shí)限性，可進(jìn)行周年培育獲得大量組培苗，突破自然條件的繁育限制，為高效優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)帝玉露組培苗、保存種質(zhì)資源、快速繁育及研究其同屬新品種提供技術(shù)支持。

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