齊墩果酸與二氫齊墩果酸灌胃及靜脈注射給藥后在大鼠體內(nèi)的藥動學研究

陳 瑞，李 維，李 永，劉 瑤，黃 靜，湯 磊（貴州醫(yī)科大學醫(yī)藥衛(wèi)生管理學院，貴陽 550004）

齊墩果酸與二氫齊墩果酸灌胃及靜脈注射給藥后在大鼠體內(nèi)的藥動學研究

陳 瑞＊，李 維，李 永，劉 瑤，黃 靜，湯 磊#（貴州醫(yī)科大學醫(yī)藥衛(wèi)生管理學院，貴陽 550004）

目的：研究齊墩果酸及其衍生物二氫齊墩果酸ig及iv給藥在大鼠體內(nèi)的藥動學及絕對生物利用度。方法：12只SD大鼠隨機分為齊墩果酸給藥組和二氫齊墩果酸給藥組，每組6只，兩組大鼠均ig給藥（50mg/kg），1周后于尾iv給藥（2mg/kg）。分別于給藥前及給藥后（ig為0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、5、7、9、12 h，iv為0.05、0.15、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5、7、9、12 h）尾靜脈取血0.3m L，采用超高效液相色譜（UPLC）-四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜法（QTOF）測定血藥濃度，DAS 2.0藥動學軟件計算藥動學參數(shù)與絕對生物利用度。結果：大鼠ig與iv齊墩果酸后，AUC0-∞分別為（232.10±7.17）、（1 203.99±19.65）ng·h/m L，t1/2分別為（1.75± 0.10）、（1.41±0.04）h；ig給藥后cmax為（121.3±18.92）ng/m L，tmax為（0.54±0.10）h，絕對生物利用度為0.77%。大鼠ig與iv二氫齊墩果酸后，AUC0-∞分別為（382.03±23.73）、（386.14±10.65）ng·h/m L，t1/2分別為（2.47±0.45）、（1.44±0.03）h；ig給藥后cmax為（124.52±12.28）ng/m L，tmax為（0.63±0.14）h，絕對生物利用度為3.96%。結論：在大鼠體內(nèi)，二氫齊墩果酸的絕對生物利用度顯著高于齊墩果酸。

齊墩果酸；二氫齊墩果酸；大鼠；超高效液相色譜-四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜法；藥動學；生物利用度

齊墩果酸（Oleanolic acid）是一類具有保肝護腎、抑制血小板凝集、降血脂、降糖、抗癌、抗應激、抗微生物等作用的五環(huán)三萜類化合物[1-3]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸雙鍵還原的衍生物二氫齊墩果酸具有較強的促葡萄糖消耗的活性，在治療糖尿病方面有一定的研究基礎。由于二氫齊墩果酸的藥動學研究未見文獻報道，因此在本研究中，筆者探討了齊墩果酸及其衍生物二氫齊墩果酸ig及iv給藥在大鼠體內(nèi)的藥動學及生物利用度，為其進一步應用提供實驗基礎。齊墩果酸和二氫齊墩果酸的化學結構式見圖1。

圖1 齊墩果酸和二氫齊墩果酸的化學結構式Fig 1 Chem ical structures of oleanolic acid and dihydrooleanolic acid

1 材料

1.1 儀器

G2-XS超高效液相色譜（UPLC）-四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（QTOF）儀，包括四元梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、電噴霧四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀、MassLynxⅤ4.1質(zhì)譜工作站（美國Waters公司）；AE240十萬分之一電子天平（上海菁海儀器有限公司）

1.2 藥品與試劑

齊墩果酸原料藥（批號：JZ15120901，純度：＞98%）、甘草次酸（內(nèi)標）原料藥（批號：JZ16040703，純度：＞98%）均購自南京景竹生物科技有限公司；二氫齊墩果酸原料藥（貴州醫(yī)科大學藥物化學重點實驗室制備，批號：20160318，純度：＞98%）；甲酸、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚為分析純；甲醇、乙腈為色譜純。

1.3 動物

清潔級SD大鼠12只，♀♂各半，體質(zhì)量200～230 g，購自第三軍醫(yī)大學實驗動物中心，實驗動物合格證號：SCXK（軍）2012-0011。實驗前禁食不禁水12 h。

2 方法與結果

2.1 齊墩果酸、二氫齊墩果酸、內(nèi)標貯備液的制備

精密稱取齊墩果酸、二氫齊墩果酸、內(nèi)標原料藥適量，甲醇溶解并定容，制得質(zhì)量濃度為20、20、10μg/m L的齊墩果酸、二氫齊墩果酸、內(nèi)標貯備液，置于4℃冰箱待用。使用時，將各貯備液稀釋成所需質(zhì)量濃度的溶液。

2.2 血漿樣品的處理

取100μL血漿樣品，加入400 ng/m L內(nèi)標溶液100 μL，依次加入甲醇400μL、乙酸乙酯800μL，渦旋混合15min，離心（離心半徑為3 cm，以下同，10 000 r/m in）10min，吸取上層溶液，氮氣吹干，殘渣加入100μL甲醇溶解，離心（13 000 r/m in）10m in，取上清液2μL，進樣分析。

2.3 色譜條件與質(zhì)譜條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7μm）；流動相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～0.2m in，60%A；0.2～4.0min，2%A；4.0～5.5 m in，60%A）；流速：0.35m L/m in；柱溫：40℃；檢測波長：210 nm；進樣量：2μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源（ESI）；負離子模式采集模式；毛細管電壓：2 kV，離子源：120℃；脫溶劑氣溫度：400℃，脫溶劑氣流量：800 L/h，錐孔氣流量：50 L/h；質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及處理軟件：MassLynx V4.1工作站；掃描方式：全信息串聯(lián)質(zhì)譜（MSE）。QTOF高分辨質(zhì)譜圖見圖2。

2.4 專屬性考察

取大鼠空白血漿100μL，加齊墩果酸或二氫齊墩果酸貯備液100μL，按“2.2”項下方法處理后，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定；另取空白血漿、給藥45min的血漿樣品+內(nèi)標進樣測定。結果，內(nèi)標和齊墩果酸能同時被檢測到，出峰時間約為2.26、2.65m in；內(nèi)標和二氫齊墩果酸能同時被檢測到，出峰時間約為2.0、2.34 m in。檢測物質(zhì)峰形良好，且與大鼠血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)達到完全分離，色譜圖見圖3。

2.5 標準曲線與定量下限考察

圖2 質(zhì)譜圖Fig 2 M assspectrum

圖3 LC-MS色譜圖Fig 3 LC-MSchromatogram

取齊墩果酸、二氫齊墩果酸貯備液，分別稀釋成質(zhì)量濃度為1、5、16、40、80、200、400、1 000、2 000 ng/m L的齊墩果酸系列標準液，0.64、3.2、16、40、80、200、400 ng/m L的二氫齊墩果酸系列標準液。取大鼠空白血漿100μL于2m L EP管中，分別加入上述系列標準液100μL，按“2.2”項下方法處理后，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定。以齊墩果酸或二氫齊墩果酸質(zhì)量濃度為橫坐標（x）、齊墩果酸或二氫齊墩果酸與內(nèi)標的峰面積比為縱坐標（y）繪制標準曲線。結果，齊墩果酸、二氫齊墩果酸的回歸方程分別為y＝0.007 4x－0.001 5（r＝0.999 4）、y＝0.000 5x+0.007 5（r＝0.999 8），線性范圍分別為1～2 000、0.64～400 ng/m L，定量下限分別為1、0.64 ng/m L。

2.6 基質(zhì)效應與提取回收率考察

取大鼠空白血漿100μL，按“2.2”項下方法處理后，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的齊墩果酸（40、400、2 000 ng/m L）或二氫齊墩果酸（0.64、80、400 ng/m L）溶液100 μL復溶，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，計算齊墩果酸或二氫齊墩果酸與內(nèi)標峰面積比值（Ⅰ），以相同質(zhì)量濃度的齊墩果酸或二氫齊墩果酸溶液直接進樣獲得的峰面積與內(nèi)標峰面積比值（Ⅱ），考察基質(zhì)效應（Ⅰ/Ⅱ× 100%）。取大鼠空白血漿，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度齊墩果酸或二氫齊墩果酸溶液100μL，按“2.2”項下方法處理后，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，計算血漿樣品中齊墩果酸或二氫齊墩果酸與內(nèi)標峰面積比值（Ⅲ），考察提取回收率（Ⅲ/Ⅰ×100%）。結果，齊墩果酸、二氫齊墩果酸的基質(zhì)效應分別為90.8%～108.2%（RSD≤9.89%，n＝5）、86.71%～95.1%（RSD≤5.97%，n＝5）；提取回收率分別為74.86%～88.87%（RSD≤10.21%，n＝5）、78.61%～90.57%（RSD≤7.88%，n＝5），表明該方法符合要求。

2.7 準確度和精密度考察

取大鼠空白血漿100μL，分別加入“2.6”項下低、中、高質(zhì)量濃度的齊墩果酸或二氫齊墩果酸溶液100μL，平行5份，按“2.2”項下方法處理，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，進樣測定5次，連續(xù)進樣3 d，考察準確度和日內(nèi)、日間精密度。結果，齊墩果酸的準確度為92.61%～112.3%（RSD＝2.7%，n＝5），日內(nèi)（n＝5）和日間（n＝3）精密度RSD均小于10.0%；二氫齊墩果酸的準確度為88.54%～107.2%（RSD＝3.5%，n＝5），日內(nèi)（n＝5）和日間（n＝3）精密度RSD均小于10.0%，表明該方法符合要求。

2.8 穩(wěn)定性考察

取大鼠空白血漿100μL，分別加入“2.6”項下低、中、高質(zhì)量濃度的齊墩果酸或二氫齊墩果酸溶液100μL，平行5份，按“2.2”項下方法處理后，分別于室溫下放置6 h、4℃下冷藏12 h、反復凍融3次以及自動進樣器放置6 h后進樣測定。結果顯示，齊墩果酸與二氫齊墩果酸在上述條件下均保持穩(wěn)定，RSD均小于15%（n＝5）。

2.9 藥動學研究

2.9.1 齊墩果酸及二氫齊墩果酸工作溶液的制備 將齊墩果酸與二氫齊墩果酸溶解于助溶劑（N，N-二甲基乙酰胺-聚乙二醇（PEG）400-水之比為2∶4∶1，V/V/V，預實驗表明僅使用助溶劑不影響大鼠的生理狀態(tài)及相關物質(zhì)的檢測），即得。

2.9.2 分組、給藥與取血 12只SD大鼠隨機分為齊墩果酸給藥組和二氫齊墩果酸給藥組，每組6只，兩組大鼠均ig給藥（50mg/kg，給藥劑量根據(jù)預實驗確定，為人體給藥劑量的等效劑量的約6.3倍，下同），1周后于尾iv給藥（2mg/kg）。分別于給藥前及給藥后（ig為0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、5、7、9、12 h，iv為0.05、0.15、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5、7、9、12 h）尾靜脈取血0.3m L，置于1.5 m L肝素化離心管中，離心（4 500 r/m in）10 m in，按“2.2”項下方法處理后，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定。采用DAS 2.0藥動學軟件進行擬合，計算齊墩果酸和二氫齊墩果酸在大鼠體內(nèi)的藥動學參數(shù)與絕對生物利用度（F）。

2.9.3 測定結果 齊墩果酸和二氫齊墩果酸ig和iv給藥的藥-時曲線見圖4，藥動學參數(shù)見表1。

圖4 齊墩果酸和二氫齊墩果酸在大鼠體內(nèi)的藥-時曲線Fig 4 Concentration-time curve of oleanolic acid and dihydrooleanolic acid in rats

表1 齊墩果酸和二氫齊墩果酸在大鼠體內(nèi)的主要藥動學參數(shù)計算結果（±s，n＝6）Tab 1 Calculation results of main pharmacokinetic parameters of oleanolic acid and dihydrooleanolic acid in rats（±s，n＝6）

表1 齊墩果酸和二氫齊墩果酸在大鼠體內(nèi)的主要藥動學參數(shù)計算結果（±s，n＝6）Tab 1 Calculation results of main pharmacokinetic parameters of oleanolic acid and dihydrooleanolic acid in rats（±s，n＝6）

藥動學參數(shù)AUC0-12h，ng·h/mL AUC0-∞，ng·h/mL t1/2，h CL，L/（kg·h）Vd，L/kg cmax，ng/mL tmax，h F，%齊墩果酸iv（2mg/kg）1172.71±17.90 1203.99±19.65 1.41±0.04 1.66±0.03 3.38±0.09 ig（50mg/kg）225.77±6.04 232.10±7.17 1.75±0.10 8.62±0.27 21.79±0.89 121.3±18.92 0.54±0.10 0.77二氫齊墩果酸iv（2mg/kg）381.84±10.89 386.14±10.65 1.44±0.03 129.57±3.60 268.60±12.44 ig（50mg/kg）350.01±14.56 382.03±23.73 2.47±0.45 131.33±8.73 464.68±70.21 124.52±12.28 0.63±0.14 3.96

結果表明，齊墩果酸和二氫齊墩果酸在大鼠體內(nèi)的藥-時曲線特征符合血管外給藥一級吸收單室模型；靜脈注射給藥符合單室模型，符合一級動力學過程消除。齊墩果酸、二氫齊墩果酸的絕對生物利用度分別為0.77%、3.96%。

3 討論

齊墩果酸給予大鼠的劑量依據(jù)為文獻[4-5]，二氫齊墩果酸與齊墩果酸的結構相似，故所定給藥劑量與齊墩果酸一致。由于齊墩果酸[6-8]和二氫齊墩果酸為五環(huán)三萜類化合物，紫外吸收弱，且在血漿中血藥濃度較低，而普通的HPLC靈敏度較低[9-11]，較難檢出。故本研究采用UPLC-QTOF測定兩藥血藥濃度，該法具有較高的靈敏度，齊墩果酸與二氫齊墩果酸的定量下限分別為1、0.64 ng/m L，可滿足較低濃度的測定要求，具有較強的專屬性，同時也縮短了樣品的分析時間。

本研究結果顯示，齊墩果酸的生物利用度為0.77%，與文獻報道的0.7%[12]較為接近。二氫齊墩果酸的絕對生物利用度為3.96%，顯著高于齊墩果酸。Vd表示體內(nèi)藥物總量平衡后，按血藥濃度計算的所需體液總體積。齊墩果酸iv與ig給藥后的Vd值分別約為3～22 L，提示齊墩果酸很可能分布在體液中；二氫齊墩果酸2種給藥方式的Vd值均大于100 L，提示二氫齊墩果酸很可能與組織特殊結合，后續(xù)研究將關注二氫齊墩果酸的分布情況。據(jù)相關研究報道，齊墩果酸在大鼠體內(nèi)的藥動學參數(shù)與劑量不相關[13]，且生物利用度低，這嚴重影響了齊墩果酸的臨床應用。LiM J等[14]研究表明，齊墩果酸在體外肝微粒體的孵育濃度明顯下降，可能與肝腸內(nèi)酶的廣泛代謝與其生物利用度低相關，后續(xù)可開展體外酶促動力學試驗以研究二氫齊墩果酸的肝腸首關代謝作用對其生物利用度的影響。

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（編輯：劉明偉）

Study on the Pharmacokinetics of Oleanolic Acid and Dihydrooleanolic Acid by Intragastric Adm inistration and Intravenous Injection in Rats in vivo

CHEN Rui，LIWei，LIYong，LIU Yao，HUANG Jing，TANG Lei（School of Medicine and Health Management，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China）

OBJECTIVE：To study the pharmacokinetics and absolute bioavailability of oleanolic acid and its derivative dihydrooleanolic acid in rats in vivo.METHODS：12 SD rats were random ly divided into oleanolic acid adm inistration group and dihydrooleanolic acid administration group，6 in each group.All ratswere intragastrically given relatedmedicine（50mg/kg），then intravenously injected related medicine（2 mg/kg）in tail vein after 1 week.Sample blood 0.3 m L was taken from tail vein before administration and after administration（0.1，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，3，5，7，9，12 h for ig；0.05，0.15，0.25，0.5，0.75，1，2，3，5，7，9，12 h for iv）.UPLC-QTOF was conducted to determ ine the plasma concentration，and DAS 2.0 pharmacokinetic software was used to calculate pharmacokinetic parameters and absolute bioavailability.RESULTS：A fter ig and iv oleanolic acid，the AUC0-∞were（232.10±7.17），（1 203.99±19.65）ng·h/m L，t1/2were（1.75±0.10），（1.41±0.04）h respectively；after ig，cmaxwas（121.3±18.92）ng/m L，tmaxwas（0.54±0.10）h，absolute bioavailability was 0.77%.A fter ig and iv dihydrooleanolic acid，AUC0-∞were（382.03±23.73），（386.14±10.65）ng·h/m L，t1/2were（2.47±0.45），（1.44±0.03）h；after ig，cmaxwas（124.52± 12.28）ng/m L，tmaxwas（0.63±0.14）h，absolute bioavailability was 3.96%.CONCLUSIONS：The absolute bioavailability of dihydrooleanolic acid is significantly higher than oleanolic acid in rats.

Oleanolic acid；Dihydrooleanolic acid；Rats；UPLC-QTOF；Pharmacokinetics；Bioavailability

R917

A

1001-0408（2017）13-1777-04

2016-08-11

2017-03-15）

＊碩士研究生。研究方向：藥動學。電話：0581-8550366。E-mail：cherrie_amme@163.com

#通信作者：教授，博士。研究方向：藥物合成設計與藥動學。電話：0581-8550366。E-mail：tgxx903@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.13.14