長鏈非編碼RNA H19在急性胰腺炎患者血清中的表達(dá)及意義

李保軍， 黃 來， 孫遠(yuǎn)新

(沈陽市急救中心 急診科， 沈陽 110000)

論著/胰腺疾病

長鏈非編碼RNA H19在急性胰腺炎患者血清中的表達(dá)及意義

李保軍， 黃 來， 孫遠(yuǎn)新

(沈陽市急救中心 急診科， 沈陽 110000)

目的 探討急性胰腺炎患者血清中長鏈非編碼RNA(lncRNA)H19的表達(dá)及臨床意義。方法 選取2013年1月-2015年12月在沈陽市急救中心急診科及綜合外科診斷為急性胰腺炎的患者82例以及健康者20例。采集急性胰腺炎患者及健康者的外周血，分離血清提取RNA，利用Real-time PCR檢測lncRNA H19的表達(dá)水平，分析H19的表達(dá)與其他臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。計量資料組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗；利用受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析lncRNA H19對急性胰腺炎的診斷價值。結(jié)果 急性胰腺炎患者急性期血清中的lncRNA H19表達(dá)水平明顯高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.364，P=0.020)；重型急性胰腺炎組患者比輕型急性胰腺炎組lncRNA H19表達(dá)水平高(t=2.111，P=0.037)，Balthazar CT分級>C級患者的lncRNA H19表達(dá)水平高于CT分級≤C級的患者，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.312，P=0.022)。ROC曲線分析顯示H19的檢測可以幫助診斷急性胰腺炎(ROC曲線下面積為0.752，95%可信區(qū)間：0.636～0.867，P<0.01)。結(jié)論 lncRNA H19在急性胰腺炎患者的血清中表達(dá)升高，且對于急性胰腺炎診斷和嚴(yán)重程度的預(yù)判具有一定臨床價值。

胰腺炎； RNA， 未翻譯； 診斷

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是以胰腺局部炎癥為主要特征或伴有全身多器官損傷的炎性疾病，其病理機制尚不十分清楚[1]。根據(jù)AP的嚴(yán)重程度主要可以分為輕型急性胰腺炎(mild acute pancreatitis，MAP)和重型急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)。據(jù)報道[2-3]SAP的病死率為17%～30%。目前對于SAP的治療尚無明確的特異性方法，更多需依賴于重癥監(jiān)護(hù)治療水平。因此盡早的預(yù)判AP的危險及嚴(yán)重程度，對于疾病的治療效果和減少病死率都具有十分重要的意義。

目前對于AP的診斷主要依據(jù)臨床表現(xiàn)和血尿淀粉酶、血鈣離子、血糖以及影像學(xué)檢查等，但這些診斷標(biāo)準(zhǔn)在某些情況下仍有不足[4]；并且AP疾病進(jìn)展往往較快，MAP和SAP的判斷對于AP的治療和疾病控制都顯得尤為重要，而目前對于AP的預(yù)判尚無理想的生物標(biāo)志物或評判體系。近幾年研究[5]發(fā)現(xiàn)，非編碼RNA(ncRNA)中的微小RNA(miRNA)對于AP的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。有研究[6-7]證實miR-216a、miR-10a、miR-375、miR-92b等在AP患者的外周血中都存在穩(wěn)定的差異性表達(dá)，為臨床診斷和判斷AP提供了新的方向。而關(guān)于ncRNA中堿基序列大于200 bp的長鏈非編碼RNA(lncRNA)與AP的關(guān)系尚不十分清楚。因此本文對lncRNA H19在AP患者血清中的表達(dá)進(jìn)行檢測，利用受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析其對AP的診斷價值，為AP的臨床診治提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2013年1月-2015年12月在本院急診科或綜合外科診斷為AP的患者，診斷及分類標(biāo)準(zhǔn)參照AP亞特蘭大分類標(biāo)準(zhǔn)[8]，收集患者的臨床資料。另選取無臨床癥狀、無慢性基礎(chǔ)性疾病、體檢正常者作為健康對照組。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)具有典型AP臨床癥狀的患者，如突發(fā)持續(xù)性上腹部或背部疼痛等腹部特征；(2)伴有血尿淀粉酶升高；(3)CT提示AP的患者。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)不愿意參與研究的患者；(2)其他慢性疾病急性發(fā)作或腫瘤引起的臨床癥狀的患者；(3)放棄治療或轉(zhuǎn)院的患者。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本采集 收集AP患者入院24 h和經(jīng)過治療平穩(wěn)恢復(fù)期的血液樣本，以及健康受試者血液樣本。用5 ml肝素進(jìn)行抗凝處理，2 h內(nèi)于820g離心，移上清液于1.5 ml EP管中置于-80 ℃冰箱中備用。

1.3.2 Real-time PCR 每0.25 ml血清樣本加入0.75 ml Trizol試劑混勻提取血清總RNA，分光光度計測定A260/280為1.75～1.95。取2 μg RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按20 μl逆轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA。PCR引物應(yīng)用軟件Primer5.0設(shè)計，由北京鼎國合成，以GADPH作為內(nèi)參對照，引物序列：H19 上游 5′-TTCAAAGCCTCCACGACTCT-3′，下游 5′-GCTCACACTCACGCACACTC-3′；GAPDH 上游 5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，下游 5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。熒光定量PCR反應(yīng)體系為25 μl，內(nèi)含500 ng cDNA模板，終濃度為250 nmol/L的上下游引物及SYBRGreen Real-time PCR Master Mix 12.5 μl。每個樣本的表達(dá)含量以GADPH為參照。引物序列反應(yīng)條件為：95 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，退火15 s，72 ℃ 45 s，熒光收集，40個循環(huán)。每個樣本重復(fù)3次。以相對CT值(2-△△Ct)表示目的基因的相對表達(dá)量，以空白組作為對照。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入AP患者82例，其中男46例，女36例，年齡31～68歲，平均(49.2±7.4)歲。所有AP患者按照AP亞特蘭大分類標(biāo)準(zhǔn)再分為MAP組和SAP組，其中MAP組47例，男27例，女20例，平均(47.4±8.6)歲；SAP組35例，男19例，女16例，平均(53.2±10.4)歲。Balthazar CT分級標(biāo)準(zhǔn)為A～E級，其中≤C級43例，>C級39例。MAP組與SAP組患者年齡、性別、病因差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)(表1)。健康對照組共納入20例，男10例，女10例，年齡18～70歲，平均(52.0±8.1)歲。健康對照組與AP患者年齡、性別等差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)，具有可比性。

2.2 AP患者與健康者血清中l(wèi)ncRNA H19的表達(dá)情況 AP患者急性期血清中l(wèi)ncRNA H19的相對表達(dá)含量高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.364，P=0.020)?；颊呓?jīng)過治療后，病情平穩(wěn)時血清中l(wèi)ncRNA H19的相對表達(dá)含量下降(t=2.132，P=0.035)(圖1)。

2.3 MAP組和SAP組患者血清中l(wèi)ncRNA H19的表達(dá)情況 SAP組中l(wèi)ncRNA H19相對表達(dá)含量高于MAP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.111，P=0.037)(圖2)。

表1 MAP組和SAP組患者一般資料比較

圖1 lncRNA H19在健康者和AP患者急性期及恢復(fù)期血清中的表達(dá)

圖2 lncRNA H19在MAP和SAP患者血清中的表達(dá)

2.4 lncRNA H19在不同CT分級中的相對表達(dá)情況 CT分級>C級患者的lncRNA H19相對表達(dá)含量高于CT分級≤C級的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.312，P=0.022)(圖3)。

2.5 lncRNA H19對于AP診斷價值的分析 ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清中l(wèi)ncRNA H19的ROC曲線下面積為0.752，95%可信區(qū)間為0.636～0.867(P<0.01)(圖4)。

圖3 lncRNA H19在不同CT分級中的表達(dá)情況

圖4 血清中l(wèi)ncRNA H19對于AP診斷的ROC曲線

3 討論

AP是一種臨床上常見的危急重癥，由多種病因引起的胰酶激活，繼以胰腺局部炎癥反應(yīng)為主要特征，病情較重者可發(fā)生全身炎癥反應(yīng)綜合征并可伴有器官功能障礙、代謝性酸中毒、休克等嚴(yán)重后果，其病死率較高，預(yù)后較差[4]。關(guān)于AP的臨床診斷，除了符合AP的腹部特征等臨床表現(xiàn)以外，目前還主要依賴于影像學(xué)檢查和血清學(xué)檢測。其中影像學(xué)檢測主要以增強CT為主以及CT檢查相關(guān)的評分系統(tǒng)，如：Balthazar CT分級、改良的CT嚴(yán)重指數(shù)評分；而血清學(xué)檢查主要是血淀粉酶和脂肪酶。但目前血清學(xué)檢測指標(biāo)對于AP的診斷和嚴(yán)重程度的預(yù)判均缺少特異性，例如對于某些惡性腫瘤、腸梗阻、創(chuàng)傷或酮癥酸中毒的患者都會引起相同的血淀粉酶和脂肪酶的變化[9]；而因長期酗酒導(dǎo)致AP的患者其血淀粉酶和脂肪酶的變化反而不明顯[10]。因此尋找有效的生物標(biāo)志物對于AP的診治有著十分重要的意義。

過去一直認(rèn)為占據(jù)基因組中絕大部分的ncRNA是轉(zhuǎn)錄“噪聲”，是不具備生物學(xué)功能的[11]。而隨著人類基因組計劃的完成，人們逐漸改變了對于ncRNA的認(rèn)識。越來越多的研究[12-13]表明，ncRNA廣泛參與了胚胎發(fā)育、遺傳、生理、病理、炎癥以及腫瘤等諸多生命活動過程。近幾年研究發(fā)現(xiàn)ncRNA中的一類長度為21～24 nt的miRNA與AP的發(fā)生發(fā)展有著緊密聯(lián)系。Liu等[14]發(fā)現(xiàn)AP患者的外周血或淋巴液中miR-122、miR-138、 miR-148a、miR-214、miR-216a等表達(dá)上調(diào)；而miR-7、miR-10a等表達(dá)下調(diào)。而lncRNA H19作為一個2.3 kb的高度保守的印跡基因[15]，其在胚胎發(fā)育、腫瘤調(diào)控、代謝過程中發(fā)揮調(diào)控功能時與多種miRNA有著緊密聯(lián)系[16-19]，但關(guān)于lncRNA H19與AP的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系尚不清楚。本研究通過對82例AP患者的外周血進(jìn)行Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，lncRNA H19在AP組中表達(dá)高于健康對照組，且恢復(fù)期H19的表達(dá)明顯下降，提示H19可能成為診斷AP的生物標(biāo)志物。通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，H19對AP具有一定潛在的診斷價值，其ROC下面積為0.752(P<0.01)。但本研究的樣本量有限，若想全面評價H19對于AP的診斷價值仍需擴大樣本進(jìn)行分析研究。以上結(jié)果說明H19可能為AP特異性的lncRNA，為AP的臨床診斷提供了新的依據(jù)。

根據(jù)AP的不同嚴(yán)重程度，其后續(xù)的治療手段和方案也不盡相同。MAP和SAP的臨床表現(xiàn)和處置方式差異較大。其中MAP有一定的自限性，通常在1～2周內(nèi)恢復(fù)且病死率低，而SAP約占AP的5%～10%，其發(fā)展速度較快，并可引起多器官功能衰竭，常威脅生命。有報道[20]稱SAP的病死率可高達(dá)30%，如后期合并感染則病死率更高。因此對于SAP的早期預(yù)判和診斷是盡早對癥治療、減少病死率的關(guān)鍵。本研究比較了MAP與SAP組中H19的相對表達(dá)值，結(jié)果顯示H19在SAP組中的相對表達(dá)含量高于MAP組，提示H19對于AP的嚴(yán)重程度分級具有一定的診斷作用。

AP的發(fā)病率逐年升高，病死率居高不下，其早期診斷顯得尤為重要。本研究通過對AP患者血清中l(wèi)ncRNA H19的檢測發(fā)現(xiàn)， H19對于AP的診斷和嚴(yán)重程度評估具有一定臨床意義。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，還需更深入的研究去揭示lncRNA與AP發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系，以期為AP的臨床診斷提供新的思路。

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引證本文：LI BJ, HUANG L, SUN YX. Expression of long non-coding RNA H19 in serum in patients with acute pancreatitis and its clinical significance[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(3): 492-496. (in Chinese)

李保軍， 黃來， 孫遠(yuǎn)新. 長鏈非編碼RNA H19在急性胰腺炎患者血清中的表達(dá)及意義[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(3): 492-496.

(本文編輯：葛 俊)

Expression of long non-coding RNA H19 in serum in patients with acute pancreatitis and its clinical significance

LIBaojun,HUANGLai,SUNYuanxin.

(EmergencyDepartment,ShenyangEmergencyCenter,Shenyang110000,China)

Objective To investigate the expression of the long non-coding RNA (lncRNA) H19 in the serum of patients with acute pancreatitis and its clinical significance. Methods A total of 82 patients who were diagnosed with acute pancreatitis in Emergency Department and Department of General Surgery in Shenyang Emergency Center from January 2013 to December 2015 were enrolled, and 20 healthy subjects were enrolled as normal controls. Peripheral blood samples were collected from the patients with acute pancreatitis and healthy subjects, the serum was separated, and RNA was extracted. Real-time PCR was used to measure the expression of lncRNA H19, and the correlation between the expression of H19 and other clinical and pathological parameters was analyzed. Thet-test was used for comparison of continuous data between groups, and the chi-square test was used for comparison of categorical data between groups. The receiver operating characteristic (ROC) curve was used to evaluate the value of lncRNA H19 in the diagnosis of acute pancreatitis. Results The acute pancreatitis group had a significantly higher H19 expression level in serum than the healthy control group (t=2.364,P=0.020). The severe acute pancreatitis group had higher expression of lncRNA H19 than the mild acute pancreatitis group (t=2.111,P=0.037), and the patients with a Balthazar CT grade above grade C had significantly higher relative expression of lncRNA H19 than those with CT grade ≤C (t=2.312,P=0.022). The ROC curve showed that H19 measurement helped with the diagnosis of acute pancreatitis with an area under the ROC curve of 0.752 (95% CI: 0.636-0.867,P<0.01). Conclusion Patients with acute pancreatitis have increased expression of lncRNA H19 in serum, and therefore, H19 has certain clinical significance in the diagnosis of acute pancreatitis and the evaluation of disease severity.

pancreatitis； RNA， untranslated； diagnosis

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.03.019

2016-11-22；

2016-12-14。

李保軍(1971-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事急性消化系統(tǒng)創(chuàng)傷及危重癥的治療研究。

R576；R446.1

A

1001-5256(2017)03-0492-05