鰤魚諾卡氏菌DmpA基因的克隆及亞細(xì)胞定位研究

夏立群陳銳敏廖保山徐亮蘇澤杰童邦卓

（1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江 524088；2. 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點實驗室，湛江 524088；3. 廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害控制重點實驗室，湛江 524088）

鰤魚諾卡氏菌DmpA基因的克隆及亞細(xì)胞定位研究

夏立群1，2，3陳銳敏1廖保山1徐亮1蘇澤杰1童邦卓1

（1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江 524088；2. 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點實驗室，湛江 524088；3. 廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害控制重點實驗室，湛江 524088）

鰤魚諾卡氏菌（Nocardia seriolae）是魚類諾卡氏菌病的主要病原，為兼性胞內(nèi)菌。生物信息學(xué)分析顯示鰤魚諾卡氏菌DmpA基因的表達(dá)產(chǎn)物為分泌蛋白，且可能定位于宿主細(xì)胞的線粒體上。通過構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-DmpA和pcDNA-DmpA、鰤魚諾卡氏菌胞外產(chǎn)物鑒定、亞細(xì)胞定位、過表達(dá)等方法，對鰤魚諾卡氏菌DmpA基因進行了克隆、亞細(xì)胞定位及初步功能研究。結(jié)果表明在鰤魚諾卡氏菌胞外產(chǎn)物中鑒定到了DmpA蛋白，證實其為分泌蛋白。亞細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)DmpA-GFP融合蛋白均勻地分布在FHM細(xì)胞中，與線粒體分布不重合，說明DmpA蛋白并不定位在線粒體上。DmpA-GFP融合蛋白的表達(dá)會改變FHM細(xì)胞線粒體的分布為團塊狀。DmpA在細(xì)胞中的過量表達(dá)對細(xì)胞核無明顯影響，表明該基因無誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能。通過對鰤魚諾卡氏菌DmpA的克隆、亞細(xì)胞定位和過表達(dá)研究，為進一步研究該基因的功能和深入了解鰤魚諾卡氏菌的致病機理奠定了基礎(chǔ)。

鰤魚諾卡氏菌；DmpA基因；分泌蛋白；亞細(xì)胞定位

鰤魚諾卡氏菌（Nocardia seriolae）是魚類諾卡氏菌病的主要致病菌，當(dāng)魚類免疫力低下時，可通過餌料、鰓或傷口感染，并引發(fā)魚體發(fā)生慢性系統(tǒng)性肉芽腫疾病［1］。鰤魚諾卡氏菌可感染烏鱧（Channa maculata）、卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）、大黃魚（Larimichthys crocea）等20多種海、淡水魚類，導(dǎo)致魚類慢性死亡，或由于引發(fā)體表潰瘍而降低成魚商品價值，加之發(fā)病率逐年增加，對魚類養(yǎng)殖業(yè)危害也越來越嚴(yán)重［2-4］。

鰤魚諾卡氏菌在分類學(xué)上屬放線菌目、諾卡氏菌科、諾卡氏菌屬，為革蘭氏陽性菌［5］。鰤魚諾卡氏菌是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，在其感染過程中，菌體會被魚體吞噬細(xì)胞，主要是巨噬細(xì)胞吞噬。鰤魚諾卡氏菌能在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活，并可隨著巨噬細(xì)胞的遷移而擴散感染到魚體的各個器官［6］。病原菌逃避巨噬細(xì)胞殺滅的機制一直是相關(guān)疾病學(xué)研究的關(guān)注熱點，研究發(fā)現(xiàn)各種病原菌的胞內(nèi)生存機制各有特色、不盡相同。有研究表明胞內(nèi)寄生菌可通過調(diào)控吞噬細(xì)胞的線粒體、細(xì)胞骨架、溶酶體、誘導(dǎo)或抑制巨噬細(xì)胞的凋亡或壞死等途徑，進而影響其清除病原菌的能力［7］。目前，鰤魚諾卡氏菌致病過程中，逃避巨噬細(xì)胞殺滅的途徑及其與魚體細(xì)胞的相互作用機制尚不明確。

病原放線菌致病性相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究揭示，病原放線菌的分泌蛋白與其致病性緊密相關(guān)，特別是一些具有生物降解活性的蛋白酶和酯酶類分泌蛋白，可能是病原放線菌的重要致病因子［8］。鰤魚諾卡氏菌ZJ0503株全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)一個DmpA基因，可能編碼一種分泌蛋白，功能預(yù)測顯示該基因兼具L-氨肽酶（L-aminopeptidase）和D-酯酶（D-esterase）的功能。本研究對鰤魚諾卡氏菌DmpA基因進行克隆，并通過胞外產(chǎn)物鑒定、亞細(xì)胞定位、過表達(dá)等方法開展研究，以期對鰤魚諾卡氏菌DmpA的功能進行初步研究，為深入了解鰤魚諾卡氏菌的分子致病機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細(xì)胞和質(zhì)粒 鰤魚諾卡氏菌（N. seridea）ZJ0503菌株從海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的患病卵形鯧鲹（T. ovatus）中分離到并由本實驗室保存；胖頭鯉細(xì)胞（FHM）、質(zhì)粒pEGFP-N1、質(zhì)粒pcDNA 3.1-His A、大腸桿菌受體菌DH5α由本實驗室保存提供。

1.1.2 工具酶和試劑 KOD -Plus-Neo高保真聚合酶購自Toyobo公司；限制性核酸內(nèi)切酶Bgl II，Sal I，Kpn I，Xho I，T4 連接酶，DNA 片段純化試劑盒均購于TaKaRa公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購自Tiangen公司；E.Z.N.ATM去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（Endo-Free plasmid mini kit）購自O(shè)mega公司；L-15細(xì)胞培養(yǎng)液，胰酶購自Gibco公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、Opti-MEM，線粒體紅色熒光探針MitoTracker Red CMXRos購自Invitrogen 公司；細(xì)胞核染色劑DAPI購自Sigma公司；透析袋（截留分子量3500）、玻璃紙購自上海源葉生物科技有限公司；線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）購自碧云天生物技術(shù)公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 鰤魚諾卡氏菌DmpA基因的克隆與DmpA融合表達(dá)載體的構(gòu)建 鰤魚諾卡氏菌ZJ0503總DNA的提取按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（Tiangen）說明書進行。根據(jù)鰤魚諾卡氏菌ZJ0503全基因組［9］（accession number：JNCT01000000）DmpA基因（ORF 2563，nucleotide position：28849-29919）的序列和質(zhì)粒pEGFP-N1、pcDNA 3.1-His A的MCS酶切位點設(shè)計引物。引物設(shè)計采用的軟件為Primer premier 5.0，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其核苷酸序列見表1。

表1 本研究中所使用的引物

以鰤魚諾卡氏菌ZJ0503總DNA為模板進行PCR擴增，參照KOD-Plus-Neo高保真聚合酶說明書設(shè)置PCR擴增體系：10× PCR Buffer for KODPlus-Neo 5 μL，dNTP（2 mmol/L）5 μL，MgSO4（25 mmol/L）3 μL，引物pEGFP-F（10 μmol/L）和pEGFP-R（10 μmol/L）各2 μL，模板DNA 1 μL，KOD -Plus-Neo高保真聚合酶（1 U/μL）1 μL，加ddH2O 補足至50 μL。PCR的擴增條件為：98℃預(yù)變性2 min；98℃ 10 s，55℃ 15 s，68℃ 1 min，共30個循環(huán)；68℃ 延伸5 min。將PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂凝膠電泳檢測。PCR 產(chǎn)物經(jīng)DNA 片段純化試劑盒純化后，與質(zhì)粒pEGFP-N1進行雙酶切后16℃連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α。經(jīng)菌落PCR鑒定后，陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。構(gòu)建成功的融合表達(dá)載體命名為pEGFPDmpA。

1.2.2 鰤魚諾卡氏菌DmpA基因的生物信息學(xué)分析 根據(jù)鰤魚諾卡氏菌DmpA基因測序結(jié)果，使用DNAMAN進行脫氧核糖核苷酸的翻譯；用clustalX和GeneDoc軟件進行氨基酸多重序列比對分析；利用NCBI BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）對DmpA的蛋白序列進行序列同源性比對和相似性分析；運用MEGA6進行生物進化樹的構(gòu)建；采用 LocTree 3（http://cubic.bioc.columbia.edu/cgi/var/ nair/loctree/query）進行蛋白亞細(xì)胞定位的預(yù)測；用SignalP 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行信號肽的預(yù)測；通過Intropro（http://www.ebi. ac.uk/interpro/）對蛋白家族成員進行分析和功能預(yù)測。

1.2.3 鰤魚諾卡氏菌胞外產(chǎn)物的制備與鑒定 將鰤魚諾卡氏菌在改良培養(yǎng)基［10］平板上培養(yǎng)3-5 d后，挑取單菌落制備成菌懸液。將滅菌后的玻璃紙平鋪在改良培養(yǎng)基平板上，并使其緊貼培養(yǎng)基。取100 μL菌懸液均勻涂布于鋪有玻璃紙的培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3-5 d。用鑷子將生長有菌落的玻璃紙從培養(yǎng)基上剝離，用無菌PBS將玻璃紙上的菌落沖洗入無菌燒杯中。將收集的菌液轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，8000×g，4℃，離心20 min。離心后的上清液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜除菌后，轉(zhuǎn)移至透析袋中，超純水中4℃透析10-16 h，期間換透析液3次。透析后的樣品轉(zhuǎn)入50 mL離心管，于-80℃將液體冷凍成固體后，放入真空冷凍干燥機中凍干。凍干后的胞外產(chǎn)物樣品送深圳微菲生物科技有限公司進行蛋白質(zhì)shotgun LC-MS質(zhì)譜鑒定。

蘇秋琴將癩阿小從柳紅身上移開，見他無聲無息的，她就用腳踢踢他，也沒有動靜，蘇秋琴不免驚慌起來，這家伙不會被我砸死了吧？她叫柳紅，柳紅卻傻呆呆地坐在地上，兩眼朝著她放火。這鬼天氣，熱得人都發(fā)瘋了。蘇秋琴攀住柳紅的雙肩拼命地?fù)u，柳紅嗖地站起身來，撿了一塊西瓜，狠狠地拍到癩阿小的臉上。

1.2.4 鰤魚諾卡氏菌DmpA的亞細(xì)胞定位 按E.Z.N.ATM去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒pEGFP-DmpA和pEGFP-N1質(zhì)粒。FHM細(xì)胞用含10%小牛血清的L-15培養(yǎng)液培養(yǎng)，將FHM細(xì)胞傳代至24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞覆蓋率約為70%時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamin 2000說明書進行，每孔轉(zhuǎn)染需1 μg 質(zhì)粒和2 μL 轉(zhuǎn)染試劑（lipofectamin 2000）。轉(zhuǎn)染48 h后，參照MitoTracker Red CMXRos說明書進行線粒體紅色熒光探針染色和細(xì)胞核染色，具體步驟如下：吸出細(xì)胞培養(yǎng)液后，每孔加入125 μL預(yù)熱至28℃的MitoTracker Red CMXRos工作液（300 nmol/L，使用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋），于28℃避光孵育45 min。染色結(jié)束后用PBS漂洗2-3次，用預(yù)熱至室溫的3.7%多聚甲醛固定30 min，用PBS漂洗2-3次。用預(yù)冷至-20℃的冰乙醇透化細(xì)胞7 min，用PBS漂洗2-3次。每孔加入200 μL DAPI（1 μg/mL）避光染細(xì)胞核10 min，PBS 漂洗3 次后，在熒光顯微鏡（Leica）下觀察拍照。

1.2.5 鰤魚諾卡氏菌DmpA基因真核表達(dá)對細(xì)胞核的影響 構(gòu)建鰤魚諾卡氏菌DmpA基因的真核表達(dá)載體pcDNA-DmpA：使用的引物為pcDNA-F和pcDNA-R（表1），PCR擴增體系和PCR擴增條件與步驟1.2.1相同，PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pcDNA 3.1-His A酶切連接后，陽性克隆送測序。構(gòu)建成功的真核過表達(dá)重組質(zhì)粒命名為pcDNA-DmpA。將質(zhì)粒pcDNADmpA和pcDNA 3.1-His A分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)于24孔板的FHM細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法參見步驟1.2.4。在轉(zhuǎn)染后48 h，將細(xì)胞固定、透化后經(jīng)DAPI（1 μg/mL）避光染核10 min，于在熒光顯微鏡（Leica）下觀察轉(zhuǎn)染后FHM細(xì)胞核的變化情況。以饑餓誘導(dǎo)凋亡的FHM細(xì)胞為陽性對照。

2 結(jié)果

2.1 鰤魚諾卡氏菌DmpA基因的克隆與DmpA-GFP融合表達(dá)載體的構(gòu)建

鰤魚諾卡氏菌DmpA基因的高保真PCR擴增產(chǎn)物，用1%的瓊脂糖凝膠作電泳分析，獲得長度大小為1 000 bp左右的目的條帶（圖1），與理論長度1 071 bp相符合。測序結(jié)果證明重組質(zhì)粒pEGFPDmpA的插入片段序列與鰤魚諾卡氏菌ZJ0503全基因組測序的DmpA基因（ORF 2563）序列完全一致，表明重組質(zhì)粒pEGFP-DmpA構(gòu)建成功。

圖1 鰤魚諾卡氏菌DmpA基因PCR 擴增電泳結(jié)果

2.2 鰤魚諾卡氏菌DmpA基因的生物信息學(xué)分析

鰤魚諾卡氏菌DmpA基因（ORF 2563）是長1 071 bp 的開放閱讀框，編碼356個氨基酸（圖2），預(yù)測的分子量為35.3 kD，理論的等電點值為4.62。

圖2 鰤魚諾卡氏菌DmpA基因的核苷酸序列及其推定的氨基酸序列（*表示終止子）

LocTree預(yù)測鰤魚諾卡氏菌DmpA基因編碼的蛋白，在原核生物中為分泌蛋白，而在真核生物細(xì)胞中定位于線粒體。推測鰤魚諾卡氏菌DmpA基因的表達(dá)產(chǎn)物可能會是該病原菌的分泌蛋白；作為一種兼性胞內(nèi)菌，鰤魚諾卡氏菌的該分泌蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)可能會定位于線粒體。經(jīng)SignalP分析表明，鰤魚諾卡氏菌DmpA基因編碼的蛋白沒有信號肽，推測其分泌到細(xì)菌胞外的過程中沒有經(jīng)過信號肽剪切。

通過NCBI對鰤魚諾卡氏菌DmpA基因的推定氨基酸序列進行Protein BLAST分析，發(fā)現(xiàn)另外兩種魚類致病諾卡氏菌，殺鮭諾卡氏菌（N. salmonicida）和星狀諾卡氏菌（N. asteroids），也存在DmpA同源類似物。BLAST結(jié)果顯示鰤魚諾卡氏菌DmpA與其他諾卡氏菌屬物種同源類似物的同源性為81%-93%，與紅球菌屬（Rhodococcus）物種DmpA的同源性為68%-71%。利用DNAMAN對選取的8個放線菌目物種同源類似物進行多重列對比，結(jié)果（圖3）顯示鰤魚諾卡氏菌DmpA與這些物種相似性為75%以上的氨基酸高達(dá)67.1%，說明DmpA在放線菌目是較為保守的蛋白。DmpA氨基酸序列系統(tǒng)進化樹顯示諾卡氏菌屬細(xì)菌先聚為一枝，之后與紅球菌屬細(xì)菌聚為一枝，最后和分枝桿菌屬（Mycobacterium）細(xì)菌相聚（圖4）。

圖3 不同物種DmpA氨基酸序列多重比對分析

圖4 基于DmpA同源類似物氨基酸序列繪制的系統(tǒng)發(fā)生樹

鰤魚諾卡氏菌DmpA功能預(yù)測結(jié)果顯示其兼具L-氨肽酶（L-aminopeptidase）和D-酯酶（D-esterase）的功能，屬于S58肽酶家族，是能從蛋白質(zhì)和多肽N端選擇性切除氨基酸殘基的外切蛋白酶。DmpA是一個由375個氨基酸殘基組成的N末端氨肽酶，具有α亞基（位于2-249號殘基間）和β亞基（位于250-375殘基之間）。DmpA通過前體的N端蛋氨酸的脫除和Gly-249-Ser-250間肽鍵的斷裂達(dá)到激活效果，其兼具L型水解酶和D-丙氨酸-酯酶/酰胺酶的功能［11，12］。為了實現(xiàn)DmpA水解酶的活性，底物的α氨基要處于自由狀態(tài)，若N末端殘基是L型結(jié)構(gòu)則水解效果更佳。鰤魚諾卡氏菌DmpA還具有nylC-like結(jié)構(gòu)域，nylC基因可編碼尼龍低聚物分解酶（Nylon oligomers degrading enzyme）。

2.3 鰤魚諾卡氏菌DmpA為分泌蛋白的鑒定

通過制備鰤魚諾卡氏菌胞外產(chǎn)物并進行Shotgun質(zhì)譜鑒定，結(jié)果顯示多次鑒定到了屬于鰤魚諾卡氏菌DmpA 的一個肽段“VPGGAVASVDVR”，證明鰤魚諾卡氏菌DmpA基因編碼的蛋白出現(xiàn)在鰤魚諾卡氏菌的胞外產(chǎn)物中，是分泌蛋白。

2.4 鰤魚諾卡氏菌DmpA的亞細(xì)胞定位

將鰤魚諾卡氏菌DmpA基因連接到真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1中，成功構(gòu)建了真核表達(dá)重組質(zhì)粒pEGFP-DmpA。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞后，能在自身攜帶的SV40早期啟動子的作用下表達(dá)一個羧基末端帶有增強型綠色熒光蛋白標(biāo)簽（Green fluorescent protein，GFP）的DmpA-GFP融合蛋白，從而通過綠色熒光蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位來研究DmpA的亞細(xì)胞定位。

實驗以空載體pEGFP-N1為對照。將pEGFPDmpA和pEGFP-N1轉(zhuǎn)染FHM細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h，用MitoTracker Red CMXRos和DAPI染色，并于熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果（圖5）顯示，pEGFP-N1轉(zhuǎn)染的FHM細(xì)胞，其綠色熒光呈全細(xì)胞分布，線粒體圍繞細(xì)胞核呈環(huán)狀分布，細(xì)胞核邊緣較光滑，染色均勻，無細(xì)胞凋亡特征（圖5右）；pEGFP-DmpA轉(zhuǎn)染FHM細(xì)胞后綠色熒光在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都存在，呈全細(xì)胞分布，與線粒體分布不重合，說明DmpAGFP融合蛋白并不定位于線粒體上。有DmpA-GFP融合蛋白綠色熒光的細(xì)胞，其細(xì)胞核常出現(xiàn)邊緣褶皺，推測DmpA在FHM細(xì)胞中的表達(dá)可能會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；DmpA-GFP融合蛋白的表達(dá)會改變FHM細(xì)胞線粒體的分布：在大多數(shù)陽性轉(zhuǎn)染pEGFPDmpA的細(xì)胞中，線粒體的分布模式被改變，不再是pEGFP-N1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的圍繞細(xì)胞核的環(huán)狀分布模式，而是線粒體分布呈團塊狀（圖5左）。

2.5 鰤魚諾卡氏菌DmpA過表達(dá)對細(xì)胞核的影響

真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA-DmpA轉(zhuǎn)染到FHM細(xì)胞中，可持續(xù)高水平表達(dá)鰤魚諾卡氏菌DmpA。將pcDNA-DmpA 和pcDNA3.1 his A轉(zhuǎn)染FHM細(xì)胞后48 h，經(jīng)DAPI染色，觀察細(xì)胞核的狀態(tài)。結(jié)果顯示，與對照組pcDNA3.1 his A（圖6-A）相比，轉(zhuǎn)染pcDNA-DmpA的FHM細(xì)胞，核并未出現(xiàn)固縮濃染、核裂解、凋亡小體等明顯的細(xì)胞凋亡特征（圖6-C），表明DmpA在FHM細(xì)胞的過表達(dá)并不會引起細(xì)胞凋亡。陽性對照FHM細(xì)胞中，饑餓誘導(dǎo)了明顯的凋亡，其細(xì)胞核出現(xiàn)了核裂解和凋亡小體等凋亡特征（圖6-B）。

圖5 帶GFP標(biāo)簽的鰤魚諾卡氏菌DmpA融合蛋白在FHM細(xì)胞內(nèi)的定位

3 討論

本研究成功克隆了鰤魚諾卡氏菌DmpA基因，并鑒定其所編碼的蛋白存在于鰤魚諾卡氏菌的胞外產(chǎn)物中，為一種分泌蛋白。對鰤魚諾卡氏菌DmpA進行功能預(yù)測，結(jié)果顯示DmpA屬于S58肽酶家族，兼具L-氨肽酶和D-酯酶的功能［11，12］。氨肽酶是一類從蛋白質(zhì)和多肽N端選擇性切除氨基酸殘基的外切蛋白酶［13］。而酯酶可調(diào)控酯類的代謝，研究表明結(jié)核分枝桿菌的致病性和耐受性與其較高的酯類物質(zhì)含量密切相關(guān)［14］。病原放線菌分泌蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示，一些具有生物降解活性的蛋白酶和酯酶是重要的致病因子［15］。鰤魚諾卡氏菌DmpA還與nylC具有相似的結(jié)構(gòu)域。相關(guān)研究顯示黃桿菌（Flavobacterium）nylC基因編碼的產(chǎn)物EIII是尼龍低聚物分解酶（nylon oligomers degrading enzyme），可以水解尼龍低聚物并消化6-氨基已酰乙酸低聚物所形成的聚合物［16］。假結(jié)核棒桿菌（Corynebacterium pseudotuberculosis）的分泌蛋白質(zhì)組中鑒定到了NlpC/P60蛋白質(zhì)［17］。鰤魚諾卡氏菌DmpA作為一種具有氨肽酶和酯酶活性的分泌蛋白，很可能是鰤魚諾卡氏菌的致病因子，在鰤魚諾卡氏菌的致病過程中具有一定的作用。

圖6 轉(zhuǎn)染pcDNA-DmpA后FHM細(xì)胞的細(xì)胞核觀察

基因的亞細(xì)胞定位可以為其功能研究提供重要線索。LocTree預(yù)測鰤魚諾卡氏菌的DmpA蛋白，在原核生物中為分泌蛋白，而在真核生物細(xì)胞中定位于線粒體。鰤魚諾卡氏菌的胞外產(chǎn)物鑒定證實鰤魚諾卡氏菌DmpA蛋白的確為一種分泌蛋白。通過構(gòu)建帶綠色熒光標(biāo)簽的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-DmpA，對鰤魚諾卡氏菌DmpA蛋白進行真核細(xì)胞的亞細(xì)胞定位研究，結(jié)果表明DmpA蛋白呈全細(xì)胞分布，與線粒體分布并不重合，因此其在真核細(xì)胞中并不是定位于線粒體的。同時，結(jié)果顯示DmpA蛋白的表達(dá)常常伴隨著細(xì)胞核褶皺、線粒體的分布呈團塊狀的變化，這有可能是由于DmpA蛋白影響到了宿主細(xì)胞的蛋白和酶代謝，因而改變了細(xì)胞核形態(tài)和線粒體的分布。研究顯示病原菌可通過分泌蛋白或直接將毒力蛋白注入宿主細(xì)胞發(fā)揮致病作用。當(dāng)病原菌毒力蛋白進入宿主細(xì)胞內(nèi)，就會通過改變宿主細(xì)胞的細(xì)胞骨架、膜運輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，以利于細(xì)菌在其中生存和增殖。

諾卡氏屬病原菌在被與宿主巨噬細(xì)胞吞噬后，可以抵抗巨噬細(xì)胞殺滅并在其內(nèi)存活，這一過程中諾卡氏菌的常用策略就是誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的凋亡［18，19］。目前諾卡氏菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的機制尚不十分明確，推測可能與其分泌蛋白等毒力因子相關(guān)。質(zhì)粒pcDNA3.1 his A具有CMV啟動子（Cytomegalovirus immediate-early promoter），轉(zhuǎn)染到真核動物細(xì)胞后，能夠?qū)Σ迦氲幕蜻M行持續(xù)的高水平表達(dá)。本研究將pcDNA-DmpA轉(zhuǎn)染FHM后，觀察細(xì)胞核的狀態(tài)。結(jié)果顯示，與對照組相比，鰤魚諾卡氏菌DmpA蛋白在FHM細(xì)胞的過表達(dá)并未引起細(xì)胞核出現(xiàn)固縮濃染、核裂解、凋亡小體等明顯的細(xì)胞凋亡特征，表明DmpA蛋白不能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的凋亡。

通過對鰤魚諾卡氏菌DmpA的克隆、亞細(xì)胞定位和過表達(dá)研究，為進一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)，也為深入了解鰤魚諾卡氏菌早期感染魚體的致病機理提供線索，為魚類諾卡氏菌病的防治奠定理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

成功構(gòu)建了鰤魚諾卡氏菌DmpA的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-DmpA和pcDNA-DmpA。鰤魚諾卡氏菌胞外產(chǎn)物質(zhì)譜鑒定表明DmpA蛋白為分泌蛋白。亞細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)DmpA-GFP融合蛋白均勻地分布在FHM細(xì)胞中，并未定位在線粒體上。DmpA-GFP融合蛋白的表達(dá)會改變FHM細(xì)胞線粒體的分布為團塊狀。過表達(dá)研究表明DmpA無誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Gene Cloning and Subcellular Localization of DmpA from Nocardia seriolae

XIA Li-qun1，2，3CHEN Rui-min1LIAO Bao-shan1XU Liang1SU Ze-jie1TONG Bang-zhuo1
（1. Fisheries College of Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088；2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088；3. Key Laboratory of Diseases Controlling for Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institutions，Zhanjiang 524088）

Nocardia seriolae，a facultative intracellular bacterium，is the main pathogen of fish nocardiosis. Bioinformatics analysis showed that the DmpA gene of N. seriolae encoded a secreted protein，and may be co-located with mitochondria of the host cell. In this study，the recombinant plasmids pEGFP-DmpA and pcDNA-DmpA were constructed，extracellular product of N. seriolae was identified，and the subcellular localization and over-expression of DmpA were carried out. The results showed that the protein DmpA was identified in the extracellular products of N. seriolae，and confirmed as a secreted protein. Subcellular localization of DmpA-GFP fusion proteins were evenly distributed in the whole cell of FHM cells，and were not coincided with the distribution of mitochondria，indicating that the protein DmpA was not co-localized with the mitochondria. The expression of DmpA changed the distribution of mitochondria into lumps in the FHM cell. The overexpression of DmpA in FHM cells had no significant effect on the nucleus，revealing that the gene had no function on inducing cell apoptosis. The cloning，subcellular localization and over-expression of DmpA from N. seriolae laid the foundation for further studying the function of the gene and promoting the understanding of the pathogenic mechanism of N. seriolae.

Nocardia seriolae；gene DmpA；secreted protein；subcellular localization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-0968

2016-10-27

廣東省科技發(fā)展專項資金項目（2016A050502061），廣東省自然科學(xué)基金（2014A030313602），深圳大鵬新區(qū)產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項資金項目（KY20160207），廣東省攀登計劃項目（pdjh2016b0234）

夏立群，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：水生動物病原生物學(xué)；E-mail：11465668@qq.com