RhoA/Rho激酶信號通路與先天性尿道下裂發(fā)生的相關(guān)性研究*

余 謹， 趙振宇， 王新光， 劉海浪， 凌 青△

1武漢血液中心，武漢 4300302 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院泌尿外科，武漢 430030

RhoA/Rho激酶信號通路與先天性尿道下裂發(fā)生的相關(guān)性研究*

余 謹1， 趙振宇2， 王新光2， 劉海浪2， 凌 青2△

1武漢血液中心，武漢 4300302華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院泌尿外科，武漢 430030

目的 通過構(gòu)建先天性尿道下裂模型和在體外培養(yǎng)雄性胎鼠尿道海綿體組織來探討RhoA/Rho激酶信號通路在先天性尿道下裂發(fā)生中的作用。方法 通過鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯[di-(2-ethylhexyl)phthalate，DEHP]灌胃法建立先天性尿道下裂大鼠模型，處死大鼠獲得尿道海綿體組織后，免疫組化檢測RhoA和p-RhoA蛋白表達，熒光定量PCR(qPCR)檢測各組大鼠尿道海綿體組織中RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA的表達水平，Western blot檢測各組大鼠尿道海綿體組織中RhoA，p-RhoA，MLCP(myosin light chain phosphatase)，p-MLCP，MLC(myosin light chain)，p-MLC蛋白的表達情況。同時對胎鼠的尿道海綿體組織進行體外培養(yǎng)，使用RhoA/Rho激酶通路的抑制劑處理培養(yǎng)中的尿道海綿體組織，觀察RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA的表達水平。結(jié)果 成功構(gòu)建了大鼠尿道下裂模型。免疫組化結(jié)果顯示與對照組相比，先天性尿道下裂大鼠陰莖組織中p-RhoA表達明顯增加。qPCR結(jié)果顯示，先天性尿道下裂大鼠尿道海綿體組織中RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表達水平明顯高于對照組(均P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，先天性尿道下裂大鼠尿道海綿體組織中p-RhoA、p-MLCP、p-MLC蛋白的表達水平較對照組均明顯升高(均P<0.05)。體外培養(yǎng)尿道海綿體組織實驗發(fā)現(xiàn)，RhoA/Rho激酶通路抑制劑可阻礙RhoA/Rho激酶信號通路激活，從而抑制RhoA、ROCK1、ROCK2的表達并減輕DEHP對雄性胎鼠尿道段組織正常發(fā)育的抑制作用。結(jié)論 RhoA/Rho激酶信號通路激活與先天性尿道下裂的發(fā)生有關(guān)，抑制RhoA/Rho激酶信號通路激活可降低RhoA、ROCK1和ROCK2表達從而促進尿道海綿體組織正常發(fā)育。

RhoA； Rho激酶； 信號通路； 先天性尿道下裂

先天性尿道下裂是一種常見的兒童先天性尿道畸形之一，主要病理改變包括因先天性尿道發(fā)育異常而導(dǎo)致的陰莖短小、尿道口異位向陰莖腹側(cè)彎曲、包皮異常等一系列特征[1]。該病多發(fā)于新生兒，新生兒發(fā)病率高達1/(200～300)到1/51，并呈逐年上升趨勢[2-4]，且男性患者多于女性患者[5]。目前研究發(fā)現(xiàn)該病與遺傳、基因突變、內(nèi)分泌失調(diào)、異常的細胞間信息傳遞、雄激素受體異常和環(huán)境因素等息息相關(guān)[6]。手術(shù)矯正是目前唯一有效的治療方法[1]，包括Ⅰ期成形修復(fù)手術(shù)、陰莖頭靠近術(shù)、Duckett術(shù)式等方式[7]，但是，目前任何一種手術(shù)方式均伴有顯著的并發(fā)癥。早期研究已經(jīng)證實，RhoA/Rho激酶系統(tǒng)在陰莖海綿體及其血管維持平滑肌收縮和張力的生理過程中發(fā)揮了重要的作用[8]。

RhoA/Rho激酶信號通路在體內(nèi)普遍存在，包括3種關(guān)鍵信號分子：Rho激酶、Rho GTP酶和肌球蛋白磷酸酶[9]。小分子Rho GTP酶家族是Ras超家族成員，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的家族主要成員有：RhoA、RhoB、RhoC等，其中最主要的是RhoA[10]。大量的研究發(fā)現(xiàn)RhoA/Rho激酶信號系統(tǒng)在多種細胞生理機制中均發(fā)揮了介導(dǎo)調(diào)節(jié)作用,如細胞遷移和增殖、細胞收縮、胞質(zhì)分裂、基因表達調(diào)控、肌動蛋白細胞骨架重建、細胞粘附等[11-12]。研究還發(fā)現(xiàn)RhoA/Rho激酶介導(dǎo)的Ca2+敏感性途徑能使陰莖海綿體平滑肌及小動脈血管平滑肌處于收縮狀態(tài)，維持陰莖的疲軟狀態(tài)[13]。本課題旨在比較RhoA/Rho激酶在正常和先天性尿道下裂患兒尿道海綿體組織中的表達，探討RhoA/Rho激酶信號通路在先天性尿道下裂發(fā)生中的作用，為先天性尿道下裂的病因研究提供一定的參考依據(jù)，為臨床治療提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級健康雌性SD大鼠，40只，240～280 g，雄性10只，300～320 g，購于武漢大學實驗動物中心。所有SD大鼠飼養(yǎng)環(huán)境條件均一，溫度24℃，濕度50%，晝夜12 h/12 h，在SPF動物房中飼養(yǎng)。孕期計算以雌雄大鼠1∶1合籠后，每天上午檢查有無精液栓，發(fā)現(xiàn)精栓時為孕0 d。動物實驗部分經(jīng)本院倫理委員會批準進行。

1.2 動物分組及給藥

40只孕12 d的雌性SD大鼠，按照隨機數(shù)字表，隨機分成2組，DEHP[鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯，di-(2-ethylhexyl)phthalate]組和對照組,每組20只。DEHP組行DEHP灌胃處理造模，將DEHP(購于上海化學試劑有限公司)溶于大豆油中每日灌胃，劑量為750 mg/(kg·d)，對照組給予同體積的大豆油每日灌胃，灌胃持續(xù)到孕19 d時，從各組中選取10只孕鼠自然分娩，另留取10只用于尿道海綿體體外培養(yǎng)。DEHP組和對照組的孕鼠自然分娩后，對每窩產(chǎn)雄性活仔數(shù)進行統(tǒng)計，仔鼠出生后第30天，分別稱量體重，判斷是否出現(xiàn)尿道下裂的情況，并測量肛門與生殖器的距離(anogenital distance，AGD)。

1.3 組織制備與免疫組化染色

出生后30 d的仔鼠，檢查每只雄鼠是否出現(xiàn)尿道下裂，雄鼠麻醉處死，取DEHP組出現(xiàn)尿道下裂的仔雄鼠和對照組仔雄鼠各5只，將尿道海綿體組織用10%甲醛溶液固定24 h，用于組織化學染色剩余仔鼠尿道海綿體組織液氮速凍后置于-80℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 免疫組化染色

將PBS漂洗過的組織切片3%H2O2封閉15 min，入1%BSA中封閉30 min，漂洗，滴加0.2%BSA稀釋的抗RhoA(RhoA)(購于Abcam公司，貨號ab54835，稀釋比例1∶100)，抗磷酸化RhoA(p-RhoA)(購于Abcam公司，貨號ab41435，稀釋比例1∶100)，37℃孵育2 h，漂洗，滴加生物素標記的二抗(Abcam公司)37℃孵育2 h，漂洗，滴加DAB復(fù)合物，37℃孵育1 h，漂洗，顯色，脫水，透明，封片觀察。Image Pro Plus 6.0軟件分析其平均吸光度值。

1.5 q-PCR檢測

分別收集體外培養(yǎng)和仔鼠的尿道海綿體組織，按Trizol(Invitrogen)試劑說明書提取總RNA。采用Bio-Rad產(chǎn)的Spectrophotometer檢測RNA溶液A260/A280比值和RNA濃度。A260/A280比值1.8～2.0者用于進一步實驗檢測。PCR引物由上海生工生物公司合成，引物序列見表1，按照cDNA反轉(zhuǎn)試劑盒(Takara公司)和qPCR試劑盒(天根公司)說明書進行cDNA的反轉(zhuǎn)錄和qPCR體系的配制。在熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)中進行反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min，95℃，變性10 s，60～66℃退火延伸20～32 s，共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法[14]進行RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA的相對定量分析。

表1 qPCR檢測引物序列

1.6 Western blot檢測

提取生后兩組大鼠尿道海綿體組織中的蛋白，按BCA定量試劑盒(武漢博士德公司)的說明書測定蛋白濃度。提取的蛋白加入上樣緩沖液后95℃金屬浴加熱5 min后混勻，每孔上樣30 μg，10%聚丙烯酰胺凝膠(武漢博士德公司)電泳分離，電壓80 V電泳120 min，轉(zhuǎn)膜電壓100 V，PVDF膜濕轉(zhuǎn)，時間70 min，10%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗，其中RhoA(1∶1 000稀釋)、p-RhoA、MLCP(myosin light chain phosphatase)、p-MLCP(1∶1 000稀釋)購自Abcam公司，MLC(myosin light chain)、p-MLC、β-actin(1∶1 000稀釋)購自Santa Cruz公司，4℃過夜。TBST漂洗，3次×5 min，二抗(Abcam公司)室溫孵育1 h，洗膜，3次×5 min，化學發(fā)光試劑顯影。以β-actin為內(nèi)參。Bio-rad Gel Dol EZ成像儀(GEL DOC EZ IMAGER，Bio-rad，California，USA)顯影，目的條帶采用Image J軟件進行灰度值分析。

1.7 建立雄性胎鼠尿道海綿體體外培養(yǎng)體系

參照Morgan等[15]的方法稍加改進建立雄性胎鼠尿道海綿體體外培養(yǎng)體系，處死19 d孕鼠，無菌條件下取出胎鼠，加雙抗的PBS沖洗，解剖胎鼠，以發(fā)現(xiàn)睪丸作為確認雄性胎鼠的標志，隨后沿根部橫切陰莖，將切下的尿道海綿體完整置于0.4 μm微孔濾膜上方，腹側(cè)向下，每孔加入BjGb培養(yǎng)液(購于Gibco公司)1.5 mL，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每24 h更換培養(yǎng)液。將2組雄性胎鼠尿道段再各分為2組，分別按照以下分組給予藥物處理：對照不干預(yù)組、DEHP不干預(yù)組、對照加抑制劑組、DEHP加抑制劑組。兩組加抑制劑組均在培養(yǎng)液中加入50 μg/mL的RhoA/Rho激酶信號通路抑制劑Fasudil hydrochloride(購于Abmole公司)處理。培養(yǎng)72 h后，留取樣本進行qPCR檢測。

1.8 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，統(tǒng)計分析采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni檢驗，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 出生后雄性仔鼠生殖相關(guān)參數(shù)和尿道下裂發(fā)生率

在自然分娩的大鼠中，DEHP組10只孕鼠共產(chǎn)仔92只，其中雄性43只，尿道下裂仔鼠9只，發(fā)生率為20.93%，對照組10只孕鼠共產(chǎn)仔107只，其中雄性57只，未發(fā)現(xiàn)尿道下裂仔鼠，DEHP組尿道下裂發(fā)生率較對照組明顯增加，出生仔鼠體重減輕，且雄性胎鼠的AGD明顯減小，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表2)。

表2 分娩仔鼠中的生殖相關(guān)參數(shù)和尿道下裂發(fā)生率±s)

AGD：肛門與生殖器的距離；與對照組比較，*P<0.05

2.2 出生后第30天大鼠陰莖組織免疫組化檢查

免疫組織化學的檢測結(jié)果顯示，RhoA和p-RhoA蛋白主要在陰莖包皮下、尿道周圍的海綿體組織中表達，陽性部位呈棕黃色，RhoA在DEHP組尿道下裂動物尿道海綿體組織中表達略有升高但陽性率計算2組并無差異(P>0.05)，而p-RhoA在DEHP組尿道下裂動物尿道海綿體組織中表達較豐富，在對照組尿道海綿體組織中未見表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。RhoA通過磷酸化過程，磷酸化為p-RhoA起作用，DEHP組的p-RhoA的陽性表達較對照組明顯增加(P<0.05)(圖1)。

A：對照組RhoA表達；B：DEHP組RhoA表達；C：對照組p-RhoA表達；D：DEHP組p-RhoA表達；E：兩組RhoA免疫組化平均吸光度值結(jié)果；F：兩組p-RhoA免疫組化平均吸光度結(jié)果；與對照組比較，*P<0.05圖1 兩組動物免疫組化檢測RhoA、p-RhoA表達比較Fig.1 Comparison of immunohistochemical results between the two groups

2.3 出生后第30天仔鼠各組尿道海綿體組織RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA的表達水平

對2組動物尿道組織中的mRNA表達情況進行分析，據(jù)qPCR結(jié)果顯示，DEHP組尿道下裂動物尿道組織與正常組動物尿道組織相比，RhoA及下游的ROCK1、ROCK2在轉(zhuǎn)錄水平上的表達均有明顯升高(均P<0.05)(圖2)。

2.4 出生后第30天大鼠各組尿道海綿體組織中蛋白的表達水平

在出生后第30天的大鼠中，每組隨機挑選3只，通過Western blot檢測兩組的尿道組織中RhoA及p-RhoA的表達水平，以及通路下游的MLCP、p-MLCP、MLC、p-MLC蛋白的表達水平。結(jié)果表明，與對照組相比，DEHP組尿道下裂動物尿道組織中RhoA、MLCP、MLC的表達均無明顯差異(均P>0.05)，而p-RhoA、p-MLCP、p-MLC在DEHP組尿道下裂動物尿道組織中表達明顯增高(均P<0.05)(圖3)。

2.5 雄性胎鼠尿道段體外培養(yǎng)后各組RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA的表達水平

在體外培養(yǎng)雄性胎鼠尿道段組織后，對4組動物陰莖組織中的mRNA表達情況進行分析，據(jù)qPCR結(jié)果顯示，對照加抑制劑組與對照不干預(yù)組相比，RhoA及其下游的ROCK1和ROCK2水平明顯降低(均P<0.05)，表達受到抑制，而DEHP不干預(yù)組與對照不干預(yù)組相比，RhoA及其下游的ROCK1和ROCK2水平明顯升高(均P<0.05)，DEHP加抑制劑組與DEHP不干預(yù)組相比，RhoA及其下游的ROCK1和ROCK2水平均明顯降低(均P<0.05)，且這3種蛋白的mRNA表達水平與對照加抑制劑組相比，略有升高，但差異均無統(tǒng)計學意義(圖4)。

與對照組比較，*P<0.05圖2 出生后第30天各組大鼠尿道海綿體組織的RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表達水平Fig.2 Expression levels of RhoA，ROCK1 and ROCK2 mRNA in corpus spongiosum tissues of rats at 30 days after birth

與對照組比較，*P<0.05圖3 各組尿道組織RhoA、MLCP、MLC及其磷酸化蛋白表達水平Fig.3 The protein expression levels of RhoA,MLCP and MLC in corpus spongiosum tissues in each group

與對照組比較，*P<0.05；與DEHP組比較，#P<0.05圖4 雄性胎鼠尿道段體外培養(yǎng)后各組尿道組織的RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表達水平Fig.4 The expression levels of RhoA，ROCK1 and ROCK2 mRNA in the corpus spongiosum tissues of fetal rats after the in vitro culture of the rat urethral tissues

3 討論

先天性尿道下裂是小兒常見的先天性生殖器畸形，近年發(fā)病率呈上升趨勢[16]。手術(shù)是解決畸形的主要手段，但由于這是一種較精細的矯型手術(shù)，手術(shù)難度較大，術(shù)后發(fā)生并發(fā)癥的概率較高[17]。因此，找到先天性尿道下裂的標志性物質(zhì)將為先天性尿道下裂的檢測和治療提供有效的指導(dǎo)。

本研究首先對DEHP和對照組中出生后雄性仔鼠生殖相關(guān)參數(shù)和尿道下裂的發(fā)生率進行比較，發(fā)現(xiàn)DEHP組尿道下裂發(fā)生率較對照組明顯增加，出生仔鼠體重減輕，且雄性胎鼠的AGD明顯減小。DEHP是一種鄰苯二甲酸酯，它能夠誘導(dǎo)過氧化物酶體的增殖并且能調(diào)節(jié)特異性靶基因的表達[18]。DEHP是一種最常使用的塑化劑，因其對雄性生殖系統(tǒng)的生物毒性而受到廣泛關(guān)注[19]。有研究證實鄰苯二甲酸鹽在引起男性生殖道出現(xiàn)諸如尿道下裂等異常中占據(jù)非常重要的地位[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)DEHP組尿道下裂動物尿道海綿體組織與正常組動物相比，與RhoA/Rho激酶信號通路相關(guān)的RhoA及下游的ROCK1、ROCK2在轉(zhuǎn)錄水平上的表達均有明顯升高。Rho激酶是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在靜息狀態(tài)下，Rho激酶的Rho結(jié)合結(jié)構(gòu)域和PH結(jié)構(gòu)域、Rho激酶的催化結(jié)構(gòu)域相互作用，抑制激酶的活性[21]。當活化的RhoA與Rho激酶的結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用改變Rho激酶的構(gòu)型，Rho激酶被激活[22]。RhoA/Rho激酶信號通路激活之后，能夠?qū)е翸LC的失活，抑制磷酸化的MLC的脫磷酸化反應(yīng)，進一步增快肌動蛋白微絲骨架聚合的進度，從而調(diào)節(jié)細胞應(yīng)力纖維和黏附斑的形成，并且介導(dǎo)細胞一系列的生物學行為以及功能，包括粘附、遷移、增殖以及收縮等[23]。ROCK是Rho分子下游靶效應(yīng)分子，其包含2種同源異構(gòu)體：ROCK1和ROCK2[24]。文獻表明，RhoA/Rho激酶所介導(dǎo)的Ca2+敏感性通路可導(dǎo)致陰莖海綿體平滑肌和小動脈血管平滑肌收縮，由此維持陰莖疲軟狀態(tài)[25]。并且，有關(guān)動物模型以及關(guān)于人陰莖的研究結(jié)果均證實RhoA/Rho激酶蛋白在陰莖海綿體組織內(nèi)有表達，這說明RhoA/Rho激酶蛋白參與了陰莖海綿體組織的活動，而尿道是與陰莖緊密相連的，這一發(fā)現(xiàn)表明RhoA/Rho激酶有可能也是尿道下裂的重要機制之一[26]。

綜上所述，本研究表明RhoA/Rho激酶信號通路激活與先天性尿道下裂的發(fā)生有關(guān)，抑制RhoA/Rho激酶信號通路激活可降低RhoA、ROCK1和ROCK2表達從而促進尿道海綿體組織正常發(fā)育。由于對先天性尿道下裂中RhoA/Rho激酶信號通路的研究甚少，還有許多關(guān)鍵問題亟待解決，深入研究RhoA參與尿道形成過程中細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，將為發(fā)現(xiàn)先天性尿道下裂的治療及預(yù)后評估的新靶點提供理論依據(jù)。

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(2016-11-29 收稿)

Association of the RhoA/Rho Kinase Signaling Pathway with Congenital Hypospadias

Yu Jin1，Zhao Zhenyu2，Wang Xinguang2etal

1WuhanBloodCenter，Wuhan430030，China2DepartmentofUrology，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

Objective To construct the model of congenital hypospadias and to explore the mechanism of the RhoA/Rho kinase signal pathway in congenital hypospadias in fetal ratsinvitro.Methods Rats were administered di-(2-ethylhexyl)-phthalate(DEHP)by gavage to establish the model of congenital hypospadias.Immunohistochemistry was performed in rat corpus spongiosum tissues.The expression levels of RhoA，ROCK1，and ROCK2 mRNA were detected by fluorescence quantitative PCR(qPCR)，and those of RhoA，p-RhoA，myosin light chain phosphatase(MLCP)，p-MLCP，myosin light chain(MLC)，and p-MLC protein by Western blotting.At the same time，the corpus spongiosum tissues of fetal rats were culturedinvitro.After treatment of the corpus spongiosum tissues with the inhibitor of the RhoA/Rho kinase pathway，the expression levels of RhoA，ROCK1，and ROCK2 mRNA were measured.Results The rat model of hypospadias was successfully constructed.Immunohistochemistry showed that the expression level of p-RhoA was significantly increased in the model group as compared with that in the control group.qPCR results showed that the expression levels of RhoA，ROCK1，and ROCK2 mRNA were significantly higher in the congenital hypospadias rats than in the control rats(P<0.05).Western blotting showed that the expression levels of p-RhoA，p-MLCP，and p-MLC protein were significantly higher in the congenital hypospadias rats than in the control rats(P<0.05).RhoA/Rho kinase pathway inhibitors could inhibit the activation of the RhoA/Rho kinase signaling pathway，therefore suppressing the expression levels of the RhoA，ROCK1，and ROCK2 and reducing the inhibitory effect of DEHP on the normal development of corpus spongiosum tissues of male fetal rats.Conclusion The activation of the RhoA/Rho kinase signal pathway is associated with the development of congenital hypospadias.Inhibition of the RhoA/Rho kinase signaling pathway can reduce the expression levels of RhoA，ROCK1 and ROCK2 and thereby promote the normal development of corpus spongiosum tissues.

RhoA； Rho kinase； signal pathway； congenital hypospadias

*武漢市衛(wèi)生計生委科研項目(No.WX15D61)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費資助項目(No.HUST-0118540269)

R695.3

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.02.004

余 謹，女，1986年生，醫(yī)學博士，E-mail：435387513@qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：lingqing1985@163.com