甘薯發(fā)酵提取檸檬酸中黑曲霉發(fā)酵影響因素的研究

尹元金，羅 鉛

(北方民族大學(xué) 化工學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

檸檬酸又名枸櫞酸，它是存在于檸檬等水果中的一種有機酸，學(xué)名為 3-羥基3-羧基戊二酸。檸檬酸具有令人愉快的酸味，它入口爽快，無后酸 味，安全無毒，是發(fā)酵法生產(chǎn)的最重要有機酸，廣泛應(yīng)用于食品、化工、醫(yī)藥、日化、紡織、電子、建筑、鑄造等行業(yè)這[1]。檸檬酸為無色半透明晶體或白色顆?；虬咨Y(jié)晶性粉末，無臭、味極酸，易溶于水、乙醇、乙醚等[2]。天然檸檬酸在自然界中分布很廣，天然的檸檬酸主要存在于植物如檸檬、梅子、菠蘿等水果中；而現(xiàn)在所用的人工合成的檸檬酸主要是用一些含糖物質(zhì)進行發(fā)酵而制得的。

1 檸檬酸發(fā)酵原料及其生產(chǎn)方法

1.1 檸檬酸發(fā)酵原料

糖類物質(zhì)在自然界屬于可再生資源；而其資源也比較豐富。但在工業(yè)上選擇原料要從多個方面綜合考慮，例如：經(jīng)濟合理、技術(shù)可行、資源豐富、易管、易購、易運、三廢等。

此次發(fā)酵原料—甘薯，屬于糖類。

1.2 檸檬酸發(fā)酵和提取方法

1.2.1 發(fā)酵

發(fā)酵方法有深層法、表面法、固體法、半固體法、生化反應(yīng)器法。

微生物發(fā)酵檸檬酸是典型的好氧發(fā)酵。而現(xiàn)在最具優(yōu)勢的發(fā)酵方法是黑曲霉菌種的深層發(fā)酵[3]，這種方法擁有較為可觀的檸檬酸產(chǎn)量。

1.2.2 提取

提取方法有鈣鹽離子交換法、溶劑萃取法、全離子交換法、連續(xù)離子交換法、色譜離子交換法、電溶析法、直接提取法[4]。我們此次所用的是鈣鹽離子交換法，它是當(dāng)前世界上檸檬酸工業(yè)最廣泛采取的工藝，安全性高，但有石膏廢渣。

2 甘薯原料發(fā)酵實驗工藝

2.1 主要儀器及藥品

儀器：電子天平、發(fā)酵罐、立式滅菌鍋、恒溫水浴鍋、燒杯、試管、溫度計、精確pH試紙、堿式滴定管、布氏漏斗、抽濾機、干燥箱。

藥品：NaOH溶液、1mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、酚酞、淀粉酶、瓊脂、葡萄糖、甘薯、硫酸銨溶液、無水乙醇、濃硫酸溶液、氯化鈣、無菌水、氨水。

2.2 實驗研究

2.2.1 初糖濃度對檸檬酸產(chǎn)酸的影響

在無菌干燥的情況下，取5個錐形瓶，將發(fā)酵液平均分配其中，并調(diào)整其發(fā)酵液初始糖濃度分別為 10%、14%、18%、20%，24%，按 10%的接種量接種黑曲霉菌種，在(35±1)℃的溫度下進行檸檬酸發(fā)酵，發(fā)酵48 h，每組試驗做三個平行試驗，然后分別測定發(fā)酵液產(chǎn)酸量求其平均值，得出最終的產(chǎn)酸量，從而確定該因素對檸檬酸發(fā)酵的影響。

2.2.2 溫度對檸檬酸發(fā)酵的影響

在無菌干燥的情況下，取6個錐形瓶，將發(fā)酵液平均分配其中，并調(diào)整發(fā)酵液初始糖濃度18%，按10%的接種量接種黑曲霉，分別在 30、33、35、37、40、42℃溫度下，進行檸檬酸發(fā)酵，發(fā)酵 48h，每組試驗做三個平行試驗，然后分別測定發(fā)酵液產(chǎn)酸量求其平均值，得出最終的產(chǎn)酸量，從而確定該因素對檸檬酸發(fā)酵的影響。

2.2.3 接種量對檸檬酸發(fā)酵的影響

在無菌干燥的情況下，取5個錐形瓶，將發(fā)酵液平均分配其中，并調(diào)整發(fā)酵液初始糖濃度 18%，分別按 6%，8%，10%，12%，14%的接種量接種黑曲霉，在(35±1)℃的溫度下進行檸檬酸發(fā)酵，發(fā)酵48 h，每組試驗做三個平行試驗，然后分別測定發(fā)酵液產(chǎn)酸量求其平均值，得出最終的產(chǎn)酸量，從而確定該因素對檸檬酸發(fā)酵的影響。

2.2.4 pH值對檸檬酸發(fā)酵的影響

在無菌干燥的情況下，取6個錐形瓶，將發(fā)酵液平均分配其中，并調(diào)整發(fā)酵液初始糖濃度 18%，按 10%的接種量接種黑曲霉，分別在pH值為3.2、3.7、4.2、4.7、5.2、5.7的情況下進行檸檬酸發(fā)酵，發(fā)酵72 h，每組試驗做兩組平行試驗，測定最后的產(chǎn)酸然后求其平均值，從而確定該因素對檸檬酸發(fā)酵的影響。

2.3 檢測方法

(1)檸檬酸測定方法：(粗測法)采用 0.1000 mol/L 氫氧化鈉溶液滴定。

(2)pH 值測定：精密 pH 試紙測定。

(3)還原糖測定：還原糖測定儀法[5]。

(4)總糖測定：快速測定法[6]。

(5)糖酸轉(zhuǎn)化率計算公式如下[7]:

式中：C-最終檸檬酸酸度(g/100 mL)；

A-發(fā)酵液起糖濃度(g/100 mL)；

B-發(fā)酵結(jié)束糖濃度(g/100 mL)。

(6)產(chǎn)酸速率計算公式如下：

式中：C1-發(fā)酵最高酸度(g/100 mL)；

C2-發(fā)酵起始酸度(g/100 mL)；

T-總發(fā)酵時間(h)。

3 結(jié)果與討論

3.1 初糖對產(chǎn)酸的影響

發(fā)酵液初糖濃度的高低直接影響到黑曲霉菌體的生長與發(fā)育，而檸檬酸的黑曲霉菌體的生長與發(fā)育影響了檸檬酸的產(chǎn)率及糖酸轉(zhuǎn)化率，所以發(fā)酵液初糖濃度的高低是檸檬酸產(chǎn)率和糖酸轉(zhuǎn)化率的一個重要影響因素。從黑曲霉發(fā)酵檸檬酸過程來看，初糖濃度過高會對孢子的生長發(fā)育起著抑制的作用；過低又會使菌絲球過于太大，且其形狀也不規(guī)則。

表1 發(fā)酵液初糖含量對產(chǎn)酸的影響

從表1可以看出，黑曲霉在發(fā)酵液初糖濃度低于18 g/100 mL時，糖酸轉(zhuǎn)化率就一直保持在 90%以上；黑曲霉在發(fā)酵液初糖濃度高于18 g/100 mL時，隨著其濃度的升高，糖轉(zhuǎn)化率不斷降低。同時，可以看出黑曲霉在發(fā)酵液初糖濃度高于或低于18 g/100 mL時，其產(chǎn)酸速率及檸檬酸濃度都會一直降低。因為發(fā)酵液初糖濃度在18 g/100 mL時，其產(chǎn)酸率及檸檬酸濃度最高，殘?zhí)菨舛戎挥?.47 g/100 mL，糖轉(zhuǎn)化率也高達91.12%，所以從各方面綜合考慮，選擇發(fā)酵液初糖濃度在18 g/100 mL時最為合適。

3.2 接種量對檸檬酸產(chǎn)量的影響

檸檬酸發(fā)酵的接種量，直接影響著檸檬酸發(fā)酵的產(chǎn)酸量。如果發(fā)酵接種的菌絲球太多，就會使菌絲球的形狀不規(guī)則，導(dǎo)致發(fā)酵液濃度過大，影響溶氧量使產(chǎn)率下降；而發(fā)酵接種的菌絲球太少，就會使發(fā)酵過程中發(fā)酵的效率不夠，從而影響糖酸的轉(zhuǎn)化率[8]。所以尋找出最佳菌絲球接種量是研究檸檬酸產(chǎn)量的一個重要課題。菌絲球接種量對檸檬酸發(fā)酵產(chǎn)酸的影響。

圖1 接種量對檸檬酸產(chǎn)量的影響

由圖1可見，黑曲霉發(fā)酵檸檬酸時，最開始時產(chǎn)酸量會隨著黑曲霉的接種量增加而增加，但是如果黑曲霉的接種量超過 10%，則產(chǎn)酸量反而會隨著黑曲霉的接種量增加而降低。所以在實驗中控制發(fā)酵接種量在10%左右，即可以達到最佳的發(fā)酵結(jié)果。

3.3 溫度對產(chǎn)酸率的影響

由于糖化酶的活性直接影響了產(chǎn)物的積累，而溫度對酶的活性影響很大，所以合適的溫度對檸檬酸的產(chǎn)酸量十分重要。對于糖化酶及大多數(shù)酶來說，溫度越高，則酶的活性越好，但酶又是蛋白質(zhì)，會隨著溫度的升高而逐步變性，所以說溫度對糖化酶的影響會存在一個最適溫度。同樣，在檸檬酸發(fā)酵過程中，如果發(fā)酵溫度過低則糖化酶的活性低，則會使菌體生長緩慢難以完成對原料的轉(zhuǎn)化；但是發(fā)酵的溫度太高，就容易引起菌體老化過快導(dǎo)致發(fā)酵后勁不足。

圖2 發(fā)酵溫度對檸檬酸產(chǎn)量的影響

由圖2可以看出，隨著溫度的升高，檸檬酸的產(chǎn)量一直升高，但是在溫度升到35℃左右時，雖然檸檬酸的含量仍會上升，但其上升趨勢大幅度減小。所以綜合能源利用率等方面的考慮，黑曲霉的發(fā)酵溫度應(yīng)控制在(35±1)℃為宜。

3.4 pH值對檸檬酸產(chǎn)量的影響

檸檬酸深層發(fā)酵過程中pH值高低直接影響著生產(chǎn)菌(黑曲霉)的代謝活動以及檸檬酸的合成，同時在發(fā)酵過程中各種酶促反應(yīng)也需要在適宜的pH值下進行，因此發(fā)酵液的pH值變化是發(fā)酵過程中一個重要的控制指標(biāo)[9]。

3.4.1 發(fā)酵液初始pH值對檸檬酸發(fā)酵的影響

對于發(fā)酵工藝來說，調(diào)節(jié)合適的發(fā)酵初始pH值是十分重要的。特別是像檸檬酸發(fā)酵這種以淀粉作為發(fā)酵原料的發(fā)酵，發(fā)酵液初始pH值的高低會直接影響到菌體糖化酶的活力[10]。初始pH值過低，會直接導(dǎo)致糖化酶活性低，使淀粉不能完全水解。反之如果發(fā)酵液初始pH值過高，就會使發(fā)酵過程中草酸和葡萄糖酸大量積累，使發(fā)酵液中雜酸含量過高。不同發(fā)酵液初始pH值對檸檬酸發(fā)酵產(chǎn)量的影響，見圖 3。

圖3 發(fā)酵液初始pH值對檸檬酸產(chǎn)量的影響

由圖3可以看出，當(dāng)pH值為4.6時，黑曲霉在進行檸檬酸發(fā)酵時的產(chǎn)酸率最高。發(fā)酵液初始pH值調(diào)節(jié)過高或者過低，都會使產(chǎn)酸率變低。由此可知糖化酶活性的最佳pH值為4.6。如果發(fā)酵液初始pH值過低，則會低于糖化酶最適作用范圍，會使得發(fā)酵原料得不到充分利用，進而影響最終產(chǎn)酸率。反之如果發(fā)酵液初始pH值過高，則黑曲霉菌絲球會出現(xiàn)老化現(xiàn)象，提前進入衰老期，甚至還會引起菌體自溶。所以，發(fā)酵液初始最適 pH 值為4.6。

3.4.2 檸檬酸發(fā)酵過程中pH值的變化

黑曲霉的生長以及在發(fā)酵過程中的不同階段都需要不同的酸度條件，培養(yǎng)基中堿性物質(zhì)的消耗和酸性物質(zhì)的生成自然會引起發(fā)酵液pH值的下降，而酸性物質(zhì)的消耗和堿性物質(zhì)的生成又可引起pH值的上升。同時其他發(fā)酵條件的改變、菌體的自 溶以及雜菌污染也將引起發(fā)酵液pH值的變化[11]。因此，在發(fā)酵前期保持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定，使pH值保持在4～5之間。當(dāng)pH值過低時，可以適當(dāng)加入氨水提高pH值；當(dāng)pH值過高時，可以適當(dāng)加入硫酸銨降低pH值。

4 結(jié)論

通過平行試驗比較不同發(fā)酵液初糖濃度對檸檬酸產(chǎn)酸的影響，得出黑曲霉在發(fā)酵初糖濃度18 g/100 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行批量發(fā)酵產(chǎn)酸效果最佳。通過平行試驗確定發(fā)酵最佳初始pH值為4.6，最佳接種量在10%左右，最佳發(fā)酵溫度(35±1)℃

參考文獻

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