基于金磁微粒模擬酶電化學增強體系檢測抗壞血酸

龔德狀，關樺楠*，吳巧艷，宋 巖，劉 博，楊 帆，張 娜

（哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076）

抗壞血酸即水溶性VC，是人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)，在各種生理和病理過程中起著不可或缺的作用。由于其特殊的理化特性，被廣泛應用于各種食品相關行業(yè)[1-4]。因此，建立一種簡便、可靠、快速和高選擇性的檢測和定量抗壞血酸的方法十分必要。近年來，人們提出了許多檢測抗壞血酸的方法，如比色法、色譜法、光譜法和電化學傳感器等[5-7]。其中，電化學傳感檢測法因其具有靈敏度高、操作簡單、響應速度快和檢出限低等優(yōu)點不斷進入人們的視野。電化學酶生物傳感器將酶與底物相互作用和電化學分析功能相結(jié)合，是目前最常用的生物傳感平臺，但其同時也存在穩(wěn)定性差、信號較弱、酶促反應時間較長和基底效應等缺陷。與此相比，引入納米模擬酶與電化學分析相結(jié)合的方法具有高穩(wěn)定性、高靈敏度、高選擇性和低成本等優(yōu)勢[8-9]。

天然酶穩(wěn)定性差且成本較高等諸多固有缺點限制了其應用[10-11]。無機納米材料作為酶模擬材料，由于其穩(wěn)定性好、成本低等優(yōu)點而受到越來越多的關注，并在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、化學工業(yè)和食品加工等領域有著重要的應用[12-13]。Fe3O4納米粒子作為一種功能材料，具有良好的過氧化物模擬酶的活性[14]。此外，F(xiàn)e3O4納米粒子還具有無毒和良好的生物相容性，因而被廣泛應用于有害物質(zhì)去除、光熱反應、目標物質(zhì)分離富集、生物傳感分析和工業(yè)催化等領域[15-17]。金納米粒子（AuNPs）被報道同樣具有過氧化物模擬酶活性，且因其良好的生物相容性，易于合成和結(jié)合，已在生物傳感[18]、生物成像[19]、醫(yī)學診斷學和治療學[20]中得到了成功的應用。同時，它是一種非常有效的保護磁性納米粒子的涂層材料，在表面改性、高催化性能及其獨特的生物化合物方面也具有廣泛的用途[21-22]。

本實驗采用自組裝方法制備出金磁微粒（Fe3O4@Au），見圖1?；贔e3O4@Au模擬過氧化物酶活性，構(gòu)建出一種針對抗壞血酸的高靈敏度無酶增強型電化學檢測方法。Fe3O4@Au模擬過氧化物酶中的Fe3+和Au0可以分別催化H2O2反應產(chǎn)生具有氧化活性的自由基[7,23-24]，可進一步催化抗壞血酸在電極表面失電子發(fā)生氧化還原反應，進而氧化為脫氫抗壞血酸。該氧化反應過程中電極表面會積累大量電子，增大電流響應，從而可以改善抗壞血酸電化學檢測的靈敏度。這種將模擬酶與電化學相結(jié)合的檢測方法無需修飾電極即可增強整體電化學信號的有效輸出。該研究結(jié)果將為拓寬納米材料模擬酶在不同食品電化學檢測方法中的應用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

六水氯化鐵、乙酸鈉、PEG-4000、抗壞血酸、過氧化氫 天津市科密歐化學試劑有限公司；3-氨丙基-3-乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，APTES）淮安和元化工有限公司；HAuCl4國藥集團化學試劑有限公司；VC泡騰片（2.25 mg/g） 哈爾濱市人民同泰藥店；本實驗所用試劑均為分析純。

圖1 基于FFee3O4@Au電化學檢測抗壞血酸示意圖Fig. 1 Schematic illustration of the electrochemical detection of ascorbic acid based on the Fe3O4@Au

1.2 儀器與設備

CHI660E型電化學工作站 上海辰華儀器有限公司；85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 常州越新儀器制造有限公司；水熱合成釜 西安洪辰儀器廠；DK-98-1電熱恒溫水浴鍋天津泰斯特儀器有限公司；恒溫振蕩搖床 金壇市精工儀器設備有限公司；MAGNA-IR560E.S.P型傅里葉變換紅外光譜儀 美國Nicolet公司；Phi-5000Versaprobe型X射線光電子能譜儀 美國ULVCA-PHI公司；JEM 2100型透射電子顯微鏡 日本電子株式會社；LDJ 9600型振動磁強計 美國LDJ Electronics公司。

1.3 方法

1.3.1 Fe3O4@Au的制備與表征

將4.2 g的NaAc·3H2O和1.2 g的PEG-4000依次加入到含有2.0 g FeCl3·6H2O的60 mL乙二醇溶液中，攪拌后使其形成均勻溶液。再將溶液倒入水熱合成釜中，180 ℃反應10 h后冷卻至室溫，所得產(chǎn)物依次用乙醇和水洗滌后備用。

取80 g葡萄皮在200 mL 80 ℃的蒸餾水中浸泡20 min，將浸泡液于3 000 r/min離心5 min，取上清液作為母液。在使用去離子水稀釋母液獲得200 mL濃度為母液30%的葡萄皮工作液。將6 mL的葡萄皮工作液迅速加入到盛有25 mL HAuCl4溶液（4 ℃預冷）的燒杯中，在恒溫磁力攪拌器的均勻攪拌下，觀察溶液顏色變化，當溶液顏色出現(xiàn)酒紅色時，加快攪拌速度，30 min后結(jié)束反應，將反應液置于4 ℃條件下保存。

取4 g制備的Fe3O4納米微粒超聲分散在60 mL 20%乙醇溶液中，逐滴加入2 mL APTES，將其置于150 r/min的恒溫振蕩搖床中充分振蕩10 h后得到帶有細小顆粒的淺棕色懸濁液，產(chǎn)物即為氨基化Fe3O4磁性納米微粒。所得納米微粒采用0.1 mol/L的HCl-乙醇溶液分離清洗3 次，烘干備用。取上述制備的氨基化改性的Fe3O4納米微粒3 g于室溫下邊攪拌邊加入30 mL所制備的AuNPs溶液，充分混合低速攪拌反應10 h后，分離烘干，獲得Fe3O4@Au復合磁性納米微粒。

1.3.2 Fe3O4@Au模擬酶活性驗證

本實驗采用循環(huán)伏安（cyclic voltammetry，CV）法評估Fe3O4@Au對抗壞血酸的電化學響應行為。所有電化學實驗采用CHI660E型電化學工作站三電極系統(tǒng)完成，其中，玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE）為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑電極為輔助電極。

制備5 種不同的反應體系驗證Fe3O4@Au在電化學體系中的過氧化物模擬酶活性：1）H2O2+抗壞血酸體系：向盛有10 mL HAc-NaAc緩沖液（pH 5）的小燒杯中加入200 μL的H2O2標準溶液（50 mmol/L），采用電熱恒溫水浴鍋將反應體系加熱至恒定20 ℃（加熱過程中每隔1 min溫和搖晃一次，下同），最后加入200 μL抗壞血酸標準溶液（10 mmol/L）。2）單獨抗壞血酸體系：將盛有10 mL HAc-NaAc緩沖液（pH 5）的小燒杯加熱至恒定20 ℃后加入200 μL抗壞血酸標準溶液（10 mmol/L）。3）H2O2+Fe3O4@Au體系：將0.01 g的納米Fe3O4@Au粉末加入到盛有10 mL HAc-NaAc緩沖液（pH 5）的小燒杯中，將反應體系加熱至恒定20 ℃后加入200 μL H2O2標準溶液（50 mmol/L）。4）抗壞血酸+Fe3O4@Au體系：將0.01 g的納米Fe3O4@Au粉末加入到盛有10 mL HAc-NaAc緩沖液（pH 5）的小燒杯中，將反應體系加熱至恒定20 ℃后加入200 μL抗壞血酸標準溶液（10 mmol/L）。5）H2O2+抗壞血酸+Fe3O4@Au體系：將0.01 g的納米Fe3O4@Au粉末加入到盛有10 mL HAc-NaAc緩沖液（pH 5）的小燒杯中，再加入200 μL H2O2標準溶液（50 mmol/L），混勻后，將反應體系加熱至恒定20 ℃充分反應15 min后，加入200 μL抗壞血酸標準溶液（10 mmol/L）。調(diào)節(jié)電化學工作站掃描速率為100 mV/s。利用CV法監(jiān)測1）～5）氧化峰電流并取其絕對值，將其作為體系指標，指標越大越好，重復實驗3 次。

1.3.3 單因素試驗優(yōu)化抗壞血酸電化學檢測體系

將不同質(zhì)量的納米Fe3O4@Au粉末（0.002 5、0.005、0.007 5、0.01 g和0.012 5 g）分別加入到盛有不同pH值（pH 4、5、6、7、8和9）10 mL HAc-NaAc緩沖液的燒杯中，再加入200 μL H2O2標準溶液（50 mmol/L），混勻后，采用電熱恒溫水浴鍋將反應體系加熱至不同恒定溫度（20、30、40、50 ℃和60 ℃）充分反應15 min后（加熱過程中每隔1 min溫和搖晃一次），加入200 μL抗壞血酸標準溶液（10 mmol/L）。調(diào)節(jié)電化學工作站不同掃描速率（20、40、60、80 mV/s和100 mV/s）。采用三電極系統(tǒng)，利用CV法檢測體系中的抗壞血酸，監(jiān)測氧化峰電流絕對值，將其作為體系指標，指標越大越好，重復實驗3 次。

1.3.4 正交試驗設計優(yōu)化抗壞血酸電化學檢測體系

選擇L9（34）正交試驗設計，分別考察反應溫度（A）、Fe3O4@Au添加量（B）、掃描速率（C）和pH值（D）對整個實驗體系的影響，每種因素設計3 個水平（根據(jù)單因素試驗優(yōu)化得出），采用電化學工作站三電極系統(tǒng)，利用CV法檢測體系中的抗壞血酸濃度，監(jiān)測氧化峰電流絕對值的變化，重復實驗3 次，并確定因素影響的主次順序及優(yōu)選方案。

1.3.5 抗壞血酸檢測體系的電化學響應

按照優(yōu)化實驗得出的最適電化學檢測體系考察抗壞血酸檢測的電化學響應特性，根據(jù)不同濃度抗壞血酸和氧化峰電流絕對值繪制工作曲線，計算檢出限。選擇2.5 mmol/L和10 mmol/L抗壞血酸標準溶液加入到電化學檢測體系中，監(jiān)測氧化峰電流絕對值，重復實驗3 次，結(jié)果取平均值帶入工作曲線回歸方程，測定其回收率。為驗證傳感體系在檢測過程中的抗干擾性能，在最優(yōu)實驗條件下向電化學檢測體系中分別加入濃度為0.25 mol/L的K2SO4、NaCl、蔗糖、乳糖、酪氨酸和甘氨酸這些食品樣品中常見的物質(zhì)，觀察氧化峰電流絕對值的變化，對其抗干擾性能進行評估。

1.3.6 實際樣品檢測

為了驗證該電化學方法在實際樣品中的可行性，選擇VC含量為2.25 mg/g的泡騰片作為樣品，將其研磨成均勻粉末。分別準確稱取45、90 mg和180 mg樣品配制成100 mL樣品溶液，并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中待用。按照抗壞血酸最優(yōu)電化學檢測體系分別監(jiān)測3 種不同濃度樣品溶液的氧化峰電流絕對值，重復實驗3 次，測定其回收率并評價檢測體系的精確度。

2 結(jié)果與分析

2.1 Fe3O4@Au的表征

圖2分別顯示了AuNPs、Fe3O4磁性納米顆粒和Fe3O4@Au復合納米粒子的透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）圖像。圖2a顯示了AuNPs大小及分布，平均粒徑為3～6 nm。圖2b所示的Fe3O4磁粉團簇由表面粗糙的分散球組成，F(xiàn)e3O4團簇的平均直徑約為85 nm。由圖2c可以看出，AuNPs均勻吸附在Fe3O4表面，且與Fe3O4納米粒子相比，鍍金后Fe3O4@Au納米粒子的粒徑增大，約為150 nm。采用超導量子干涉裝置磁強計對Fe3O4磁粉團簇和Fe3O4@Au進行磁滯測量，磁學性質(zhì)分析表明，在300 K時，F(xiàn)e3O4團簇的飽和磁化強度為65 emu/g，在AuNPs的作用下，F(xiàn)e3O4@Au的飽和磁化強度降低到46 emu/g。說明AuNPs包覆會導致復合微粒磁化強度的輕微降低，對其超順磁性性質(zhì)有輕微的影響。

圖2 AuNPs（a）、Fe3O4（b）和Fe 3O4@Au（c）團簇的TEM圖像Fig. 2 TEM images of AuNPs (a), Fe 3O4(b) and Fe3O4 @Au (c) clusters

2.2 Fe3O4@Au模擬酶電化學增強活性驗證

采用電化學分析法對Fe3O4@Au復合納米微粒的模擬酶活性進行驗證。由圖3可知，在Fe3O4@Au存在條件下，低濃度H2O2不能產(chǎn)生氧化電流峰，說明在裸電極條件下，F(xiàn)e3O4@Au與低濃度H2O2體系的靈敏度不足以產(chǎn)生電流響應[23]；與此同時，H2O2和Fe3O4@Au卻可以分別與抗壞血酸在電位為0.5 V左右處產(chǎn)生氧化電流峰，說明兩者皆可以與抗壞血酸單獨發(fā)生氧化還原反應，需要強調(diào)的是，F(xiàn)e3O4@Au是催化溶液中的氧與抗壞血酸發(fā)生反應，體現(xiàn)出了過氧化物模擬酶的活性；而當H2O2和Fe3O4@Au同時存在時，體系中出現(xiàn)抗壞血酸，氧化峰電流得到較大提升，說明H2O2和Fe3O4@Au合作可以極大促進抗壞血酸電催化氧化為脫氫抗壞血酸產(chǎn)生明顯的電荷轉(zhuǎn)移[24]，進而增強抗壞血酸的檢測靈敏度。綜上所述，論證了Fe3O4@Au模擬酶起到增強體系電化學信號的作用。同時，也借此推斷Fe3O4@Au具有過氧化物模擬酶活性。

圖3 FFee3O4@Au模擬酶活性驗證Fig. 3 Veri fication of the peroxidase-like activity of Fe3O4@Au

2.3 單因素試驗設計優(yōu)化電化學檢測抗壞血酸體系

2.3.1 反應溫度對電化學檢測體系的影響

圖4 電化學檢測的單因素試驗優(yōu)化Fig. 4 Optimization of electrochemical detection conditions

由圖4a可知，反應溫度在20～30 ℃之間，反應速率減小，電極表面的電子轉(zhuǎn)移數(shù)目減少，電化學信號減弱，氧化峰電流絕對值呈緩慢下降趨勢，30～50 ℃范圍內(nèi)，隨溫度升高，F(xiàn)e3O4@Au模擬酶的催化活性降低導致反應速率減小，電極表面的電子轉(zhuǎn)移數(shù)目減少，氧化峰電流絕對值隨之降低。反應溫度在50～60 ℃范圍內(nèi)時，氧化峰電流絕對值下降速率開始變緩，這可能是由于溫度升高，在一定程度上加快了抗壞血酸的電氧化，增強了電化學響應。鑒于此，選取20、30 ℃和40 ℃作為反應溫度的不同水平參與正交試驗設計優(yōu)化。

2.3.2 Fe3O4@Au添加量對電化學檢測體系的影響

由圖4b可知，電化學檢測體系中Fe3O4@Au添加量在0.002 5～0.005 g范圍內(nèi)，氧化峰電流絕對值平穩(wěn)上升。添加量在0.005～0.007 5 g區(qū)間內(nèi)，反應速率略微減小，但氧化峰電流絕對值仍呈穩(wěn)定上升趨勢。當添加量處于0.007 5～0.01 g范圍內(nèi)時，反應速率迅速上升，氧化峰電流絕對值隨之大幅度增加，這可能是由于隨著電化學檢測體系中Fe3O4@Au添加量的增加，一方面增大了體系中模擬酶活性，促進抗壞血酸電氧化產(chǎn)生電子轉(zhuǎn)移；另一方面，有微量Fe3O4@Au附著于電極表面，增大了電極靈敏度，電子轉(zhuǎn)移速率顯著提高。而添加量在0.01～0.012 5 g范圍時，反應速率迅速下降，氧化峰電流絕對值也迅速降低，原因是隨著檢測體系中Fe3O4@Au的增加，納米粒子產(chǎn)生團聚現(xiàn)象，導致催化效果大大降低[25]。由此可知，F(xiàn)e3O4@Au添加量在0.01 g時電化學檢測效果最優(yōu)。因此，F(xiàn)e3O4@Au添加量選取0.007 5、0.01 g和0.012 5 g參與正交試驗設計優(yōu)化。

2.3.3 掃描速率對電化學檢測體系的影響

在考察掃描速率對檢測體系影響的過程中，本實驗不僅要篩選出合適的水平，還要鑒定其與電流的線性關系。由圖4c可知，不同掃描速率下抗壞血酸氧化峰電流絕對值隨著掃描速率的增加而增加。且氧化峰電流絕對值|ipa|（μA）與掃描速率平方根v1/2（V/s）1/2之間呈良好的線性關系，回歸方程為：|ipa|=48.706v1/2－0.964 4，R2=0.990 4。這種線性關系表明抗壞血酸的氧化反應為擴散控制，更有利于安培傳感，產(chǎn)生更強的電化學信號?？箟难岬碾姶呋趸ㄟ^雙電子雙質(zhì)子途徑進行[26-28]。實驗結(jié)果表明，當掃描速率大于0.1 V/s時會影響抗壞血酸電化學檢測體系的穩(wěn)定性，不利于氧化電流峰的監(jiān)測。因此，在正交試驗優(yōu)化選擇掃描速率為0.06、0.08 V/s和0.1 V/s最為適合。

2.3.4 pH值對電化學檢測體系的影響

如圖4d所示，檢測體系pH 5時，氧化峰值電流強度最大，這是由于在pH 5的介質(zhì)中，質(zhì)子數(shù)量較少，抗壞血酸釋放出的2 個電子很容易轉(zhuǎn)移到電極上，以產(chǎn)生更強的電化學信號。而當電解質(zhì)溶液pH 4時，會有大量的質(zhì)子，這些質(zhì)子會覆蓋從抗壞血酸釋放出來的電子，從而阻礙電子流動。電解質(zhì)溶液pH值在5～9范圍內(nèi)，介質(zhì)中均含有大量負離子，不利于電子向電極的流動，電子遷移率逐漸降低[29-30]。由此可知，檢測體系pH值選取5、6、7參與正交試驗。

2.4 正交試驗設計優(yōu)化電化學檢測體系

通過正交試驗設計優(yōu)化極差分析結(jié)果可知（表1），各因素對抗壞血酸電化學檢測體系影響的主次順序為：C＞D＞A＞B，即掃描速率＞pH值＞反應溫度＞Fe3O4@Au添加量。根據(jù)極差分析可以確定最優(yōu)方案組合為A3B2C3D3，即反應溫度20 ℃、Fe3O4@Au添加量0.01 g、掃描速率0.1 V/s、電解液pH 5。綜合以上分析可知，影響抗壞血酸電化學檢測體系的主要因素是掃描速率、反應溫度、Fe3O4@Au添加量和pH值對檢測體系也有相應影響。由于該檢測電極未經(jīng)修飾，僅用乙醇和超純水沖洗即可很容易地再生檢測系統(tǒng)，具有較高的便捷性和穩(wěn)定性。以正交結(jié)果最優(yōu)方案對10 mmol/L抗壞血酸進行獨立的3 次平行電化學檢測，氧化峰電流絕對值的平均值為14.12 μA，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為2.08%。表明該電化學檢測體系具有良好的精密度。

表1 正交試驗設計及結(jié)果Table 1 Orthogonal array design with experimental results

2.5 抗壞血酸檢測體系的電化學響應效果

2.5.1 電化學檢測體系的工作曲線、檢出限和回收率測定

圖5 不同濃度抗壞血酸標準溶液的CCVV曲線Fig. 5 CV curves of AA at different concentrations

如圖5可知，在1～100 mmol/L范圍內(nèi)，隨著抗壞血酸標準溶液濃度的增加，氧化峰電流絕對值逐漸增大。同時，對不同濃度的抗壞血酸標準溶液作工作曲線，抗壞血酸在1～100 mmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關系，工作曲線回歸方程為y=867.81x+3.860 8（R2=0.991 9），其中y代表CV的氧化峰電流絕對值（μA），x代表抗壞血酸的濃度（mmol/L）。根據(jù)方程計算檢出限（RSN=3）為0.011 7 mg/L。在相同電化學檢測體系下檢測2.5 mmol/L和10 mmol/L的抗壞血酸標準溶液的氧化峰電流絕對值，根據(jù)工作曲線回歸方程，評價該催化檢測體系回收率分別為92.6%和105.8%。將Fe3O4@Au在本研究中檢測性能與先前報道的基于其他納米材料的檢測抗壞血酸方法進行比較。由表2可知，本研究與其他文獻報道檢測抗壞血酸方法相比具有相對較低的檢出限，說明此基于Fe3O4@Au電化學檢測抗壞血酸的方法具有良好的靈敏度。

表2 基于不同納米材料的抗壞血酸電化學檢測方法的比較Table 2 Comparison of different nanomaterial-based methods for electrochemical detection of AA

2.5.2 電化學檢測體系抗干擾性能

為了評估該電化學檢測方法的抗干擾性能，分別將濃度為0.25 mol/L的K2SO4、NaCl、蔗糖、乳糖、酪氨酸和甘氨酸加入到電化學檢測體系中，選擇2.5 mmol/L抗壞血酸的體系作為參照進行對比研究。每種添加物的濃度均為抗壞血酸濃度的100 倍。從圖6可以看出，該電化學檢測體系對0.25 mol/L的K2SO4、NaCl、蔗糖、乳糖、酪氨酸和甘氨酸沒有表現(xiàn)出明顯的電流響應。然而，2.5 mmol/L抗壞血酸具有明顯的電流響應。綜上所述，該方法對抗壞血酸具有較高的選擇性。

圖6 抗壞血酸檢測體系的選擇性Fig. 6 Selectivity of AA detection system

2.6 實際樣品檢測結(jié)果

為了探討構(gòu)建電化學檢測體系在實際樣品中的應用，在相同體系下檢測含有0.45、0.9 g/L和1.8 g/L質(zhì)量濃度抗壞血酸的VC泡騰片溶液的氧化峰電流絕對值，帶入工作曲線回歸方程，對檢測體系進行回收率評價。結(jié)果（表3）表明，該檢測體系回收率分別為95.4%、91.9%和103.8%。重復測定3 次，RSD分別為3.97%、4.51%和3.18%，說明該電化學檢測體系對VC泡騰片具有良好的回收率和精密度。

表3 檢測實際樣品加標回收率和精密度Table 3 Recovery rates and precision of real samples spiked with different concentrations of AA

3 結(jié) 論

本實驗基于復合納米模擬酶構(gòu)建一種無酶電化學傳感器，以實現(xiàn)對食品中抗壞血酸含量的高靈敏度和高選擇性電化學檢測。結(jié)果表明，所制備的Fe3O4@Au具有良好的過氧化物模擬酶活性，本研究與其他文獻報道的檢測方法相比具有相對較低的檢出限。另一方面，該電化學檢測體系表現(xiàn)出較高的敏感性，對共存分子具有優(yōu)異的抗干擾能力，且無需對電極進行修飾，可獲得良好的穩(wěn)定性和便捷性。實際樣品分析中抗壞血酸的電化學檢測性能良好，說明所構(gòu)建的電化學傳感器具有較高的實用性。相關研究結(jié)果將為食品中抗壞血酸電化學檢測方法的改良積累基礎資料。