小檗堿對(duì)銅綠假單胞菌密度感應(yīng)缺陷株及其分泌的致病因子的作用研究*

夏 飛， 肖紅兵， 杜 鳴， 廖亞玲， 張明偉， 王 平

1湖北省第三人民醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 4300332湖北省武漢市黃陂區(qū)蔡店街道衛(wèi)生院，武漢 4303233湖北省武漢市第一醫(yī)院漢西分院，武漢 430022

小檗堿對(duì)銅綠假單胞菌密度感應(yīng)缺陷株及其分泌的致病因子的作用研究*

夏 飛1， 肖紅兵2， 杜 鳴1， 廖亞玲1， 張明偉1， 王 平3△

1湖北省第三人民醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 4300332湖北省武漢市黃陂區(qū)蔡店街道衛(wèi)生院，武漢 4303233湖北省武漢市第一醫(yī)院漢西分院，武漢 430022

目的 觀察小檗堿對(duì)銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)密度感應(yīng)缺陷株的生長(zhǎng)及其分泌的致病因子的影響，初步探索小檗堿對(duì)銅綠假單胞菌密度感應(yīng)系統(tǒng)及調(diào)控致病因子表達(dá)的作用機(jī)制。方法 不同濃度小檗堿分別與銅綠假單胞菌野生株P(guān)AO1、密度感應(yīng)系統(tǒng)(quorum sensing system，QS)基因缺陷株P(guān)AO JP2、臨床分離QS缺陷株共培養(yǎng)，運(yùn)用倍比稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度，紫外分光光度法測(cè)定綠膿菌素分泌量，苔黑酚法測(cè)定鼠李糖脂水平，結(jié)晶紫法測(cè)定生物被膜起始量，熒光定量PCR檢測(cè)各株QS基因表達(dá)。結(jié)果 小檗堿對(duì)銅綠假單胞菌野生株P(guān)AO1 MIC值為12.50 mg/mL，臨床分離株C84 MIC值為1.56 mg/mL，PAO JP2株與C39株MIC值均為3.12 mg/mL，C104和C117株MIC值均為6.25 mg/mL。在低于MIC濃度下，小檗堿對(duì)PAO1株、C104株、C117株綠膿菌素水平有顯著抑制，且對(duì)各QS缺陷株鼠李糖脂有不同程度抑制作用。此外，PAO JP2株、C39株、C84株生物被膜可被小檗堿顯著抑制。各株殘留的LasR和rhI轉(zhuǎn)錄均受到小檗堿顯著抑制。結(jié)論 小檗堿對(duì)臨床分離QS缺陷株有良好的抑制作用，可能通過調(diào)節(jié)QS基因多種不同細(xì)菌毒力因子進(jìn)行調(diào)控。

銅綠假單胞菌； 小檗堿； 密度感應(yīng)缺陷； 致病因子

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)是臨床常見人體定植菌，可在機(jī)體抵抗力低下時(shí)誘發(fā)感染[1]。該菌對(duì)多種抗生素具有天然耐藥能力，使得臨床抗感染治療面臨巨大風(fēng)險(xiǎn)，輕者病情遷延不愈，重者發(fā)生肺囊性纖維化直至死亡[2]。該菌還有多種致病因子，包括胞外蛋白酶、酯酶、毒素、鞭毛和菌毛等[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌耐藥與該菌密度感應(yīng)系統(tǒng)(quorum sensing system，QS)調(diào)控相關(guān)[4]。這使對(duì)銅綠假單胞菌的防治有了新的可能，即通過干擾密度感應(yīng)系統(tǒng)抑制細(xì)菌耐藥與減弱細(xì)菌毒力和侵襲力[5-6]，然而臨床上仍然有一部分從銅綠假單胞菌感染病例中分離的菌株為QS缺陷株[7]，這表明該菌致病力的調(diào)控方面還有很多未為人知。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)黃連有效成分小檗堿對(duì)野生銅綠假單胞菌PAO1株具有殺菌或抑制作用，且對(duì)致病因子具有負(fù)調(diào)控作用[7-8]。故在前期研究基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步探討小檗堿對(duì)QS系統(tǒng)的干預(yù)作用及機(jī)制，本研究以臨床分離的QS功能缺陷菌株為對(duì)象，研究小檗堿對(duì)QS功能缺陷株的影響，以期豐富中藥活性成分對(duì)細(xì)菌密度感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控的干預(yù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用菌株及藥物 野生菌株P(guān)AO1和QS基因缺陷株P(guān)AO JP2為湖北省第三人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室保存。QS功能缺陷株C39、C84、C104、C117為前期研究分離與保存[7]，菌株特性見表1。實(shí)驗(yàn)前3 d，取上述保存于-80℃菌株快速解凍，取菌液接種于瓊脂平板，48 h后挑取生長(zhǎng)良好的菌落于LB培養(yǎng)液37℃ 150 r/min培養(yǎng)過夜，取適量菌液用LB培養(yǎng)液稀釋至A600 nm0.6備用。小檗堿(西安沃森生物科技有限公司，批號(hào)：20140619)，純度98%。

表1 實(shí)驗(yàn)用銅綠假單胞菌菌株QS基因與生物學(xué)特性

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 剛果紅彈性蛋白(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：108K3575)；0.2 mol/L鹽酸溶液；10 mmol/L Na2HPO4溶液；酵母提取物(Oxoid LP0021，批號(hào)：1606468)；胰蛋白胨(OxiA LP0042，批號(hào)：1658785)；氯化鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20121022)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 紫外分光光度計(jì)(HITACH U-2900、Amersham Genequant pro)；生物安全柜(蘇州安泰，BHC-1300ⅡA/B3)；小型臺(tái)式高速離心機(jī)(Eppendorf，5415D)；低溫高速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司，H2050R)；臺(tái)式恒溫振蕩器(太倉(cāng)華美生化儀器廠，THZ-C)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司，DNP-9272BS-Ⅲ)；熒光定量PCR儀(Life Technologies，ABI 7500 Fast)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 最小抑菌濃度測(cè)定 根據(jù)前期研究結(jié)果采取微量倍比稀釋法將小檗堿稀釋為0.39～25 mg/mL濃度梯度。陰性對(duì)照組加入2 mL LB培養(yǎng)液。取新鮮菌液稀釋至A600 nm0.6，每管加入0.1 mL。混勻后置恒溫振蕩搖床37℃、150 r/min培養(yǎng)18 h；觀察每孔細(xì)菌生長(zhǎng)情況，以最低無可見細(xì)菌生長(zhǎng)濃度為最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentrations，MIC)。隨后10 000 r/min離心細(xì)菌懸液1 min，分離細(xì)菌沉淀與上清。向沉淀中加入2 mL 0.85% NaCl溶液(含0.1%吐溫80)，反復(fù)吹吸后，轉(zhuǎn)移至振蕩儀振蕩2 min，測(cè)定菌液吸光度值A(chǔ)600 nm。設(shè)立PAO1陽(yáng)性對(duì)照和不加小檗堿的各分離株平行對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。根據(jù)MIC值，選擇最接近MIC的亞MICs濃度開展下列實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 綠膿菌素測(cè)定 收集實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組培養(yǎng)上清，加入2 mL氯仿充分振蕩，靜置分層后分離下層溶液。取下層液體加入0.2 mol /L HCl 0.8 mL并充分振蕩后靜置，分離上層液體以16 000 g離心2 min，取上清測(cè)定A520 nm值[9]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 鼠李糖脂測(cè)定 采用苔黑酚法Ⅲ測(cè)定鼠李糖脂水平[10]，取上述各組培養(yǎng)上清1 mL加入乙醚振蕩后凍干抽提。抽提物加入0.5 mL雙蒸水定容，取100 μL溶液加入900 μL苔黑酚中(含53% H2SO4，V/V)，置80℃加熱30 min后，冷卻至室溫，并測(cè)量A421 nm值，所得值代入函數(shù)關(guān)系式中計(jì)算鼠李糖含量，并以1 g鼠李糖=2.5 g鼠李糖脂計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 生物被膜起始量測(cè)定 準(zhǔn)備1.5 cm長(zhǎng)硅膠管高壓滅菌后置玻管內(nèi)，加入A600 nm值為0.6的新鮮菌液3 mL，分別加入上述濃度藥液1 mL，37℃靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)到期后取出硅膠管轉(zhuǎn)移至空白玻管內(nèi)用蒸餾水清洗殘留浮游菌3次，用1%結(jié)晶紫室溫孵育15 min，用蒸餾水清洗3次后加入3 mL 95%乙醇洗滌，測(cè)定洗滌液A540 nm值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)和彈性蛋白酶實(shí)驗(yàn)，選取適宜濃度進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)QS基因表達(dá)。結(jié)果以2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次計(jì)算統(tǒng)計(jì)量。Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物并委托上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，見表2。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小檗堿對(duì)臨床分離株的最小抑菌濃度的檢測(cè)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了小檗堿對(duì)臨床分離銅綠假單胞菌

QS功能缺陷株的最小抑菌濃度(MIC)，結(jié)果見表3。小檗堿對(duì)野生株P(guān)AO1最低抑菌濃度為12.50 mg/mL，PAO JP2和C39株MIC值均為3.12 mg/mL，C104和C117株MIC值均為6.25 mg/mL。C84株MIC值為1.56 mg/mL，在各QS功能缺陷株中為最低。

表2 RT-PCR引物設(shè)計(jì)

表3 臨床分離銅綠假單胞菌QS缺陷株對(duì)小檗堿最小抑菌濃度±s，n=3)

2.2 小檗堿對(duì)臨床分離QS缺陷株綠膿菌素分泌水平的影響

選取各菌株的首個(gè)亞MICs梯度觀察其受QS調(diào)控的致病因子表達(dá)水平的變化。結(jié)果如圖1所示，C104和C117株的對(duì)照組綠膿菌素水平較PAO1株對(duì)照無明顯變化，而實(shí)驗(yàn)組PAO1株、C104株、C117株綠膿菌素水平較對(duì)照均有顯著降低(均P<0.05)。PAO JP2株、C39株、C84株幾乎不表達(dá)綠膿菌素(圖1B～D)，這與我們前期研究結(jié)果一致[8]。

2.3 小檗堿對(duì)臨床分離QS缺陷株鼠李糖脂的影響

繼續(xù)觀察上述條件下銅綠假單胞菌分泌鼠李糖脂的水平變化。結(jié)果如圖2所示，PAO1 JP2菌株幾乎不產(chǎn)生鼠李糖脂(圖2B)，各QS功能缺陷株對(duì)照組分泌鼠李糖脂的水平介于PAO1和PAO JP2之間(圖2C～F)。小檗堿實(shí)驗(yàn)組中，PAO1、C39、C84、C104、C107株分泌鼠李糖脂水平分別較對(duì)照組有顯著降低(均P<0.05)。

2.4 小檗堿對(duì)臨床分離QS缺陷株生物被膜起始量的影響

結(jié)果如圖3A所示，PAO1菌株在6.25 mg/mL小檗堿作用下，生物被膜起始量受到顯著抑制(P<0.05)。PAO JP2菌株生物被膜起始量亦明顯低于野生株P(guān)AO1株(圖3A～B)；其余臨床分離株生物被膜起始量同樣明顯低于野生株P(guān)AO1株(圖3A，3C～F)。在低于MICs濃度條件下，小檗堿作用于臨床分離菌株C39和C84的生物被膜起始量較對(duì)照組有顯著降低(P<0.05)，而C104和C117無顯著下降。

A：PAO1組；B：PAO JP2組；C：C39組；D：C84組；E：C104組；F：C117組；與同組對(duì)照比較，*P<0.05圖1 小檗堿對(duì)銅綠假單胞菌QS缺陷株分泌綠膿菌素的影響(n=3)Fig.1 Effects of berberine on the pyocyanin levels of clinically isolated QS-deficient P.aeruginosa strains(n=3)

A：PAO1組；B：PAO JP2組；C：C39組；D：C84組；E：C104組；F：C117組；與同組對(duì)照比較，*P<0.05圖2 小檗堿對(duì)銅綠假單胞菌QS缺陷株分泌鼠李糖脂的影響(n=3)Fig.2 Effects of berberine on rhamnolipid secretion by the clinically isolated QS-deficient P.aeruginosa strains(n=3)

A：PAO1組；B：PAO JP2組；C：C39組；D：C84組；E：C104組；F：C117組；與同組對(duì)照比較，*P<0.05圖3 小檗堿對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜形成的影響(n=3)Fig.3 Effect of berberine on the biofilm forming ability of P.aeruginosa strains(n=3)

2.5 小檗堿對(duì)臨床分離QS缺陷株密度感應(yīng)系統(tǒng)表達(dá)的影響

在6株QS缺陷株中，各株實(shí)驗(yàn)組QS基因的相對(duì)表達(dá)量較各株對(duì)照均有不同程度降低。其中，LasR基因，即編碼Las系統(tǒng)信號(hào)分子受體的基因在所有保留有LasR的菌株中均有顯著抑制(均P<0.05)，包括JP2、C39、C104、C117(圖4A～C、E)。與之對(duì)應(yīng)的是，在僅有rh1I保留的C84株中，rh1I相對(duì)表達(dá)量有顯著下降(圖4D)(P<0.05)。其余各菌株LasI、rh1R相對(duì)表達(dá)量雖沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但均呈下降趨勢(shì)。

A：PAO JP2組；B：C39組；C：C104組；D：C84組；E：C117組圖4 小檗堿對(duì)銅綠假單胞菌QS基因相對(duì)表達(dá)量的影響(n=3)Fig.4 Effect of berberine on the mRNA level of QS gene in P.aeruginosa strains(n=3)

3 討論

截止目前，已發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌密度感應(yīng)系統(tǒng)是由3個(gè)不同的子系統(tǒng)組成，包括Las系統(tǒng)、rhl系統(tǒng)、PQS系統(tǒng)。研究認(rèn)為這3個(gè)子系統(tǒng)參與調(diào)控的基因約占銅綠假單胞菌全基因的4% ～12%[4，11]。其中，Las系統(tǒng)和rhl系統(tǒng)是以N-乙酰高絲氨酸內(nèi)酯(N-acyl homoserine lactones，AHLs)作為信號(hào)分子，分別為3-O-C12-HSL和C4-HSL[12]；PQS系統(tǒng)則利用喹諾酮信號(hào)(Pseudomonas quinolone signal，PQS)完成密度感應(yīng)調(diào)控[13]。QS系統(tǒng)編碼并表達(dá)相應(yīng)的信號(hào)分子和受體，并以信號(hào)分子-受體復(fù)合物調(diào)控下游致病基因表達(dá)，此外各子系統(tǒng)間還呈現(xiàn)級(jí)聯(lián)調(diào)控和越級(jí)調(diào)控特征[1，14]。故銅綠假單胞菌的QS信號(hào)通路被認(rèn)為是一套有效而復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。

本研究首先發(fā)現(xiàn)QS系統(tǒng)缺失或突變會(huì)降低小檗堿環(huán)境下的細(xì)菌MICs，即有助于提高小檗堿對(duì)臨床分離株的體外抑菌效果。然而在小檗堿環(huán)境中，PAO JP2、C39、C84株綠膿菌素的表達(dá)水平無顯著變化，這進(jìn)一步表明該致病因子主要是受LasI和rhlI調(diào)控。故此二種基因發(fā)生缺失或缺陷后，綠膿菌素便無法表達(dá)，使得小檗堿未能對(duì)此3種菌株綠膿菌素產(chǎn)生抑制作用；而在C104和C117株中，僅有rhlI缺陷，故綠膿菌素水平的降低可能是受小檗堿對(duì)其余QS基因負(fù)調(diào)控的影響，特別是抑制LasI。對(duì)于鼠李糖脂，小檗堿未顯示出對(duì)PAO JP2株鼠李糖脂的負(fù)調(diào)控作用，提示鼠李糖脂的合成受LasI和rhlI的共同調(diào)控，即LasI和rhlI同時(shí)發(fā)生缺失或缺陷后，細(xì)菌便失去生成鼠李糖脂的能力。各臨床分離株鼠李糖脂水平均高于PAO JP2株，一方面符合各臨床分離株均未同時(shí)發(fā)生LasI和rhlI缺失或突變的特征；另一方面表明小檗堿可對(duì)QS缺陷株保留的多個(gè)QS基因產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用，如LasI和rhlI。與以上結(jié)果相異的是，小檗堿對(duì)各菌株生物被膜形成能力均有抑制作用，提示生物被膜的形成除有多種QS基因調(diào)控外，還有其他受小檗堿負(fù)調(diào)控的基因參與此過程。值得注意的是，在小檗堿環(huán)境中，4種QS基因的相對(duì)表達(dá)量均有不同程度降低，其中LasR和rhlI呈現(xiàn)顯著性降低，提示小檗堿對(duì)此2種基因轉(zhuǎn)錄的干預(yù)程度較LasI和rhl R顯著。但并不排除小檗堿對(duì)其余基因的潛在抑制作用，相關(guān)機(jī)制有待我們進(jìn)一步研究。

綜上所述，將小檗堿作為干預(yù)因素，利用銅綠假單胞菌野生株P(guān)AO1、雙缺陷株P(guān)AO JP2及4種臨床QS缺陷株為對(duì)象初步探索了QS基因?qū)Σ煌虏∫蜃拥母深A(yù)作用。初步發(fā)現(xiàn)小檗堿對(duì)QS功能缺陷株不同致病因子的調(diào)控模式不盡相同。這為深入開展銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)調(diào)控模式的基礎(chǔ)研究與中藥抗感染的臨床研究提供了新的研究方向與模式。

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(2016-12-15 收稿)

Inhibitory Effect of Berberine on the Growth and Virulence of Clinical Isolatesof Quorum Sensing-deficientPseudomonasaeruginosa

Xia Fei1，Xiao Hongbing2，Du Ming1etal

1DepartmentofPharmacy，TheThirdPeople’sHospitalofHubeiProvince，Wuhan430033，China2HealthCenterofCaidianStreetofHuangpiDistrict，Wuhan430323，China

Objective To investigate the effects of berberine on the growth and virulence of clinical isolates ofPseudomonasaeruginosa(P.aeruginosa)with quorum sensing(QS)deficiency and the underlying mechanism.MethodsP.aeruginosaPAO1，QS-deficient PAO JP2 and clinically isolated QS-deficient strains were cultured with berberine at difference concentrations.The minimum inhibitory concentrations(MICs)of berberine against different isolates were determined by double-dilution analysis.The secretion of pyocyanin was measured by ultraviolet spectroscopy，the amount of rhamnolipid by oricinol assay，the biofilm formation by crystal violet staining，and the transcription levels of QS gene by real-time PCR.Results The MICs of berberine againstP.aeruginosawere 12.50 mg/mL in the PAO1 strain，1.56 mg/mL in the C84 strain，3.12 mg/mL in both JP2 and C39 strains，and 6.25 mg/mL in both C104 and C117 stains.Berberine at sub-MIC could significantly decrease the pyocyanin levels in strains PAO1，C104，and C117，and suppress the rhamnolipid levels in QS-deficient stains to varying degrees.Additionally，the biofilm formation was profoundly inhibited by berberine in strains JP2，C39，and C84.The transcription of remaining LasR and rhI was significantly down-regulated by berberine at sub-MIC.Conclusion Berberine can significantly inhibit the growth of clinically isolated QS-deficientP.aeruginosastains and down-regulate the QS-dependent virulence by reducing the transcription levels of QS gene.

Pseudomonasaeruginosa； berberine； quorum-sensing deficiency； pathogenic factors

*湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2011CDB302)

R378.991

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.02.008

夏 飛，男，1978年生，助理研究員，E-mail：53042940@qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：WP0166@139.com