鉛鋅礦區(qū)耐砷細(xì)菌的分離、鑒定及性質(zhì)研究

吳丹 張志鵬 馬玉超

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

鉛鋅礦區(qū)耐砷細(xì)菌的分離、鑒定及性質(zhì)研究

吳丹 張志鵬 馬玉超

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

旨在從湖南康家灣鉛鋅礦區(qū)的重金屬污染土壤樣品中篩選出耐高濃度砷的細(xì)菌菌株。用稀釋涂布法分離耐砷細(xì)菌；根據(jù)16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定分離得到的砷高耐受性菌株并檢測(cè)菌株內(nèi)含有的砷耐受性相關(guān)基因；用砷鉬藍(lán)法測(cè)定耐砷細(xì)菌的砷氧化還原能力；并通過(guò)吲哚乙酸（IAA）定量實(shí)驗(yàn)檢測(cè)優(yōu)勢(shì)菌株產(chǎn)IAA的能力。結(jié)果顯示，從土壤樣品中共分離出152株耐砷細(xì)菌，其中6株細(xì)菌對(duì)As5+和As3+的耐受性值分別高達(dá)800 mmol/L和20 mmol/L；并且這6株耐砷細(xì)菌分屬于5個(gè)不同的屬：假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、芽孢桿菌屬、威廉氏菌屬和節(jié)細(xì)菌屬；菌株Tw31、Tw133、Sw149和Tw222中存在砷還原酶基因arsC，Bw218和Tw222中存在砷離子外排基因arsB/ACR3（2）；在72 h之內(nèi)，菌株Tw133和Tw222的As3+氧化率（約17 %）和As5+還原率（約35 %）均高于其他菌株；尤其是菌株Tw133在144 h具有48.66 %的As5+還原率；且這兩株菌分別能產(chǎn)生42.86 μg/mL和24.36 μg/mL的IAA。篩選出的Tw133和Tw222菌株在砷耐受性、砷氧還能力和產(chǎn)IAA能力等方面展現(xiàn)出了較明顯的優(yōu)勢(shì)，為深入研究細(xì)菌的砷耐受性機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)材料。

耐砷細(xì)菌；耐砷基因；砷氧化還原；IAA

砷（As）廣泛存在于巖石圈、水圈和生物圈。長(zhǎng)期接觸砷可以導(dǎo)致各種癌癥的發(fā)生，如膀胱癌、肺癌、皮膚癌等。目前，世界上包括孟加拉、印度、阿根廷、美國(guó)和中國(guó)等許多國(guó)家面臨著嚴(yán)重的砷污染威脅。有報(bào)道稱(chēng)中國(guó)土壤中砷濃度的平均值為11.2 mg/kg，約為世界平均值（6 mg/kg）的2倍［1］。因此砷污染的治理迫在眉睫。

自然環(huán)境中的砷主要以As5+和As3+兩種無(wú)機(jī)價(jià)態(tài)形式存在，其中后者毒性大約為前者的100倍［2］。砷酸鹽的毒性源于其作為磷酸鹽的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，可以取代磷酸鹽，抑制氧化磷酸化過(guò)程；而亞砷酸鹽能夠與半胱氨酸的巰基結(jié)合，破壞或干擾蛋白和酶的功能［3］，從而發(fā)揮毒性作用。目前砷污染的主要治理原理是通過(guò)物理、化學(xué)、生物等技術(shù)降低砷的毒性或增加其穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)在砷污染較嚴(yán)重的地區(qū)，一些特殊的“耐砷微生物”［4］在砷化合態(tài)的相互轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［5］。目前報(bào)道較多的耐砷微生物有芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、紅球菌屬、蒼白桿菌屬、節(jié)細(xì)菌屬、放線菌屬、微桿菌屬等［6-9］。微生物的耐砷特性與砷吸收、氧化還原、甲基化和外排等過(guò)程密切相關(guān)［10］。微生物體內(nèi)主要通過(guò)ars操縱子介導(dǎo)砷代謝過(guò)程，其中砷酸鹽還原酶（ArsC）［11］催化As5+還原成As3+，而As3+又被亞砷酸鹽外排泵（ArsB、ACR3）［12］排出細(xì)胞外，還有其他的一些相關(guān)基因arsR和arsD（調(diào)節(jié)基因），arsA（ATP酶基因），arsH［13］、arsO等也參與了輔助代謝過(guò)程。另外一種機(jī)制是由亞砷酸鹽氧化酶AioBA［11］催化介導(dǎo)的，它可以將高毒的As3+氧化成低毒、較穩(wěn)定的As5+。而Qin等［14］的研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌Rhodopseudomonas palustris CGA009中As3+可以被轉(zhuǎn)甲基化酶ArsM經(jīng)過(guò)不同程度的甲基化，最終轉(zhuǎn)變成氣態(tài)的三甲基砷排出細(xì)胞，從而達(dá)到耐砷效果。近幾年，由于微生物的耐砷機(jī)制而演化出利用微生物進(jìn)行砷污染的修復(fù)技術(shù)也受到了越來(lái)越多的關(guān)注。除此之外，有些耐砷微生物還有植物促生作用，可以促進(jìn)蜈蚣草［15］、粉葉蕨［16］、大葉井口邊草［17］等一些砷富集植物對(duì)砷的吸收，從而達(dá)到微生物—植物協(xié)同作用修復(fù)砷污染的目的。

在土壤砷污染的來(lái)源中，礦業(yè)開(kāi)采是主要原因之一。湖南的康家灣鉛鋅礦是中國(guó)的第四大礦區(qū)，至今已有100多年的開(kāi)采歷史，在開(kāi)采過(guò)程中，周?chē)h(huán)境被各種重金屬污染，如鉛、鋅、砷等，對(duì)人們的生活構(gòu)成很大的威脅。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于砷污染的環(huán)境中高耐砷性菌株分離的研究較少。本研究以該礦區(qū)作為研究對(duì)象，目的是分離篩選耐高濃度砷的細(xì)菌，并對(duì)其進(jìn)行鑒定，通過(guò)研究其對(duì)砷的氧化還原能力、砷耐性基因及其他的與砷耐性相關(guān)的特性，從而確定目標(biāo)菌株，進(jìn)行下一步砷代謝機(jī)制的研究，旨為土壤砷污染的生物修復(fù)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土壤 采自湖南康家灣水口山鉛鋅礦（26°33'57.9"N 112°36'23.7"E）周?chē)V渣區(qū)10-20 cm的表層土壤。采樣點(diǎn)周?chē)采w冶煉礦渣，重金屬含量較高，表層植物較少。去除土壤表面礦渣，現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定pH值，用無(wú)菌鏟取約5 kg左右的新鮮表層土壤，置于無(wú)菌袋中，做好標(biāo)記，將無(wú)菌袋放入冰盒中空運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。取一部分新鮮樣品，立刻進(jìn)行細(xì)菌分離，剩余的樣品存于4℃冰箱中，用于化學(xué)分析，土壤的理化性質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 供試土壤的基本性質(zhì)

1.1.2 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，胰蛋白胨10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2。CDM培養(yǎng)基［18］：溶液 A（0.081 2 mol/L七水硫酸鎂，0.187 mol/L氯化銨，0.07 mol/L無(wú)水硫酸鈉，0.574 mmol/L磷酸氫二鉀，4.57 mmol/L二水合氯化鈣和0.446 mol/L乳酸鈉），121℃滅菌20 min；溶液B（4.8 mmol/L七水硫酸亞鐵）和溶液C（0.95 mol/L碳酸氫鈉），用0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾除菌。分別配制上述3種溶液，1 L CDM液體培養(yǎng)基中含有100 mL溶液A、2.5 mL溶液B、10 mL溶液C和887.5 mL蒸餾水，調(diào)pH至7.2。上述培養(yǎng)基若制備固體培養(yǎng)基，加入14 g/L的瓊脂粉即可。

1.1.3 主要試劑和儀器 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和購(gòu)自天根生化科技有限公司，PCR擴(kuò)增和克隆相關(guān)試劑購(gòu)自大連寶生物有限公司（TaKaRa），引物由上海英濰捷基公司合成，測(cè)序服務(wù)由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。PCR儀和凝膠成像系統(tǒng)分別為Bio-Rad PCR儀和上海Tocan360凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 供試土壤理化性質(zhì)的測(cè)定 將新鮮土樣進(jìn)行烘干、過(guò)篩、消化（1∶1的HNO3-H2SO4）處理，用火焰原子吸收分光光度法［19］測(cè)定供試土壤中的重金屬含量。用總有機(jī)碳分析儀（TOC-VE，Shimadzu，日本）檢測(cè)有機(jī)碳含量；而總氮和磷的含量用傅里葉變換近紅外光譜儀（NIRLabN-200，BUCHI，瑞士）即可測(cè)得。

1.2.2 土壤耐砷菌株的分離和純化 取1 g新鮮土樣溶于99 mL無(wú)菌水中，錐形瓶中加入10粒左右的玻璃珠，150 r/min，28℃振蕩培養(yǎng)30 min。將土壤懸液連續(xù)稀釋至濃度10-3，10-4和10-5，然后取0.1 mL稀釋液涂布于含有40 mmol/L Na2HAsO4·7H2O的CDM平板上，28℃倒置培養(yǎng)3-7 d后劃線分離。為了進(jìn)一步篩選出對(duì)砷具有較高耐受性的菌株，分別用含不同梯度Na2HAsO4·7H2O（65、130和260 mmol/L）的CDM固體培養(yǎng)基對(duì)初篩分離的菌株進(jìn)一步分離培養(yǎng)，純化。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 對(duì)砷和其他重金屬耐受性檢測(cè) 對(duì)篩選出來(lái)的耐砷能力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行高濃度砷和其他重金屬的耐受性檢測(cè)。將分離純化的菌株接種于分別含有400、600、800 mmol/L Na2HAsO4·7H2O和 5、10、20 mmol/L NaAsO2的CDM瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)3-7 d。對(duì)其他重金屬（鎘、汞、銅、鎳和鋇）的耐受性測(cè)定分別選用化合物Cd（NO3）2·4H2O、HgCl2、Cu（NO3）2·3H2O、NiCl2和BaCl2的濃度為1-20 mmol/L，共20個(gè)梯度，每?jī)蓚€(gè)梯度間隔1 mmol/L，用平板劃線法將菌株接種于含有不同重金屬濃度的CDM固體培養(yǎng)基上，重復(fù)3次，28℃培養(yǎng)3-7 d。

1.2.4 耐砷菌株的鑒定和耐砷基因的檢測(cè) 采用16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增和測(cè)序分析法對(duì)篩選出來(lái)的耐砷細(xì)菌進(jìn)行菌種鑒定。利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取耐砷菌株的基因組DNA，并以其作為模板，以27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1 492R（5'-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）［20］為引物進(jìn)行50 μL 體系的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：94℃變性4 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1.5 min，循環(huán)30次；72℃ 10 min。為了獲得幾乎全長(zhǎng)的16S rRNA基因，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA純化試劑盒（TaKaRa）進(jìn)行純化，然后用切膠回收試劑盒（TaKaRa）回收純化DNA片段，并用pMD18-T克隆試劑盒（TaKaRa）將純化片段鏈接到pMD18-T載體中，10 μL的連接體系包含1 μL T4 DNA Ligase Buffer（10×），7.5 μL DNA，0.5 μL pMD-18T，1 μL T4 DNA 連接酶，16℃連接16 h，然后用氯化鈣法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（購(gòu)自天根生化科技有限公司）中，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，篩選出陽(yáng)性克隆，然后送到生工生物工程股份有限公司利用引物M13-47（5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'）/RV-M（5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'）進(jìn)行測(cè)序。用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，將得到的序列提交到http://www.eztaxon-e.ezbiocloud. net/［21］進(jìn)行序列分析，然后用MEGA 5.0［22］軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)［23］。

對(duì)于砷耐受性相關(guān)基因（As3+氧化酶基因aioA、As5+還原酶基因arsC、外排基因arsB/ACR3(1)/ ACR3(2)、甲基化酶基因arsM）的檢測(cè)，我們分別選取了9對(duì)引物（表2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL PCR反應(yīng)體系包含 14.75 μL 2×Taq PCR Mix，上下游引物各0.2 mmol/L，25 ng DNA模板，克隆及測(cè)序方法同16S rRNA鑒定。

1.2.5 菌株氧化還原能力測(cè)定 采用砷鉬藍(lán)法［7］進(jìn)行測(cè)定。其原理為五價(jià)砷與鉬酸銨作用生成砷鉬酸絡(luò)合物，然后被抗壞血酸還原成鉬藍(lán)，在沸水浴中顯色并在865 nm下吸收峰值達(dá)到最大。挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，28℃，150r/min 培養(yǎng)24 h。將菌液4 750 × g 離心10 min，用PIPES（20 mmol/L，pH 7.0）緩沖液洗滌菌體兩次，懸浮于分別含有1 mmol/L NaHAsO2和1 mmol/L Na2HAsO4·7H2O的PIPES中，并調(diào)整菌液濃度至OD600= 1.0，28℃，150 r/min 培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24、48和72 h時(shí)取1 mL菌液于1.5 mL離心管中，4 750 ×g離心10 min去沉淀，將上清用PIPES緩沖液稀釋10倍，用于測(cè)定As5+和As3+含量。具體測(cè)定方法：處理一：取300 μL稀釋后的上清液加入100 μL KIO3溶液（5 mmol/L KIO3溶于 50 mmol/L HCl），目的是將上清液中的As3+氧化成As5+；處理二：取300 μL稀釋后的上清液加入100 μL 25 mmol/L HCl，對(duì)樣品進(jìn)行酸化。兩份樣品均25℃處理10 min，再分別加入600 μL鉬藍(lán)試劑（每升含有6 g鉬酸銨、10.8 g抗壞血酸、0.136 g酒石酸銻鉀、67.3 mL濃硫酸）立刻放入水浴鍋中，78℃處理10 min，然后冰浴5 min，用分光光度計(jì)在865 nm下測(cè)定其吸光度值。所有處理均進(jìn)行3次重復(fù)。以砷（Na2HAsO4·7H2O）濃度（0、20、40、60、80和100 mmol/L）為橫坐標(biāo)，吸光度OD865為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。處理一和處理二分別測(cè)定的是樣品中總As和As5+濃度，而As3+的濃度則根據(jù)兩個(gè)處理的吸光度差值計(jì)算可得。

1.2.6 菌株產(chǎn)IAA能力測(cè)定 根據(jù)康貽軍等［29］的方法對(duì)砷氧還能力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）能力定量測(cè)定。耐砷菌株產(chǎn)IAA濃度測(cè)定：用固體LB培養(yǎng)基活化耐砷菌株，然后接種于含有0.5 g/L色氨酸的LB液體培養(yǎng)基中，150 r/min 28℃ 培養(yǎng)48 h。5 000×g 離心15 min取2 mL上清液于10 mL離心管中，再加入等體積的Salkowshi比色液（每升10. 8 mol /L H2SO4含4.5 g FeCl3），室溫避光放置30 min。根據(jù)混合液的顏色可初步判斷產(chǎn)IAA量（若菌株產(chǎn)IAA，混合液則顯示紅色）；然后用分光光度計(jì)測(cè)定OD530值，定量檢測(cè)IAA。以空白培養(yǎng)基作對(duì)照，重復(fù)3次。以純IAA濃度（0、20、40、60和80 μg/mL）為橫坐標(biāo)，OD530為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線的OD530值計(jì)算菌液中IAA濃度。

表2 擴(kuò)增與砷代謝相關(guān)基因所選用的引物

2 結(jié)果

2.1 抗砷菌株的分離和篩選

利用含有40 mmol/L Na2HAsO4·7H2O的CDM平板，從采集的土壤樣品中共初篩獲得152株耐砷細(xì)菌。然后用更高濃度的As5+對(duì)152株菌進(jìn)行了進(jìn)一步的篩選，在65、130和260 mmol/LNa2HAsO4·7H2O的CDM瓊脂培養(yǎng)基中分別篩選出了42、26和6株砷耐受性菌株（圖1）。

圖1 根據(jù)不同濃度的As5+篩選的菌株數(shù)量

2.2 菌株對(duì)砷和其他重金屬的耐受性測(cè)定

對(duì)篩選出的6株砷高耐受性菌株進(jìn)行砷的最低抑菌濃度和耐其他重金屬性能的測(cè)定。從表3可以看出大多數(shù)菌株對(duì)As5+的耐受性在600 mmol/L以上，甚至高達(dá)800 mmol/L（Tw133和Tw222）；對(duì)As3+的耐受性除了Tw31（5 mmol/L）以外，也均在10 mmol/L以上。這些耐砷菌株還對(duì)多種重金屬具有耐受性，其中對(duì)鎳和銅耐受性較高，對(duì)汞和鋇產(chǎn)生中等程度的耐受性，而對(duì)低濃度的鎘較為敏感。

表3 菌株對(duì)砷及其他重金屬的耐受能力

2.3 菌株鑒定及相關(guān)耐砷基因檢測(cè)

根據(jù)16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果表明這6株耐砷菌株分屬于5個(gè)不同的屬：假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、芽孢桿菌屬、威廉氏菌屬和節(jié)細(xì)菌屬（圖2）。

利用9對(duì)引物檢測(cè)以上6株細(xì)菌的砷耐受性相關(guān)基因，結(jié)果（表4）顯示，4株耐砷菌株含有還原酶基因arsC，其中Tw133中arsC由引物對(duì)arsC4r/ arsC4f擴(kuò)增得到，而其他三株菌Tw31、Sw149和Bw218均用amlt42f/amlt376r引物得到。Tw222菌株同時(shí)含有兩個(gè)外排基因arsB和ACR3（2），菌株Bw218僅擴(kuò)增得到外排基因ACR3（2）。在這6株菌中均沒(méi)有擴(kuò)增得到氧化酶基因和甲基化酶基因，并且在菌株Tw49中沒(méi)有檢測(cè)到任何耐砷基因。

表4 菌株含有的相關(guān)砷耐受性基因

2.4 菌株氧化還原能力測(cè)定

用砷鉬藍(lán)法對(duì)6株耐高濃度砷的細(xì)菌進(jìn)行砷氧化還原能力測(cè)定。結(jié)果（圖3）顯示，這6株菌均表現(xiàn)出了不同程度的氧化還原能力，其中菌株Bacillus sp. Tw133和Pseudomonas sp. Tw222的氧化還原率明顯高于其他菌株。在72 h內(nèi)，Bacillus sp. Tw133和Pseudomonas sp. Tw222均可氧化17 %左右的As3+（圖3-A），并可還原大約35 %的As5+（圖3-B）。由于Bacillus sp. Tw133菌株在72 h時(shí)的還原率表現(xiàn)出明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì)，因此又對(duì)其進(jìn)行了更細(xì)致地測(cè)定，結(jié)果表明Bacillus sp. Tw133在144 h還原率達(dá)到最大值48.66 %（圖3-C）。由此可見(jiàn)，Bacillus sp. Tw133和Pseudomonas sp. Tw222菌株在砷氧化還原方面表現(xiàn)出了較明顯的優(yōu)勢(shì)。

2.5 菌株產(chǎn)IAA能力測(cè)定

IAA是一種植物內(nèi)源激素，與植物的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)，一定濃度的IAA可以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株Bacillus sp. Tw133和Pseudomonas sp. Tw222進(jìn)行產(chǎn)IAA能力的測(cè)定。如圖4所示，B管的紅色明顯比C深，根據(jù)顯色結(jié)果初步判斷，Bacillus sp. Tw133的產(chǎn)IAA能力比Pseudomonas sp. Tw222強(qiáng)。根據(jù)IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可得，Bacillus sp.Tw133可以產(chǎn)生高達(dá)42.86 μg/mL的IAA，明顯高于Pseudomonas sp. Tw222（24.36 μg/mL）。而由此可推斷該兩株菌對(duì)植物有一定的促生作用。

圖2 耐砷菌株與相關(guān)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，土壤砷污染問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，其毒性對(duì)環(huán)境和人類(lèi)健康產(chǎn)生極大的威脅。面對(duì)這種日益嚴(yán)峻的土壤砷污染問(wèn)題，迫切需要一種高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的方法進(jìn)行修復(fù)。近幾年，越來(lái)越多的研究表明，自然界中的微生物在砷的遷移轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用［30］，因此通過(guò)細(xì)菌的代謝活動(dòng)減少或去除砷污染受到了越來(lái)越多的關(guān)注。多種耐砷菌株的分離和鑒定有利于深入研究其代謝機(jī)制，從而促進(jìn)砷污染的生物修復(fù)。

本研究從湖南省康家灣鉛鋅礦土壤中共篩選出152株菌，其中耐高濃度砷的菌株細(xì)菌共6株。16S rRNA序列分析顯示，這6株耐砷菌株屬于5個(gè)不同的種屬，分別為假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、芽孢桿菌屬、威廉氏菌屬和節(jié)細(xì)菌屬。其中蒼白桿菌屬［31］、芽孢桿菌屬［9］、節(jié)細(xì)菌屬［6］和假單胞菌屬［32］均有報(bào)道。目前關(guān)于威廉氏菌屬的砷耐受性尚未有文獻(xiàn)報(bào)道，因此該研究中獲得的Williamsia sp. Tw49豐富了耐砷細(xì)菌的資源。

從重金屬污染環(huán)境中分離得到的細(xì)菌普遍存在耐砷及其他重金屬的特性。有報(bào)道稱(chēng)一些細(xì)菌對(duì)砷的耐受性分別可達(dá)10 mmol/L（As3+）和100 mmol/L（As5+）［33］，甚至在Paul等［8］的研究中發(fā)現(xiàn) Acinetobacter，Microbacterium，Pseudomonas和Rhizobium對(duì)砷酸鹽耐受性可高達(dá)600 mmol/L。而本研究篩選得到的6株菌均表現(xiàn)出了更大的砷耐受性，其中對(duì)As5+和As3+的最大耐受性分別為800 mmol/L（Bacillus sp. Tw133和 Pseudomonas sp. Tw222） 和20 mmol/L（Williamsia sp. Tw49和 Pseudomonas sp. Tw222），如此高的砷耐受性特征為今后研究該菌的砷代謝機(jī)制提供了理論支持，也為發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中新的砷代謝機(jī)理提供了可能性。

為了適應(yīng)砷污染的環(huán)境，細(xì)菌形成了各種砷代謝機(jī)制，目前最常見(jiàn)的耐砷機(jī)理包括砷的氧化、還原、甲基化等［2］。通過(guò)耐砷基因檢測(cè)，其中5株耐砷細(xì)菌中含有至少一個(gè)與砷耐受性相關(guān)的基因。6株耐砷菌株均表現(xiàn)出了不同程度的氧化還原能力，尤其是Bacillus sp. Tw133和Pseudomonas sp. Tw222的氧化率達(dá)17 %左右，但是未檢測(cè)到砷氧化酶基因和甲基化酶基因，可能是在這些菌株中存在其他類(lèi)型的砷氧化酶基因［34］和甲基化酶基因或者選用的引物不合適［35］。根據(jù)As5+還原能力檢測(cè)結(jié)果可知，耐砷菌株Bacillus sp. Tw133的還原率在144 h時(shí)達(dá)到最大值48.66 %，明顯高于耐砷菌株Enterobacter coacae sp. MC204（38.1 %）［7］，而且這與該菌株中檢測(cè)到砷還原酶基因（arsC）結(jié)果相符。盡管Williamsia sp. Tw49對(duì)砷表現(xiàn)出了較高的耐受性（As5+= 600 mmol/L，As3+= 10 mmol/L），但是用所選引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，沒(méi)有檢測(cè)到任何砷耐受性基因，推測(cè)該菌株可能存在未知的耐砷機(jī)制，有待于進(jìn)一步深入研究。

圖3 耐砷菌株分別對(duì)As的氧化還原能力

圖4 菌株產(chǎn)IAA能力顯色結(jié)果

植物修復(fù)技術(shù)是指利用植物清除土壤中的污染物質(zhì)或使污染物質(zhì)無(wú)毒化的技術(shù)［36］，但是較高濃度的重金屬限制了一些耐重金屬植物的正常生長(zhǎng)，而從污染地區(qū)分離到的一些細(xì)菌具有植物促生特性（PGP），如產(chǎn)IAA、ACC（1-氨基環(huán)丙烷羧酸）、鐵載體等［37］，可以促進(jìn)植物對(duì)重金屬的吸收，因此利用微生物—植物協(xié)同作用對(duì)重金屬污染土壤進(jìn)行修復(fù)也是一種較為理想的選擇。文一等［38］的研究表明，鏈霉菌 Streptomyces sp. 能夠促進(jìn)砷超積累植物蜈蚣草對(duì)砷的進(jìn)一步吸收。本研究中篩選出的耐砷菌株Bacillus sp. Tw133和 Pseudomonas sp. Tw222產(chǎn) IAA的量分別可達(dá)42.86 μg/mL和24.36 μg/mL，均高于植物根際促生菌Pseudomonas sp. WP6［29］產(chǎn)IAA的量20.92 μg/mL。初步表明這兩株優(yōu)勢(shì)菌株均具有明顯的促生能力，為植物—微生物聯(lián)合修復(fù)砷污染提供一定的理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)后期將通過(guò)測(cè)序確定這兩株優(yōu)勢(shì)菌的耐砷基因簇，以便研究它們的耐砷機(jī)制，并用基因工程手段對(duì)基因簇進(jìn)行改造，提高其代謝砷的能力，為砷污染的生物修復(fù)奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從湖南康家灣鉛鋅礦區(qū)總共篩選出152株細(xì)菌菌株，其中6株耐砷菌株對(duì)As5+和As3+的耐受性分別可高達(dá)800 mmol/L和20 mmol/L，并且對(duì)其他重金屬也有不同程度的抗性。這6株砷高耐受性細(xì)菌屬于5個(gè)不同的屬，所含有的砷耐受性基因主要為還原酶基因（arsC）和外排基因（arsB、ACR3（2））。Bacillus sp. Tw133和Pseudomonas sp. Tw222對(duì)砷的氧化還原能力相對(duì)較高，尤其Bacillus sp. Tw133在144 h的As5+還原率最高可達(dá)48.66 %，并且兩株菌產(chǎn)IAA的量分別為42.86 μg/mL和24.36 μg/mL，表現(xiàn)出了較明顯的優(yōu)勢(shì)。

［1］ 魏復(fù)盛, 陳靜生, 吳燕玉, 等. 中國(guó)土壤環(huán)境背景值研究［J］.環(huán)境科學(xué), 1991, 12（4）：12-19.

［2］ 蔡林, 王革嬌. 抗砷性微生物及其抗砷分子機(jī)制研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)通報(bào), 2009, 36（8）：1253-1259.

［3］ Krumova K, Nikolovska M, Groudeva V. Isolation and identification of arsenic-transforming bacteria from arsenic-contaminated sites in Bulgaria［J］. Biotechnol Biotechnol Equip, 2008, 22（2）：721-728.

［4］ Zargar K, Hoeft S, Oremland R, et al. Identification of a novel arsenite oxidase gene, arxA, in the Haloalkaliphilic, arseniteoxidizing bacterium Alkalilimnicola ehrlichii strain MLHE-1［J］. Journal of Bacteriology, 2010, 192（14）：3755-3762.

［5］ 張瀠月, 班允赫, 史榮久, 等. 具有砷（Ⅴ）還原能力的硫酸鹽還原菌篩選及生長(zhǎng)特性研究［J］. 河南科學(xué), 2015, 33（4）：553-558.

［6］ Cai L, Liu GH, Rensing C, et al. Genes involved in arsenic transformation and resistance associated with different levels of arsenic-contaminated soils［J］. BMC Microbiol, 2009, 9（4）：1-11.

［7］ Jareonmit P, Mehta M, Sadowsky MJ, et al. Phylogenetic and phenotypic analyses of arsenic-reducing bacteria isolated from an old tin-mine area in Thailand［J］. World J Microbiol Biotechnol, 2012, 28（5）：2287-2292.

［8］ Paul D, Poddar S, Sar P. Characterization of arsenite-oxidizing bacteria isolated from arsenic-contaminated groundwater of West Bengal［J］. J Environ Sci Health Part A-Toxic/Hazardous Substances Environ Eng, 2014, 49（13）：1481-1492.

［9］ Sanyal SK, Mou TJ, Chakrabarty RP, et al. Diversity of arsenite oxidase gene and arsenotrophic bacteria in arsenic-affected Bangladesh soils［J］. AMB Express, 2016, 6（1）：1-11.

［10］ 韓永和, 王珊珊. 微生物耐砷機(jī)理及其在砷地球化學(xué)循環(huán)中的作用［J］. 微生物學(xué)報(bào), 2016, 56（6）：901-910.

［11］ Cavalca L, Corsini A, Zaccheo P, et al. Microbial transformations of arsenic：perspectives for biological removal of arsenic from water［J］. Future Microbiol, 2013, 8（6）：753-768.

［12］ Desoeuvre A, Casiot C, Héry M. Diversity and distribution of arsenic-related genes along a pollution gradient in a river affected by acid mine drainage［J］. Microb Ecol, 2016, 71：672-685.

［13］ Yang HC, Rosen BP. New mechanisms of bacterial arsenic resistance［J］. Biomed J, 2016, 39（1）：5-13.

［14］ Qin J, Rosen BP, Zhang Y, et al. Arsenic detoxification and evolution of trimethylarsine gas by a microbial arsenite S-adenosylmethionine methyltransferase［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103（7）：2075-2080.

［15］ 廖曉勇, 陳同斌, 謝華, 等. 磷肥對(duì)砷污染土壤的植物修復(fù)效率的影響：田間實(shí)例研究［J］. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 24（3）：455-462.

［16］ 宋書(shū)巧, 周永章, 周興, 等. 土壤砷污染特點(diǎn)與植物修復(fù)探討［J］. 熱帶地理, 2004, 24（1）：6-9.

［17］ 紀(jì)冬麗, 孟凡生, 薛浩, 等. 國(guó)內(nèi)外土壤砷污染及其修復(fù)技術(shù)現(xiàn)狀與展望［J］. 環(huán)境工程技術(shù)學(xué)報(bào), 2016, 6（1）：90-99.

［18］ Weeger W, Lievremont D, Perret M, et al. Oxidation of arsenite to arsenate by a bacterium isolated from an aquatic environment［J］. Biometals, 1999, 12（2）：141-149.

［19］ 景麗杰, 馬甲. 火焰原子吸收分光光度法測(cè)定污染土壤中 5種重金屬［J］. 中國(guó)土壤與肥料, 2009, 1：74-77.

［20］ Yanagi M, Yamasato K. Phylogenetic analysis of the family Rhizobiaceae and related bacteria by sequencing of 16S rRNA gene using PCR and DNA sequencer［J］. FEMS Microbiol Lett, 1993, 107（1）：115-20.

［21］ Kim OS, Cho YJ, Lee K, et al. Introducing EzTaxon-e：a prokaryotic 16S rRNA gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species［J］. Int J Sys Evol Microbiol, 2012, 62（3）：716-721.

［22］ Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5：Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods［J］. Mol Biol Evol, 2011, 28（10）：2731-2739.

［23］ Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method：A new method for reconstructing phylogenetic trees［J］. Mol Biol Evol, 1987, 4（4）：406-425.

［24］ Inskeep WP, Macur RE, Hamamura N, et al. Detection, diversityand expression of aerobic bacterial arsenite oxidase genes［J］. Environ Microbiol, 2007, 9（4）：934-943.

［25］ Sun YM, Polishchuk EA, Radoja U, et al. Identification and quantification of arsC genes in environmental samples by using real-time PCR［J］. J Microbial Methods, 2004, 58（3）：335-349.

［26］ Escudero LV, Casamayor EO, Chong G, et al. Distribution of microbial arsenic reduction, oxidation and extrusion genes along a wide range of environmental arsenic concentrations［J］. PLoS ONE, 2013, 8（10）：e78890.

［27］ Achour AR, Bauda P, Billard P. Diversity of arsenite transporter genes from arsenic-resistant soil bacteria［J］. Res Microbiol, 2007, 158（2）：128-137.

［28］ Jia Y, Huang H, Zhong M, et al. Microbial arsenic methylation in soil and rice rhizosphere［J］. Environ Sci Technol, 2013, 47（7）：3141-3148.

［29］ 康貽軍, 程杰, 梅麗娟, 等. 植物根際促生菌的篩選及鑒定［J］.微生物學(xué)報(bào), 2010, 50（7）：853-861.

［30］ 楊婧, 朱永官. 微生物砷代謝機(jī)制的研究進(jìn)展［J］. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2009, 4（6）：761-769.

［31］ Branco R, Chung AP, Morais PV. Sequencing and expression of two arsenic resistance operons with different functions in the highly arsenic-resistant strain Ochrobactrum tritici SCII24T［J］. BMC Microbiol, 2008, 8（1）：1-12.

［32］ 管思琪, 羅蕾, 邢輝, 等. 湖南石門(mén)磺廠礦區(qū)尾礦庫(kù)抗砷菌株的分離、鑒定及性質(zhì)研究［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 42（4）：300-303.

［33］ Jackson CR, Dugas SL. Phylogenetic analysis of bacterial and archaeal arsC gene sequences suggests an ancient, common origin for arsenate reductase［J］. BMC Evol Biol, 2003, 3（1）：1-10.

［34］ Sultana M, Vogler S, Zargar K, et al. New clusters of arsenite oxidase and unusual bacterial groups in enrichments from arseniccontaminated soil［J］. Arch Microbiol, 2012, 194（7）：623-635.

［35］ Cordi A, Pagnout C, Devin S, et al. Determination of physiological, taxonomic, and molecular characteristics of a cultivable arsenicresistant bacterial community［J］. Environ Sci Poll Res, 2015, 22（18）：13753-13763.

［36］ 洪雪花, 張婉靜, 張愛(ài), 等. 環(huán)境砷的存在狀態(tài)、生物轉(zhuǎn)化和修復(fù)研究進(jìn)展［J］. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 26（4）：567-571.

［37］ Shagol CC, Krishnamoorthy R, Kim K, et al. Arsenic-tolerant plantgrowth-promoting bacteria isolated from arsenic-polluted soils in South Korea［J］. Environ Sci Pollut Res, 2014, 21（15）：9356-9365.

［38］ 文一, 廖曉勇, 閻秀蘭. 鏈霉菌的抗砷特性及其對(duì)蜈蚣草富集砷的作用［J］. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2013, 8（2）：186-193.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Isolation，Identification and Characterization of Arsenic-tolerant Bacteria from Lead-zinc Mine Tailing

WU Dan ZHANG Zhi-peng MA Yu-chao
（College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083）

The aim of this study is to isolate highly arsenic-tolerant bacterial strains from heavy metal contaminated soils from the Kangjiawan lead-zinc mine，Hunan Province. Serial dilution and plating method was used to isolate arsenic-tolerant bacteria，and the strains were identified by 16S rRNA sequence analysis. Then the detection of arsenic tolerance-related genes was carried out. The arsenic molybdenum blue experiment was conducted to evaluate arsenic oxidation-reduction ability of arsenic-tolerant bacteria. Furthermore，the indole acetic acid（IAA）produced by the dominant bacterial strains was quantitatively determined. A total of 152 arsenic-tolerant bacterial strains were isolated from soils samples，and six strains were resistant to As5+and As3+up to 800 mmol/L and 20 mmol/L，respectively. The six arsenictolerant bacterial strains belonged to five different genera，Pseudomonas，Ochrobactrum，Bacillus，Williamsia，and Arthrobacter. In arsenic tolerance-related gene detection experiments，arsenate reductase gene arsC existed in strains Tw31，Tw133，Sw149，and Tw222，and strains Bw218 and Tw222 contained arsenic ion efflux permease gene arsB/ACR3（2）. Within 72 h，the As3+oxidation rate and As5+reduction rate of strains Tw133 and Tw222 were higher than those of other strains，which were about 17 % and 35 %，respectively. In particular，strain Tw133 had an As5+reduction rate of 48.66 % at 144 h. Moreover，the synthetic quantities of IAA in the two strains were 42.86 μg/mL and 24.36 μg/mL，respectively. The isolated strains Tw133 and Tw222 showed obvious advantages in terms of arsenic tolerance，arsenic oxidationreduction capacity and IAA production，providing experimental materials for the further study of arsenic-tolerant mechanism in bacteria.

arsenic-tolerant bacteria；arsenic-tolerant gene；arsenic oxidation-reduction；IAA

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-0983

2016-10-27

國(guó)家十二五科技支撐計(jì)劃（2012BAC09B03），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（J1310005），北京市科技新星項(xiàng)目（2011033），中央高校基本科研基金項(xiàng)目（2016JX03）

吳丹，女，碩士研究生，研究方向：重金屬污染土壤中耐砷微生物；E-mail：wuzhdan@163.com

馬玉超，女，博士，副教授，研究方向：微生物資源開(kāi)發(fā)與利用；E-mail：mayuchao@bjfu.edu.cn