輻射花粉誘導(dǎo)木薯無融合生殖及鑒定研究

孫琪 陳霞 賈澤沖 劉云豪 賴杭桂 陳松筆 朱文麗

摘 要 花粉誘導(dǎo)是獲得無融合生殖的一個(gè)重要途徑。本試驗(yàn)采用輻射花粉對(duì)雌花授粉進(jìn)行木薯無融合生殖活體誘導(dǎo)，獲得了由60Coγ射線輻射花粉誘導(dǎo)的孢子體無融合生殖種質(zhì)。結(jié)果表明：60Coγ射線輻射花粉誘導(dǎo)木薯無融合生殖的途徑是有效的，且輻射劑量及品種的選擇對(duì)木薯無融合生殖誘導(dǎo)具一定的影響。本次試驗(yàn)共收獲23株植株，通過對(duì)誘導(dǎo)子代的細(xì)胞學(xué)及共顯性EST-SSR分子標(biāo)記檢測(cè)，顯示其23株誘導(dǎo)子代為雜合二倍體；進(jìn)一步采用SRAP分子標(biāo)記對(duì)各子代的異質(zhì)雜合性或同質(zhì)雜合性鑒定，發(fā)現(xiàn)2株為SC5遺傳同質(zhì)體。

關(guān)鍵詞 木薯；輻射花粉；無融合生殖；倍性鑒定；分子標(biāo)記

中圖分類號(hào) S533 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Induction and Identification of Apomixis

by Radiation Pollen in Cassava

SUN Qi1， CHEN Xia1， JIA Zechong1， LIU Yunhao1， LAI Hanggui1 *， CHEN Songbi2， ZHU Wenli2

1 Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Tropical Crops Genetic Resources Institute， CATAS， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract Pollen induction is an important way to obtain apomixis. In this study， the pollen which radiated was used to pollinate with female flowers for inducing cassava apomixis in the living body， and acquired the sporophyte apomixis germplasmthe induced by the pollen that radiated under 60Coγ-ray. The results showed that： The way to induce cassava apomixis by 60Coγ-ray radiation pollen was effective， and the choice of radiation dose and variety had a certain influence on the induction of cassava apomixis. A total of 23 plants were harvested in this study， and the offsprings were detected by cytological and codominant EST-SSR markers， it showed that the 23 offsprings were heterozygous diploid； Furthermore， SRAP molecular markers were used to identify heterozygous heterozygosity or homozygous heterozygosity for each progeny， and two offsprings were found to be genetic homogeneity of SC5.

Key words Manihot esculenta Crantz； radiated pollen； apomixis； ploidy identification； molecular markers

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.08.001

無融合生殖（Apomixis）是指不經(jīng)過精卵融合即可形成胚從而進(jìn)行種子繁殖的方式， 是一種可介于有性生殖和無性生殖的特殊的生殖方式[1]。無融合生殖可分為無孢子生殖、孢子體無融合生殖和配子體無融合生殖三種類型，無孢子生殖和孢子體無融合生殖由胚珠細(xì)胞或大孢子母細(xì)胞有絲分裂形成胚囊，可產(chǎn)生與親代一致的體細(xì)胞遺傳同質(zhì)體，即二倍體無性種子；而配子體無融合生殖是指卵細(xì)胞未經(jīng)過受精過程而形成胚并發(fā)育為個(gè)體的生殖方式，產(chǎn)生的個(gè)體多為單倍體，加倍后可獲得穩(wěn)定一致的純合二倍體。因此，不同類型的無融合生殖遺傳特性在固定雜種優(yōu)勢(shì)、縮短育種年限、提供單倍體材料、積累優(yōu)良基因等具重要的生產(chǎn)意義和育種價(jià)值[1-2]。

木薯（Manihot esculenta Crantz）是全球三大塊根作物之一，是熱帶及亞熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)及能源作物。由于木薯為異花授粉，基因型高度雜合，生產(chǎn)上主要通過其種莖進(jìn)行無性繁殖。木薯的無融合生殖不僅能固定高度雜合的基因型，積累和傳播植物的優(yōu)良基因及簡(jiǎn)化雜交制種方法，對(duì)于具有高營(yíng)養(yǎng)的薯類等農(nóng)作物，通過無融合生殖還可切斷病毒的傳播[3]；若通過孤雌生殖創(chuàng)制單倍體或純合二倍體材料，則對(duì)木薯遺傳圖譜構(gòu)建、基因差異表達(dá)、QTL性狀定位等分子生物學(xué)研究具有重大意義。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，木薯的無融合生殖可通過種間雜交產(chǎn)生，Nassar和Freitas等相繼發(fā)現(xiàn)了木薯栽培種與野生種雜交后代無融合生殖現(xiàn)象的存在，并證實(shí)了木薯的兼性無融合生殖屬性，在胚胎學(xué)鑒定中發(fā)現(xiàn)其珠心為多胚結(jié)構(gòu)，并且受環(huán)境高度影響[3-7]。

育種實(shí)踐證明，花粉誘導(dǎo)是獲得植物無融合生殖的一個(gè)有效途徑，失活或變異花粉授粉后可以提高子房?jī)?nèi)激素水平，使果實(shí)膨大，促進(jìn)種子發(fā)育[8]。李春秋等[9]曾采用風(fēng)干后的花粉誘導(dǎo)獲得玉米無融合生殖植株。Bekir等[10]應(yīng)用核桃失活花粉與鮮蘋果花粉對(duì)Tokat-1核桃進(jìn)行混合蒙導(dǎo)授粉，無融合生殖座果率達(dá)6.4%。此外，研究者在核桃、蘋果、黃瓜、甜瓜等多種作物上進(jìn)行了輻射花粉授粉誘導(dǎo)，并獲得了單倍體后代[11-14]。本研究通過60Coγ射線輻射木薯花粉，采用輻射后的花粉與木薯雌花授粉，對(duì)授粉后雌花發(fā)育進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)比較不同輻射劑量及不同品種處理后稔實(shí)率和坐果率的差異，對(duì)誘導(dǎo)子代進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定及分子標(biāo)記檢測(cè)，成功篩選出木薯遺傳同質(zhì)體無融合生殖種質(zhì)。這對(duì)木薯生殖發(fā)育特性及無融合生殖育種研究具有重要意義，并可能為進(jìn)一步誘導(dǎo)木薯卵細(xì)胞孤雌生殖途徑提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為木薯華南5號(hào)（SC5）、華南7號(hào)（SC7）、華南10號(hào)（SC10） 3個(gè)栽培品種，由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所提供。于2016年3月種植采用種莖無性繁殖方式種植于海南大學(xué)儋州校區(qū)農(nóng)科基地，每品種種植100株，株行距為1.0 m×1.5 m。試驗(yàn)所用引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 花粉誘導(dǎo)無融合生殖方法 開花前1 d采集木薯供體材料的雄花（SC5、SC7、SC10），裝入防水紙袋，雄花在海南金原新技術(shù)有限公司進(jìn)行60Coγ射線輻射（輻射劑量梯度為500～600、800～900 Gy）處理后，將雄花進(jìn)行低溫干燥保存。當(dāng)天上午9 ： 00左右選擇即將開放的雌花進(jìn)行套袋隔離，于下午13 ： 00～14 ： 00用輻射過的雄花對(duì)SC5、SC10剛開放的雌花柱頭進(jìn)行異品種授粉后套袋隔離，并掛牌標(biāo)記親本組合、數(shù)量和日期。授粉2～3 d后解除套袋，開花后7～10 d子房膨大且形成幼果時(shí)統(tǒng)計(jì)稔實(shí)率，100 d左右收獲成熟果實(shí)并統(tǒng)計(jì)其坐果率，收集種子播種于育苗盤中。

1.2.2 花粉誘導(dǎo)子代倍性鑒定 采用美國(guó)BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀（Flow Cytometry）對(duì)誘導(dǎo)子代植株葉片的DNA含量快速檢測(cè)，使用CellQuest Pro軟件進(jìn)行分析。木薯嫩葉細(xì)胞染色體觀察參照張健等[15]木薯葉片染色體制片技術(shù)，具體流程為：取材時(shí)間為上午8 ： 30～10 ： 00，用0.1%秋水仙素與0.002 mol/L 8-羥基喹啉混合液室溫預(yù)處理3 h，經(jīng)固定液（無水酒精 ∶ 氯仿 ∶ 冰醋酸=6 ∶ 3 ∶ 1）固定，用1 mol/L鹽酸60 ℃下解離8 min，再用改良苯酚品紅染色壓片鏡檢，可取得良好的分裂相效果。

1.2.3 EST-SSR分子標(biāo)記鑒定純合體和雜合體

利用EST-SSR特異性地代表一個(gè)基因的“表達(dá)序列標(biāo)簽”，對(duì)木薯誘導(dǎo)子代的純合性和雜合性進(jìn)行鑒定。首先，以親本DNA作為模板，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選出呈現(xiàn)共顯性的EST-SSR標(biāo)記引物，以顯示為2條帶對(duì)應(yīng)1對(duì)雜合等位基因。再以子代的DNA作為模板，用篩選好的標(biāo)記引物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將擴(kuò)增出的條帶與親本的條帶進(jìn)行比對(duì)，由于SSR為共顯性遺傳，所以擴(kuò)增出2條帶的視其為雜合，擴(kuò)增出1條帶的視其為純合[16-17]。具體操作參照韋祖生等[18]木薯EST-SSR標(biāo)記方法。

1.2.4 SRAP分子標(biāo)記鑒定異質(zhì)雜合性或同質(zhì)雜合性 利用SRAP對(duì)木薯誘導(dǎo)子代和親代的多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行比較檢測(cè)，可對(duì)木薯無融合生殖的異質(zhì)雜合性或同質(zhì)雜合性進(jìn)行鑒定。具體步驟參照齊蘭等[19]木薯SRAP標(biāo)記方法稍加改進(jìn)：①采用改良CTAB法提取葉片基因組DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性及濃度，稀釋到工作液濃度20 ng/μL，保存在-20 ℃冰箱中備用；②用親本DNA對(duì)64對(duì)SRAP引物進(jìn)行篩選，篩選出目的引物后依據(jù)SRAP反應(yīng)體系（共20 μL，含2×PCR mix 10 μL、ddH2O 6 μL、Forward primer 1 μL、Reverse primer 1 μL、DNA模板2 μL）對(duì)子代DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；③取8 μL PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣，用1倍TAE緩沖液，在100 V電壓下電泳40 min后，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用MS Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，使用SPSS 17.0，DPS7.05軟件進(jìn)行方差分析以及多重比較分析。數(shù)據(jù)顯著性差異分析采用Student-Newman -Keulq法、u測(cè)驗(yàn)和t測(cè)驗(yàn)等進(jìn)行比較，水平為p =0.05、p=0.01。釆用標(biāo)記字母的多重比較結(jié)果表示方法標(biāo)出各差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻射花粉誘導(dǎo)木薯無融合生殖稔實(shí)率和坐果率的統(tǒng)計(jì)

2.1.1 不同輻射劑量的花粉誘導(dǎo)對(duì)木薯無融合生殖頻率的影響 如表1所示，自然授粉的木薯雌花（CK）稔實(shí)率及坐果率極顯著高于輻射誘導(dǎo)的稔實(shí)率及坐果率，經(jīng)60Coγ射線輻射后的花粉用以雌花授粉造成稔實(shí)率及坐果率大幅降低；而輻射劑量的大小對(duì)木薯的稔實(shí)率和坐果率也有較大影響，其中500～600 Gy輻射花粉要顯著高于800～900 Gy輻射花粉誘導(dǎo)的稔實(shí)率和坐果率，說明較低的輻射劑量更有利于授粉后木薯子房的生長(zhǎng)發(fā)育。而隨著輻射劑量的增大，誘導(dǎo)后木薯的稔實(shí)率和結(jié)實(shí)率降低，說明隨著輻射劑量的增加會(huì)引起花粉變異加大，而鑒定結(jié)果則顯示較高劑量的輻射更有利于無融合生殖的誘導(dǎo)。

2.1.2 不同品種對(duì)輻射花粉誘導(dǎo)無融合生殖頻率的影響 表2統(tǒng)計(jì)結(jié)果所示，用輻射后的木薯花粉對(duì)SC5和SC10兩個(gè)品種進(jìn)行授粉，授粉后SC5的稔實(shí)率和坐果率顯著高于SC10的稔實(shí)率和坐果率。試驗(yàn)表明，在采用物理方法60Coγ射線處理花粉誘導(dǎo)木薯無融合生殖時(shí)，不同基因型的材料不僅對(duì)誘導(dǎo)無融合生殖稔實(shí)率和坐果率產(chǎn)生影響，且之后篩選出的無融合生殖種質(zhì)來源于SC5品種，因此誘導(dǎo)過程中對(duì)品種材料的選擇是必要的。

2.2 花粉誘導(dǎo)子代出苗率統(tǒng)計(jì)

本次試驗(yàn)收集誘導(dǎo)后的木薯種子共83粒，按粒播種于育苗盤正常管理，共有23株出苗，其中SC5有14株，SC10有9株。出苗率為27.7%。圖1 為輻射花粉誘導(dǎo)獲得的木薯無融合生殖子代植株。

2.3 木薯誘導(dǎo)子代的倍性鑒定

對(duì)23株木薯輻射花粉誘導(dǎo)的子代種苗的葉片進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)及染色體倍性檢測(cè)，鑒定結(jié)果表明，23株花粉誘導(dǎo)子代均為二倍體，葉片DNA含量與正常二倍體對(duì)照相同，體細(xì)胞染色體數(shù)2n=2x=36（圖2）。該批子代植株中未發(fā)現(xiàn)單倍體或多倍體。

2.4 EST-SSR標(biāo)記鑒定子代的純合性

2.4.1 EST-SSR引物篩選 以SC5和SC10作為模板對(duì)159對(duì)木薯EST-SSR標(biāo)記引物進(jìn)行篩選，共篩選出6對(duì)引物，對(duì)應(yīng)6對(duì)等位基因，因此可以選擇該6對(duì)引物來鑒定木薯輻射花粉誘導(dǎo)子代的基因型純合性。表3為篩選的6對(duì)EST-SSR引物及其擴(kuò)增條件。

2.4.2 誘導(dǎo)子代植株的純合性鑒定 利用篩選出的6對(duì)條帶清晰的雙條帶EST-SSR引物對(duì)23株子代植株的純合性進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，14株SC5及9株SC10的誘導(dǎo)子代在6對(duì)引物中均擴(kuò)增出相應(yīng)的雙條帶型，這表明在該6對(duì)等位基因位點(diǎn)表現(xiàn)為雜合基因型，可知這23株木薯誘導(dǎo)子代均為雜合體植株，沒有出現(xiàn)單條帶型的卵細(xì)胞孤雌生殖單倍體或純合二倍體植株。圖3為引物CESR-0831 對(duì)SC5誘導(dǎo)子代的鑒定結(jié)果，圖4為引物CESR-0604對(duì)SC10誘導(dǎo)子代的鑒定結(jié)果。

2.5 SRAP分子標(biāo)記鑒定異質(zhì)雜合性或同質(zhì)雜合性

2.5.1 SRAP引物篩選 利用SC5和SC10作為模板對(duì)64對(duì)木薯SRAP標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中SC5作為模板篩選出穩(wěn)定性好、條帶清晰且有差異擴(kuò)增的18對(duì)引物，以SC10作為模板篩選出了15對(duì)條帶清晰且多態(tài)性明顯的引物。SRAP標(biāo)記引物篩選結(jié)果見表4。

2.5.2 誘導(dǎo)子代的SRAP標(biāo)記鑒定 利用18對(duì)SC5及15對(duì)SC10篩選出的SRAP標(biāo)記引物對(duì)23 株誘導(dǎo)子代進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：14株SC5的誘導(dǎo)子代中有12株與親本SC5帶型具明顯差異，其中2株由800～900 Gy 60Coγ射線輻射誘導(dǎo)的子代與親本SC5帶型一致；而SC10的9株誘導(dǎo)子代均與親本SC10的帶型具明顯差異（圖5、6）。由此可以判斷本試驗(yàn)60Coγ射線輻射花粉誘導(dǎo)獲得了2株與親本SC5基因型一致的遺傳同質(zhì)體，該2株遺傳同質(zhì)體為木薯的無融合生殖途徑產(chǎn)生，無融合生殖在誘導(dǎo)子代的發(fā)生頻率為8.7%。

3 討論

采用物理或化學(xué)及生物學(xué)方法誘導(dǎo)植物無融合生殖已有許多成功事例[20]，但木薯無融合生殖的人工干預(yù)誘導(dǎo)國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。在通過種間雜交獲得木薯無融合生殖種質(zhì)報(bào)道中，Nassar[21]認(rèn)為，木薯的無融合生殖可能由于發(fā)生不正常的減數(shù)分裂所導(dǎo)致，或由于其他因素激活木薯中的某些基因，這些基因會(huì)使一些位于珠心或有性胚囊內(nèi)的體細(xì)胞發(fā)育形成無孢子生殖胚囊，從而形成了木薯的二倍體孢子生殖或無孢子生殖類型的兼性無融合生殖現(xiàn)象。由于木薯自然無融合生殖頻率極低，進(jìn)行人工干預(yù)提高木薯無融合生殖頻率具備較好的應(yīng)用前景。

不同植物在無融合生殖的機(jī)理方面存在很大差異，無融合生殖誘導(dǎo)會(huì)受多重因素的影響，如不同誘導(dǎo)技術(shù)、不同基因型材料、不同生育期、濃度劑量、外界環(huán)境因素等[22]。本試驗(yàn)過程證實(shí)，木薯花粉輻射后誘導(dǎo)無融合生殖受輻射劑量和不同品種材料的影響，60Coγ 800～900 Gy劑量的誘導(dǎo)效果優(yōu)于500～600 Gy，且SC5品種誘導(dǎo)效果優(yōu)于SC10。所以，適宜輻射劑量的篩選及品種材料的選擇是必要的，這與許多相關(guān)研究觀點(diǎn)一致，如γ射線照射番茄花粉的有效劑量為5 000～7 000 R、小麥5 000～8 000 R、煙草5 500 R，X射線照射煙草的有效劑量為1 500 R[17]；而在甜瓜、黃瓜、核桃、胡楊等輻射花粉的誘導(dǎo)表明，不同基因型材料的差異會(huì)影響無融合生殖的誘導(dǎo)頻率[8， 23-25]。

由于無融合生殖類型多樣，所發(fā)生的機(jī)制也極為復(fù)雜，輻射花粉誘導(dǎo)大多應(yīng)用于單倍體育種[11-14]，目前輻射花粉誘導(dǎo)技術(shù)機(jī)制還不完全清楚，無融合生殖遺傳同質(zhì)體的產(chǎn)生主要來源于無孢子生殖或二倍孢子體生殖途徑，其基因型與親本相同，子代繼承了親代固有的遺傳特性，形成遺傳上穩(wěn)定的可由種子繁殖的胚囊體細(xì)胞或孢原細(xì)胞的無性后代[26]。另外，試驗(yàn)過程出現(xiàn)21株帶型與親本對(duì)照具明顯差異的二倍體誘導(dǎo)子代，經(jīng)EST-SSR檢測(cè)并未發(fā)現(xiàn)純合體現(xiàn)象，因此該21株可判斷為異質(zhì)雜合體，即由正常雜交所產(chǎn)生的雜種子代。不排除輻射后變異花粉也有可能參與受精，導(dǎo)致出現(xiàn)異質(zhì)雜合體現(xiàn)象，或者與木薯的兼性無融合生殖有關(guān)[3]。

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