新煙堿類殺蟲劑對(duì)中華蜜蜂蔗糖反應(yīng)行為的影響

李 夢(mèng) 和靜芳 李志國(guó) 蘇松坤

（福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福州350002）

新煙堿類殺蟲劑對(duì)中華蜜蜂蔗糖反應(yīng)行為的影響

李 夢(mèng) 和靜芳 李志國(guó) 蘇松坤

（福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福州350002）

新煙堿類殺蟲劑（neonicotinoid insecticide）目前已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)應(yīng)用最廣泛的一類殺蟲劑。此類殺蟲劑通過作用于昆蟲的乙酰膽堿受體，釋放乙酰膽堿受體抑制劑，阻礙昆蟲神經(jīng)傳導(dǎo)，影響昆蟲正常生理行為，最終導(dǎo)致昆蟲麻痹死亡[1]。本文通過測(cè)定吡蟲啉與噻蟲胺兩種新煙堿類殺蟲劑對(duì)中華蜜蜂（Apis cerana cerana）24 h內(nèi)半數(shù)致死劑量（median lethal dose，LD50）[2]，評(píng)估此類殺蟲劑對(duì)中華蜜蜂的急性致死毒性。并通過統(tǒng)計(jì)經(jīng)過亞致死劑量（sub-lethal dose）處理的中華蜜蜂，經(jīng)過2 h、24 h和48 h后的伸吻反應(yīng)率，從而進(jìn)一步探究新煙堿類殺蟲劑對(duì)中華蜜蜂行為的影響。

中華蜜蜂；新煙堿類殺蟲劑；吡蟲啉；噻蟲胺；伸吻反應(yīng)

1 研究背景

新煙堿類殺蟲劑是一類新興的農(nóng)藥，具有高效率、高選擇性、高持效性、對(duì)哺乳動(dòng)物低毒等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。新煙堿類殺蟲劑包括吡蟲啉（imidacloprid）、啶蟲脒（acetamiprid）、噻蟲胺（clothianidin）、噻蟲嗪（thiamethoxam）、噻蟲啉（thiacloprid）、呋蟲胺（dinotefuran）及烯啶蟲胺（nitenpyram）。這類殺蟲劑在田間的大量使用，不僅可以有效防控有害昆蟲，對(duì)于不屬靶標(biāo)的授粉類昆蟲也有一定危害[3,4]。蜜蜂作為社會(huì)性昆蟲的模式生物，在采蜜和采粉的過程中，會(huì)接觸到暴露在空氣中或者植物表面的殘留殺蟲劑，進(jìn)而影響蜜蜂的行為、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝及免疫系統(tǒng)[5]。關(guān)于新煙堿類殺蟲劑對(duì)蜜蜂影響的報(bào)道多集中在西方蜜蜂，對(duì)于中華蜜蜂影響的研究甚少。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院中華蜜蜂實(shí)驗(yàn)蜂群3群，飼養(yǎng)盒，飼喂器，蔗糖，吡蟲啉（Sigma，2016），噻蟲胺（Sigma，2016），丙酮，膠帶，離心管。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 農(nóng)藥的制備

將吡蟲啉和噻蟲胺分別溶解于丙酮中，配制成500ng/μl的母液。將母液溶解于30%的糖水中，分別配制成含有吡蟲啉和噻蟲胺的糖水。

吡蟲啉的濃度分別為：0.5 ng/μl，1.0 ng/μl，1.5 ng/ μl，2.0 ng/μl，2.5 ng/μl，丙酮對(duì)照組濃度分別為：0.001 ng/μl，0.002 ng/μl，0.003 ng/μl，0.004 ng/μl，0.005 ng/ μl；噻蟲胺的濃度分別為：0.1 ng/μl，0.2 ng/μl，0.3 ng/ μl，0.4 ng/μl，0.5 ng/μl，丙酮對(duì)照組濃度分別為：0.0002 ng/μl，0.0004 ng/μl，0.0006 ng/μl，0.0008 ng/μl，0.001 ng/μl。

2.2.2 LD50的測(cè)定

在3個(gè)實(shí)驗(yàn)蜂群中分別收集100只中華蜜蜂，經(jīng)冷凍麻醉后，每只蜜蜂飼喂2 μl含有農(nóng)藥的糖水，每個(gè)濃度飼喂20只，分別放入飼養(yǎng)盒中恢復(fù)（對(duì)照組與處理組處理方法相同，每個(gè)蜂群重復(fù)三次）。然后，將飼喂器中裝入足夠量的30%的糖水插入飼養(yǎng)盒。將飼養(yǎng)盒放入恒溫恒濕箱（30℃,RH:70%）培養(yǎng)24 h后，統(tǒng)計(jì)蜜蜂死亡數(shù)量，計(jì)算死亡率。

2.2.3 亞致死劑量的確定

分別用吡蟲啉和噻蟲胺對(duì)中華蜜蜂24 h內(nèi)LD50/ 2，LD50/5，LD50/10的劑量飼喂中華蜜蜂（方法同2.2.2），24 h后統(tǒng)計(jì)死亡數(shù)量，并計(jì)算死亡率。

2.2.4 梯度PER

圖1 蜜蜂捆綁方法

圖2 蜜蜂飼喂方法

在實(shí)驗(yàn)蜂群中收集若干只蜜蜂，經(jīng)冷凍麻醉后，用膠帶將蜜蜂固定在準(zhǔn)備好的離心管中（只允許蜜蜂的頭和觸角活動(dòng)，圖1、2），放入恒溫恒濕箱恢復(fù)2 h。然后，處理組每只蜜蜂飼喂含有亞致死劑量殺蟲劑的糖水，對(duì)照組每只蜜蜂飼喂含有與處理組相同質(zhì)量丙酮的糖水，放入恒溫恒濕箱中培養(yǎng)。分別在2 h，24 h和48 h后統(tǒng)計(jì)每只蜜蜂對(duì)0.1%，0.3%，1%，3%，10%和30%濃度糖水的伸吻反應(yīng)情況，并計(jì)算伸吻反應(yīng)率（圖3）。

3 數(shù)據(jù)分析

3.1 LD50的測(cè)定

通過統(tǒng)計(jì)經(jīng)過處理的蜜蜂24 h后的數(shù)量，用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析得出，吡蟲啉與噻蟲胺對(duì)中華蜜蜂24 h內(nèi)LD50分別為1.942 ng/bee和0.557 ng/bee。

圖3 吡蟲啉與噻蟲胺對(duì)中華蜜蜂伸吻反應(yīng)率的影響（*代表差異性顯著，0.01＜p＜0.05；**代表差異性極顯著，p＜0.01)

3.2 亞致死劑量的確定

通過統(tǒng)計(jì)經(jīng)過亞致死劑量處理的蜜蜂的死亡數(shù)量與對(duì)照組比較，發(fā)現(xiàn)LD50/2處理組經(jīng)過24 h和48 h后與對(duì)照組死亡率都無顯著性差異。因此，將LD50/2作為處理蜜蜂的亞致死劑量。

4 結(jié)果與討論

通過新煙堿類殺蟲劑對(duì)中華蜜蜂24 h內(nèi)LD50的數(shù)據(jù)分析，噻蟲胺的毒性明顯大于吡蟲啉，說明第二代新煙堿類殺蟲劑對(duì)于蜜蜂等授粉昆蟲毒性更大，藥效時(shí)間更長(zhǎng)。但通過對(duì)西方蜜蜂LD50測(cè)定的實(shí)驗(yàn)中看出，不同的實(shí)驗(yàn)中測(cè)得LD50不盡相同，這可能是由于實(shí)驗(yàn)條件如氣候、溫濕度、測(cè)定方法等因素及世界范圍內(nèi)蜜蜂遺傳背景的差異，而造成新煙堿類殺蟲劑對(duì)蜜蜂急性致死劑量的差異性。

通過PER實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，經(jīng)過吡蟲啉處理的中華蜜蜂，2 h后，處理組對(duì)0.3%，1%和3%三個(gè)濃度的糖水反應(yīng)率比對(duì)照組高，但差異不顯著。其它經(jīng)過處理的蜜蜂與對(duì)照組相比，伸吻反應(yīng)率都有不同程度的下降。其中吡蟲啉處理組與噻蟲胺處理組經(jīng)過24 h后，其伸吻反應(yīng)率與對(duì)照組相比明顯下降，并表現(xiàn)出差異極顯著。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，吡蟲啉在進(jìn)入昆蟲體內(nèi)20 min后，可代謝70%，經(jīng)過4～5 h后可全部代謝。其中吡蟲啉的五種代謝產(chǎn)物中，有兩種含有與吡蟲啉相同的藥效官能團(tuán)，繼續(xù)作用于昆蟲。但經(jīng)過36 h后，昆蟲可通過自身免疫機(jī)制消耗吡蟲啉的代謝物[6-8]。噻蟲胺作為第二代新煙堿類殺蟲劑，雖與吡蟲啉具有相同的藥效官能團(tuán)，但其代謝產(chǎn)物中可全部保留能與昆蟲乙酰膽堿受體結(jié)合的藥效基團(tuán)[9]。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這種觀點(diǎn)，經(jīng)過吡蟲啉處理的蜜蜂，在48 h后，對(duì)照組與處理組均表現(xiàn)出差異不顯著。而噻蟲胺處理組經(jīng)過48 h后與對(duì)照組相比，對(duì)0.1%，3%，10%和30%濃度的糖水表現(xiàn)出差異極顯著。說明噻蟲胺對(duì)于蜜蜂的藥效時(shí)間比吡蟲啉長(zhǎng)。

隨著新煙堿類殺蟲劑不斷更新?lián)Q代，其毒性對(duì)于蜜蜂來說也逐漸增大。更應(yīng)引起我們關(guān)注的是，在面對(duì)含有新煙堿類殺蟲劑的蜜粉源和不含有殺蟲劑的蜜粉源時(shí)，蜜蜂更傾向于采集含有殺蟲劑的植物蜜粉源[5]，這就使蜜蜂在采集過程中接觸殺蟲劑的可能性增加，從而影響蜜蜂健康。

中華蜜蜂是我國(guó)的特有蜂種，其對(duì)殺蟲劑等農(nóng)藥的抵抗力很低，我們?cè)谘芯啃聼焿A類殺蟲劑對(duì)中華蜜蜂影響的同時(shí)，可進(jìn)一步揭示其內(nèi)在的免疫機(jī)制和生理防御功能，為今后更好的平衡農(nóng)業(yè)發(fā)展與生態(tài)環(huán)境保護(hù)提供理論基礎(chǔ)。

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The effects of sucrose behavior responses on Apis cerana cerana by neonicotionid insecticides

Li Meng,He Jingfang,Li Zhiguo,Su Songkun

(College of Bee Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002)

Neonicotinoid insecticides（neonicotinoids）are now the most widely used insecticides in the world.The neonicotinoid insecticide acts on the nicotinic acetylcholine receptors(nAChRs)of insects,releasing ach receptor inhibitor and preventing the conduction of neuro.Our study measured the LD50in 24 h of the Apis cerana cerana which exposure on the imidacloprid and clothianidin to assess the acute toxicity death of Apis cerana cerana.Then we made the Apis cerana cerana exposure on the insecticides sub-lethal dose,after 2 h、24 h、and 48 h.We collected the data of PER to explain the effect of neonicotinoid insecticides on the Apis cerana’s behaivour.

Apis cerana cerana，neonicotinoid insecticide，imidacloprid，clothianidin;proboscis extension response(PER)

國(guó)家現(xiàn)代蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-45）

李夢(mèng)（1990-），女，在讀碩士，主要研究方向?yàn)樾聼焿A類殺蟲劑對(duì)蜜蜂健康的影響，E-mail：276360394@qq.com

蘇松坤（1970-)，研究員，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)槊鄯淇茖W(xué)，E-mail：365634176@qq.com