QuEChERS-UPLC-MS/MS監(jiān)測護膚化妝品中13種性激素成分的非法添加

汪元符，劉志斌，熊震球，駱瑜，袁愛華，劉玢

（南昌市食品藥品檢驗所，江西 南昌 330038）

QuEChERS-UPLC-MS/MS監(jiān)測護膚化妝品中13種性激素成分的非法添加

汪元符，劉志斌，熊震球，駱瑜，袁愛華，劉玢

（南昌市食品藥品檢驗所，江西 南昌 330038）

目的：針對護膚化妝品，建立13種性激素化學成分非法添加，采用QuEChERS前處理方式-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）的監(jiān)測方法。方法：色譜柱為Phenomenex Luna Omega 1.6 μm C18100A，150 mm×2.1 mm，柱溫為40℃，流動相為水及乙腈，梯度洗脫，流速為0.2 mL/min，以優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)采集信號。結果：各成分檢出限濃度為2～30 ng/mL，定量限濃度為5～50 ng/mL，線性范圍為各成分定量限～500 ng/mL，在線性范圍內(nèi)相關系數(shù)均在0.99以上，平均加樣回收率在87.2%～99.8%。結論：本方法準確，靈敏度高，專屬性好；可用于護膚化妝品中13種性激素化學成分非法添加的同時定性及定量監(jiān)測。

QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；護膚化妝品；性激素；非法添加

性激素包括雌性激素、孕激素、雄性激素三大類。性激素具有控制附性器官和第二性征的作用，同時參與人體內(nèi)糖份、脂肪、蛋白質(zhì)、無機鹽等生命基本物質(zhì)的代謝活動。當性激素直接作用于皮膚時，短期內(nèi)可見促進毛發(fā)生長、防止皮膚老化、祛除皮膚皺紋、增加皮膚彈性等作用，長期應用則可能導致色素沉積、產(chǎn)生黑斑、皮膚萎縮變薄、甚至具有高度的致癌風險。因此，在護膚化妝品中非法添加性激素的行為具有高度風險。在最新頒布的《化妝品安全技術規(guī)范》（2015年版）中，列有雌三醇、雌酮、己烯雌酚、雌二醇、睪丸酮、甲基睪丸酮、黃體酮等7種性激素的檢測和鑒定方法，采用的是液相色譜法及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。液相色譜法存在不能確證的問題，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法存在衍生操作步驟繁瑣，難以掌握與運用的問題。另一方面，我國實際生產(chǎn)并使用的性激素可達幾十種之多，常見常用的也有十幾種，只測7種存在監(jiān)測方法嚴重缺失的問題?；谏鲜隹紤]，在進行護膚化妝品中性激素含量監(jiān)測的實踐中，本實驗室引入快速、簡單、價廉、高效、耐用、安全的QuEChERS前處理提取方法，結合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）檢測平臺，采用電噴霧離子源負、正離子同時監(jiān)測，能實現(xiàn)同時對13種常用的性激素定性確證與定量測定，能夠更好地滿足化妝品衛(wèi)生安全監(jiān)管中性激素監(jiān)測的需要。

1 儀器、試劑與材料

AB Sciex 4000 Qtrap質(zhì)譜， Ekspert ultraLC100超高效液相色譜儀，METTLER TOLEDO ME204E電子分析天平，METTLER TOLEDO XS105電子分析天平，Hettich Rotina 380R 1706 型醫(yī)用低速離心機，昆山KQ-300DB 型數(shù)控超聲波清洗器，Millipore超純水系統(tǒng)。

試劑：乙腈（色譜純，Merck），無水硫酸鎂（優(yōu)級純），無水醋酸鈉（優(yōu)級純），C18（粒度100 μm，安譜），PSA（安譜），石墨化碳（安譜）。

對照品：雌三醇（CAS No. 50-27-1，C13213200）、雌二醇（CAS No. 50-28-2，C13213000）、己烯雌酚（CAS No. 56-53-1，C12607000）、群勃龍（CAS No. 10161-33-8，C17607700）、雌酚酮（CAS No. 53-16-7，C13213230）、勃地龍（寶丹酮）（CAS No. 846-48-0，C10662000）、諾龍（19-去甲睪酮）（CAS No. 434-22-0，C15652000）、睪酮（CAS No. 58-22-0，C17322500）、甲 睪 酮（CAS No. 58-18-4，C15144000）、 黃 體 酮（CAS No. 57-83-0，C16342000）、丙酸諾龍（CAS No. 7207-92-3，C15652010）、丙酸睪酮（CAS No. 57-85-2，C17322540）、苯丙酸諾龍（CAS No. 62-90-8，100004-200603），除苯丙酸諾龍來源為中國食品藥品檢定研究院外其他均為Dr. Ehrenstorfer GmbH。

樣品購自流通。溶液類樣品共6批：護膚玫瑰精油（凈含量：138 mL，保質(zhì)期：20181101），雙飛人爽水（凈含量：50 mL，保質(zhì)期：20201220），眼部精華液（凈含量：20 mL，保質(zhì)期：20180528），秀域佳芬保濕柔膚水（凈含量：2 mL，保質(zhì)期：20180305），北海道馬油（凈含量：25 mL，保質(zhì)期：20181217），威治藥莊逗可迪新生淡印精華（凈含量：10 mL，保質(zhì)期：20180706）。霜膏類樣品共10批：冰王蘆薈膠（凈含量：30 g，保質(zhì)期：20190301），青瓜沁水保濕潔面乳（凈含量：100 g，保質(zhì)期：20181023），達抒靈尿素維E護膚膏（凈含量：50 g，保質(zhì)期：20181019），修生潤膚膏（凈含量：10 g，保質(zhì)期：20180602），裂王抗裂修復霜（凈含量：80 g，保質(zhì)期：20180609），二天堂靈芝蘆薈祛痘膏（凈含量：20 g，保質(zhì)期：20190314），虎鏢痘可迪清痘消痕乳膏（凈含量：18 g，保質(zhì)期：20190102），奇力康軟質(zhì)霜（凈含量：10 g，保質(zhì)期：20190721），亮芙美麗無痕修復霜（凈含量：60 g，保質(zhì)期：20180416），痤美先潔面乳（凈含量：60 g，保質(zhì)期：20180312）。

2 方法與結果

2.1 高效液相色譜分析條件

分析柱：Phenomenex Luna Omega 1.6 μm C18100A，150 mm×2.1 mm。柱溫：40℃。流速：0.2 mL/min。進樣量：5 μL。流動相：A為水，B為乙腈。按表1進行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序

2.2 質(zhì)譜分析條件

電噴霧離子源（ESI）：負離子模式（ESI－）及正離子模式（ESI＋）。掃描模式：多重反應監(jiān)測（MRM）。掃描范圍：50～600 Da。氣簾氣壓力：25 Pa。碰撞氣密度：中。電離噴霧電壓：5500 V。離子源溫度：500℃。霧化氣壓力：55 Pa。輔助氣壓力：50 Pa。界面加熱狀態(tài)：開啟。離子對選擇見表2。

表2 離子對質(zhì)譜分析

2.3 對照品溶液的配制

取雌三醇、雌二醇、己烯雌酚、群勃龍、雌酚酮、勃地龍、諾龍、睪酮、甲睪酮、黃體酮、丙酸諾龍、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍對照品各10 mg，精密稱定，以乙腈制成每1 mL中各含10 μg的溶液作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備溶液1 mL，以乙腈制成各含1000 ng/mL和100 ng/mL的溶液，作為對照品使用液。

標準系列工作液的配制：以10 mL量瓶制備，分別精密量取濃度為100 ng/mL 和1000 ng/mL的混合標準品使用溶液適量，以50%乙腈水溶液定容至10 mL，制成各含雌三醇、雌二醇、己烯雌酚、群勃龍、雌酚酮、勃地龍、諾龍、睪酮、甲睪酮、黃體酮、丙酸諾龍、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍濃度為1.0 ng/mL，2.0 ng/mL，3.0 ng/mL，4.0 ng/mL，5.0 ng/mL，10.0 ng/mL，20.0 ng/mL，30.0 ng/mL，40.0ng/mL，50.0 ng/mL，100.0 ng/mL，200.0 ng/mL，300.0 ng/mL，400.0 ng/mL，500.0 ng/mL的標準系列工作液。

2.4 供試品溶液的配制

取2 g試樣（精確至0.01 g）置50 mL聚四氟乙烯具蓋離心管中，加水至10 mL，振搖使分散均勻，再加入15 mL乙腈，渦旋振蕩3 min，使充分分散均勻，超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）30 min，放冷至室溫，加入3 g無水硫酸鎂和1.5 g無水醋酸鈉，迅速振搖，渦旋振蕩1 min，以5000 r/min離心5 min，取上清液作進一步凈化。

凈化：稱取150 mg（±5 mg）PSA，300 mg（±5 mg）無水硫酸鎂，100 mg（±5 mg）C18，50 mg（±5 mg）石墨化碳，置于15 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，移取5 mL上清液至此離心管中，渦旋混合1 min，以10000 r/min，離心3 min，移取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，取濾液待測。

2.5 對照品濃度為100 ng/mL時各離子對提取質(zhì)譜圖，見圖1～26。

圖1 雌三醇定量離子對（287.1/171.0）提取質(zhì)譜圖

圖2 雌三醇定性離子對（287.1/145.0）提取質(zhì)譜圖

圖3 雌二醇定量離子對（271.0/145.0）提取質(zhì)譜圖

圖4 雌二醇定性離子對（271.0/182.9）提取質(zhì)譜圖

圖5 己烯雌酚定量離子對（267.1/251.1）提取質(zhì)譜圖

圖6 己烯雌酚定性離子對（267.1/237.1）提取質(zhì)譜圖

圖7 群勃龍定量離子對（271.1/253.1）提取質(zhì)譜圖

圖8 群勃龍定性離子對（271.1/199.0）提取質(zhì)譜圖

圖9 雌酚酮定量離子對（271.3/133.1）提取質(zhì)譜圖

圖10 雌酚酮定性離子對（271.3/159.1）提取質(zhì)譜圖

圖11 勃地龍定量離子對（287.3/121.3）提取質(zhì)譜圖

圖12 勃地龍定性離子對（287.3/135.4）提取質(zhì)譜圖

圖13 諾龍定量離子對（275.5/109.0）提取質(zhì)譜圖

圖14 諾龍定性離子對（275.5/257.1）提取質(zhì)譜圖

圖15 睪酮定量離子對（289.3/97.0）提取質(zhì)譜圖

圖16 睪酮定性離子對（289.3/109.0）提取質(zhì)譜圖

圖17 甲睪酮定量離子對（303.2/109.0）提取質(zhì)譜圖

圖18 甲睪酮定性離子對（303.2/97.0）提取質(zhì)譜圖

圖19 黃體酮定量離子對（315.2/109.0）提取質(zhì)譜圖

圖20 黃體酮定性離子對（315.2/97.0）提取質(zhì)譜圖

圖21 丙酸諾龍定量離子對（331.5/257.1）提取質(zhì)譜圖

圖22 丙酸諾龍定性離子對（331.5/109.0）提取質(zhì)譜圖

圖23 丙酸睪酮定量離子對（345.4/271.2）提取質(zhì)譜圖

圖24 丙酸睪酮定性離子對（345.4/97.0）提取質(zhì)譜圖

圖25 苯丙酸諾龍定量離子對（407.2/105.1）提取質(zhì)譜圖

圖26 苯丙酸諾龍定性離子對（407.2/257.1）提取質(zhì)譜圖

2.6 定性確認

采用保留時間與對照品相一致，且定性與定量離子對相對離子豐度比應滿足表3要求，判為檢出。

各對照品試驗結果見表4。

表3 定性確證時相對離子豐度比的最大允許偏差 （%）

2.7 線性關系及檢出限、定量限考察

采用“2.1”項下的色譜條件，“2.2”項下的質(zhì)譜條件，以“2.3”項下的標準系列溶液進樣檢測。以檢測所得峰面積為縱坐標，以標準系列溶液濃度（ng/mL）為橫坐標，進行線性擬合。以定性離子對和定量離子對提取的質(zhì)譜圖信噪比均＞3時的濃度（ng/mL）為檢出限。以定性離子對提取的質(zhì)譜圖信噪比＞3，定量離子對提取的質(zhì)譜圖信噪比＞10時的濃度（ng/mL）為定量限。以在一定濃度范圍內(nèi)，相關系數(shù)＞0.99，為線性范圍。結果見表5。

2.8 精密度試驗

選用標準系列溶液中各成分濃度為100 ng/mL的標準溶液，連續(xù)進樣6針，以提取的定量離子對質(zhì)譜圖峰面積計算。結果見表6。

2.9 穩(wěn)定性試驗

選用標準系列溶液中各成分濃度為100 ng/mL的標準溶液，在0，1，2，4，8，12，24 h分別進樣，以提取的定量離子對質(zhì)譜圖峰面積計算。結果見表7。

表4 對照品試驗結果

2.10 回收率試驗

以基質(zhì)較為復雜的冰王蘆薈膠為空白樣品進行加標。加標前以本法檢測證實為陰性樣品。平行取9份，分別為2 g，各精密加入對照品儲備液（10 μg/mL）0.150 mL，0.375 mL，0.600 mL，然后按“2.4”項下其余步驟制備樣液，以15 mL乙腈體積分數(shù)計，則最終加標樣液濃度理論值應為100 ng/mL，250 ng/mL，400 ng/mL，以此計算回收率，結果見表8。

表5 線性關系及檢出限、定量限考察結果

表6 精密度試驗結果

表7 穩(wěn)定性試驗結果

表8 加標回收試驗結果

各組分高、中、低3個濃度的回收率均在87.2%～99.8%。

2.11 樣品測定結果

以本法檢測了16個批次樣品，結果僅一批眼部精華液檢出雌酚酮，含量為0.72 mg/kg。

3 討論

3.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

曾分別試用化學電離（APCI）離子源與ESI離子源，結果表明APCI離子源離子化效率低，信號較弱，應采用ESI離子源。又經(jīng)試驗表明，雌三醇、雌二醇、己烯雌酚在負離子模式下信號更強，群勃龍、雌酚酮、勃地龍、諾龍、睪酮、甲睪酮、黃體酮、丙酸諾龍、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍在正離子模式下信號更強。

3.2 液相色譜條件的選擇

在已確定色譜柱的情況下，流動相及其洗脫方式的選擇猶為重要。曾試用“0.1%甲酸水-乙腈”“乙酸銨溶液-乙腈”等酸性流動相系統(tǒng)，結果發(fā)現(xiàn)在酸性環(huán)境中對性激素的離子化會產(chǎn)生嚴重抑制，因而應使用中性的“水-乙腈”流動相系統(tǒng)，效果滿意。流動相起始比例及洗脫方式也會影響信號的響應及不同組分能否分離。經(jīng)試驗，采用本法的洗脫方式，各組分信號較強，分離效果也佳。

3.3 QuEChERS方法的優(yōu)化

本法采用了最基礎的QuEChERS方法，結果尚滿意。QuEChERS中所使用的吸附劑種類與配比還可進一步優(yōu)化，能提高檢測的準確性。

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本文編輯：蘇日力嘎

Monitoring on Thirteen Kinds of Sexual Hormones Illegally Added in Skin Care Cosmetics by QuEChERS-UPLC-MS/MS

Wang Yuan-fu, Liu Zhi-bin, Xiong Zhen-qiu, Luo Yu, Yuan Ai-hua, Liu Bin

(Nanchang Institute for Food and Drug Control, Jiangxi Nanchang 330038, China)

Objective：To establish a QuEChERS-UPLC-MS/MS method for determination of thirteen kinds of sexual hormones illegally added in skin care cosmetics. Methods：Phenomenex Luna Omega 1.6μm C18100A (150 mm × 2.1 mm) column was used at a temperature of 40℃, serving water-acetonitrile as a mobile phase at a flow rate of 0. 2 mL/min. The signal was collected under optimized condition. Results：The detection limit of this method was 2～30 ng/mL, while the limit of quantitation was 5～50 ng/mL. The linear range was the limit of quantitation～500 ng/mL, with R2values of more than 0.99. The test results showed the related coefficient in the linear range was more than 0.99. The average recoveries of the method were 87.2%～99.8%. Conclusion：This method is accurate, sensitive and specific, which can be used for the qualitative and quantitative determinations of thirteen kinds of sexual hormones illegally added in skin care cosmetics.

QuEChERS-UPLC-MS/MS; Skin care Cosmetics; Sexual Hormones; Illegally Added

O657.7＋2

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.03.010

2016 - 12 - 25

護膚化妝品中性激素含量的監(jiān)測，項目立項文號：洪科發(fā)計字【2016】96號，項目編號：第84項

汪元符，男，主管藥師。研究方向：醫(yī)藥衛(wèi)生。通訊作者E-mail：wanngel@126.com