辣木組織培養(yǎng)技術研究進展

黃洲++陳思++龐基良

摘 要 辣木作為一種新興的多功能經濟樹種。近年來，因市場需求旺盛，資源短缺，促使辣木組織培養(yǎng)技術發(fā)展迅速。本文綜述了辣木組培外植體的選擇、增殖培養(yǎng)、瓶內生根以及煉苗移栽等方面的研究進展，并對培養(yǎng)過程中存在的問題進行了分析，以期為辣木的組培提供一定的參考。

關鍵詞 辣木 ；組織培養(yǎng) ；外植體

中圖分類號 Q943.1 文獻標志碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.04.010

Research Progress in Tissue Culture of Moringa oleifera Lam.

HUANG Zhou CHEN Si PANG Jiliang

（College of Life and Environmental Science， Hangzhou Normal University， Hangzhou， Zhejiang 310036）

Abstract As a multi-functional economic tree species， Moringa oleifera Lam has been developed rapidly in recent years due to high market demand， and its rapid propagation via tissue culture has also been developed very fast. The research progress in the selection of explants， multiplication culture， rooting culture， acclimatization and transplantion of M. oleifera Lam were reviewed. The exiting problems arising from tissue culture of M. oleifera Lam were analyzed to make reference for the tissue culture of M. oleifera Lam.

Keywords Moringa oleifera Lam ； tissue culuture ； explant

辣木（Moringa sp.）為辣木科（Moringaceae）辣木屬（Moringa Adans.）多年生木本植物，別名“油辣木”、“辣根樹”或“鼓槌樹”，原產熱帶、南亞熱帶的干旱或半干旱地區(qū)[1]。辣木作為一種用途廣泛的速生樹種，整株均有利用價值，其根和樹皮是傳統(tǒng)的醫(yī)藥原材料；嫩葉和嫩果莢營養(yǎng)豐富而全面，適宜食用；種子富含油脂，且油脂質量很高，通常被食用或作為高檔化妝品的添加劑；種子榨油后剩下的枯餅對污水有較好的凈化作用[2-3]。由于辣木全身是寶，我國云南、海南、四川、福建等氣候適宜地區(qū)都有引種栽培。而傳統(tǒng)的繁殖方式主要是通過種子育苗，但這種方法存在性狀不穩(wěn)定、抗病差、產量低等問題，再加上辣木種子價格昂貴，隨儲存時間的延長其發(fā)芽率又逐漸下降[4]，所以辣木種苗資源短缺，使得近年來人們開始探索利用組織培養(yǎng)的方式建立辣木的快速繁殖體系，來獲得大量優(yōu)質的辣木種苗[5]，以滿足市場對辣木的大量需求。本文對近些年辣木組織培養(yǎng)技術的研究進展進行了較為系統(tǒng)的綜述，以期為辣木組培技術的進一步發(fā)展提供參考。

1 外植體的取材和消毒處理

1.1 取材

在辣木的組織培養(yǎng)實驗中，外植體主要選用種子和辣木實生苗的不同器官。用辣木的種子作為外植體操作較容易，消毒方便，污染率低，并且組培過程中萌發(fā)率高，培養(yǎng)的幼苗生長較快[6]。根據楊俊俊等[5]報道，切下辣木種子萌發(fā)的無菌苗的子葉結組織培養(yǎng)，增殖倍數(shù)可以達到6左右，平均35 d即可獲得生根苗且用種子作為組織培養(yǎng)的原始材料可以保持種子的優(yōu)良性狀。而以辣木實生苗的一些器官作為外植體材料資源豐富，取材方便。武新琴等用傳統(tǒng)辣木實生苗的嫩梢[7]，朱尾銀用優(yōu)樹新長出的嫩芽[8]，姜艷等用新抽發(fā)的辣木嫩莖[9]，黎國運等用當年生辣木實生苗頂芽、幼嫩側枝[10]，均得到了辣木的組培苗。高燕等[11]還對比了不同部位嫩芽的誘導效果，發(fā)現(xiàn)不同部位嫩芽的誘導效果為中部>下端>上端。向素瓊等[12]用辣木帶腋芽莖段、無芽莖段和葉片進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)前2種都可作為外植體，腋芽出芽快，而莖段的增殖系數(shù)高，但葉片分化誘導比較困難，故不適合作為外植體。

1.2 消毒處理

外植體消毒是組織培養(yǎng)中的關鍵步驟，它直接影響后續(xù)實驗的進行。在對外植體進行消毒時，消毒方法依據外植體種類的不同而改變。消毒劑的種類、消毒劑濃度以及消毒時間這3個因素均會影響消毒效果，從而影響外植體的存活率和污染率。

對于辣木種子來說，首先其外殼在消毒時是否要保留存在爭議，有學者認為外殼對內部的種子起到保護的作用，不剝殼可以提高成活率[13]；但也有一些學者認為辣木外殼表面細菌較多，保留外殼會使污染率提高[14]。對不剝殼的辣木種子消毒時，用70%酒精浸泡30s，再以0.1%的升汞處理8 min，污染率僅為26.7%[13]；但升汞是劇毒的化學試劑，所以有研究者認為改用75%酒精浸泡30s+1%次氯酸鈉處理15 min效果更好[5]。對剝殼的辣木種子消毒時，基本都采用0.1%的升汞處理，在升汞處理之前，有用15%的H2O2先浸泡6～8 h[15]，也有用75%的酒精浸泡30 s至1 min的。效果最好的是用84消毒液預處理+0.1%升汞處理15 min，污染率只有10%[14]。

在消毒處理除辣木種子外的其他外植體時，一般要先用洗滌劑[7]或次氯酸鈉預處理之后，再用酒精和升汞處理。姜艷等[9]認為，對于消毒滅菌，實驗中次氯酸鈉和75%的酒精效果相似，都只能殺死表面細菌，組合起來消毒效果欠佳，而升汞（重金屬離子使酶損傷甚至失活）和75%酒精可以互補不足，因此消毒效果顯著。就消毒時間來說，消毒時間過短，外植體容易污染；而時間過長，又會使外植體受到毒害而死亡，所以，需要篩選一個最佳的消毒時間。用辣木莖段作為外植體時，0.2 g/L升汞處理5 min是最佳的消毒時間。

2 外植體的誘導、增殖培養(yǎng)

2.1 基本培養(yǎng)基的選擇

據報道辣木莖段組織培養(yǎng)使用過的培養(yǎng)基主要是MS、WPM和改良的MS培養(yǎng)基。朱尾銀[8]比較了3種培養(yǎng)基的優(yōu)劣，得出不管是在辣木莖段的誘導階段，還是增殖階段，改良MS培養(yǎng)基都是最適合的培養(yǎng)基。在改良MS培養(yǎng)基上誘導出的芽大多為叢芽，沒有黃化現(xiàn)象，且誘導和增殖系數(shù)最高。辣木種子作為外植體時使用的培養(yǎng)基有1/2 MS、MS、改良Mc（鈣鹽1/2、鉀鹽4/5）和B5等[14]，其中改良Mc培養(yǎng)基中種子發(fā)芽率最高，所以高濃度的無機鹽有利于辣木種子的萌發(fā)。

2.2 激素種類和濃度

基本培養(yǎng)基只能使外植體存活下來，如果想要獲得更加優(yōu)質的試管苗，需要按照不同要求添加相應的植物生長調節(jié)劑來促使其生長和分化。而決定植物形態(tài)發(fā)生啟動和分化方向最重要的2個因素是生長素和細胞分裂素濃度的配比。在辣木的誘導和增殖階段，通常使用的激素為6-BA和NAA，對于6-BA，單獨使用濃度在0.4～2.0 mg/L[14]。根據相關研究，其用量與愈傷組織的生長呈正相關；在一定范圍內，6-BA濃度越高，側芽生長越明顯，莖節(jié)距越小[7，16]；向素瓊等[12]也得出，當6-BA>0.6 mg/L時，增殖系數(shù)不增反降，并且植株下部葉片黃化、頂端萎蔫，說明過量的細胞分裂素對辣木生長不利。對NAA來說，培養(yǎng)基中添加少量的NAA可以促進莖的生長，但濃度升高以后，莖的生長速度又會受到抑制[7]，這和6-BA的反應類似，說明過量的生長素也不利于辣木生長。這可能是由于辣木是速生樹種，本身內源激素含量高，所以其生長更偏向低濃度的生長調節(jié)劑。羅云霞等[15]在辣木增殖培養(yǎng)基中添加了0.6 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，增殖倍數(shù)可達5.8。而在楊俊俊等[5]的實驗中單獨添加了6-BA，不僅減少了激素的種類，還提高了增殖倍數(shù)。所以就單一激素而言，辣木增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA。

2.3 培養(yǎng)條件

一般的培養(yǎng)條件大都是在基本培養(yǎng)基中添加蔗糖30 g/L、瓊脂6～8 g/L，用1 mol的NaOH或HCl調節(jié)pH至5.8左右；培養(yǎng)基在121℃、131 kPa的條件下滅菌不超過20 min。接種后培養(yǎng)溫度為25～30℃，光強度為2 000 lx，光周期為12 h光照、12 h黑暗的條件。褐化和玻璃苗是影響木本植物快速繁殖的2個最大障礙，辣木組培過程中也同樣存在這些問題。王洪峰等[17]研究表明，在辣木的組培過程中，通過增強光照可以控制苗的玻璃化；減少瓊脂的用量，縮短培養(yǎng)的時間，增加繼代的頻率也可以減少苗的黃化。黎國運等[10]采用將外植體先暗培養(yǎng)一段時間，再見光的方法基本解決了辣木外植體氧化褐變的現(xiàn)象，并且用自然散射光代替日光燈，使得玻璃化苗減少，芽苗生長健壯。

3 試管苗的生根培養(yǎng)

培養(yǎng)基種類、激素、外源添加物等對組培苗的生根均會產生一定的影響。據報道，辣木的生根誘導比較容易[18]，在辣木的生根階段，大多使用1/2 MS培養(yǎng)基，減少蔗糖和瓊脂的用量，添加的激素有IBA、NAA和IAA，單獨使用IBA 0.01～0.5 mg/L[12-13，15]或NAA 0.2～1.0mg/L[7]均可促進不定根生長，這3種激素的誘導效果是IBA>IAA>NAA，并且根據R K Saini[19]等的研究結果顯示IBA和IAA復合使用比單一任何一種激素誘導效果都要好，0.5 mg/L IAA+1 mg/L IBA的生根誘導率可以達到100%。李惠波[16]等在辣木生根的過程中加入一定量的活性炭，用于抑制辣木愈傷組織的生長，提高生根苗的質量，從而提高移栽的成活率。黎國運等[10]探索了無機鹽濃度對辣木生根的影響，得出高無機鹽對生根不利，且易使切面產生愈傷組織，所以生根時應降低無機鹽的濃度。辣木根系很脆，移栽清洗培養(yǎng)基時，根系容易斷裂，不利于移栽，因此武新琴等[7]在誘導生根階段，采用形態(tài)學上端朝下接種，結果植株仍可在形態(tài)學下端生根，根部沒有培養(yǎng)基使清洗變得容易，有利于移栽成活。

4 煉苗移栽

組培苗是處于一個以蔗糖作為碳源，恒溫、高濕的無菌環(huán)境中，這與自然界中的植物所處的靠光合作用自養(yǎng)，多菌、氣溫變化無常的環(huán)境有很大的區(qū)別，因此在組培苗移栽之前，通常需要進行煉苗，使其逐漸適應外界環(huán)境，從而提高成活率。辣木的組培苗煉苗時間和移栽介質每個研究者不盡相同，但在辣木的移栽過程中都需要注意以下三點：第一，由于辣木的根為肉質根，含較多水分，所以移栽介質應選較為透氣、排水良好的，以免根系腐爛；第二，辣木組培苗非常容易失水，因此環(huán)境的濕度一定要足夠高；第三，辣木是熱帶樹種，移栽環(huán)境的溫度也要保證。馬崇堅等[20]將試管苗放在陰涼處2 d，再置于育苗棚內繼續(xù)煉苗3d左右，移入裝有腐殖土和細沙按2∶1的比例混合的基質的花盆中。蓋上塑料薄膜保濕5～7 d后移去，最后成活率可以達到100%。黎國運等[10]將試管苗移栽入紅心土和河沙按4∶1配比的基質中，成活率也在80%以上。而趙翠翠等[6]將試管苗煉苗3 d，移栽入珍珠巖和營養(yǎng)土1∶2的基質中，成活率只有22.5%。從中可以看出，辣木組培苗移栽成活率還相差較大，需要進一步探索基質條件、移栽時間、環(huán)境條件等以建立一套普遍適用的體系來提高其成活率。

5 存在的問題及展望

由于辣木潛在的商業(yè)價值，近年來，國內外對辣木生產的研究已經開始加快。運用植物組織培養(yǎng)技術，對辣木種質資源的保存和開發(fā)有著重要意義。開展辣木組織培養(yǎng)研究，為保存不同基因型辣木的優(yōu)良性狀提供技術支撐，可以使優(yōu)良種質資源得以保存，為優(yōu)化的再生體系建立提供了保障。與常規(guī)育苗方法相比，組織培養(yǎng)育苗可大大縮短培養(yǎng)周期，在操作上更加簡便，并能培育出生長一致的組培苗，不受季節(jié)地域的限制。而且通過建立起一套完整的組織培養(yǎng)體系，可為辣木的工廠化育苗提供相應的理論基礎，為國內的辣木市場提供新的技術指導。雖然近年來關于辣木的研究有所增加，但大多集中于其所含營養(yǎng)成分的分析及其在醫(yī)藥領域的作用，而進行組織培養(yǎng)方面探索的學者較少，所以在實際生產操作中仍舊存在較多問題，例如：①在組織培養(yǎng)過程中，污染率仍然較高，分化率、成活率、生根率仍然有待提高；②煉苗時間差異較大，移栽成活率不高；③組培苗還存在黃化萎蔫等現(xiàn)象。

為了真正實現(xiàn)工廠化育苗和人工栽培，除了組培快繁要提高效率之外，辣木種質資源的優(yōu)選也十分重要。在辣木優(yōu)良品種的選育方面，有研究者將辣木染色體加倍[12，21-22]，希望以此來提高辣木產量，并且增加其中營養(yǎng)成分的含量，增強其抗逆性。

我國辣木的種植規(guī)模還比較小，后續(xù)開發(fā)的產品也很單一，人們對它的認知度還不高。所以，辣木要產業(yè)化，必須要將各方面綜合起來全面發(fā)展，擴大種植面積，增加產品的開發(fā)力度，對其進行深加工，加大宣傳，提高辣木的知名度等。通過上述舉措增大辣木的市場需求，從而推動辣木的研究。

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