褪黑素對(duì)大鼠腹膜纖維化抑制作用的研究

趙華 高延霞

·實(shí)驗(yàn)研究·

褪黑素對(duì)大鼠腹膜纖維化抑制作用的研究

趙華 高延霞

目的 探討褪黑素對(duì)大鼠腹膜纖維化的抑制作用及機(jī)制。方法 將45只雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組15只。對(duì)照組每天給予生理鹽水1.0 ml·100 g-1·d-1腹腔注射；模型組每天給予0.1%葡萄糖氯己定1.0 ml·100 g-1·d-1腹腔注射；褪黑素組在模型組基礎(chǔ)上每天給予褪黑素5.0 mg·kg-1·d-1溶于0.5 ml 0.9%生理鹽水腹腔注射；以上操作均持續(xù)14 d。14 d后分別測(cè)量3組大鼠的腹膜超濾量，之后處死大鼠并留取大鼠腹膜組織。HE染色觀察大鼠腹膜組織形態(tài)學(xué)變化，免疫組化檢測(cè)腹膜組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)的表達(dá)，Western-blot檢測(cè)腹膜組織p-Smad2/3及Smad7的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 與對(duì)照組比較，模型組大鼠腹膜超濾量減少，腹膜厚度顯著增加，且伴有間皮細(xì)胞排列紊亂、間皮下膠原纖維沉積、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等腹膜纖維化表現(xiàn)，且對(duì)TGF-β1及p-Smad2/3、Smad7蛋白的表達(dá)顯著增加。與模型組比較，褪黑素組大鼠腹膜超濾量改善，腹膜纖維化表現(xiàn)減輕，腹膜組織變薄，對(duì)TGF-β1及p-Smad2/3、Smad7蛋白的表達(dá)顯著減少。結(jié)論 褪黑素可在一定程度上抑制大鼠腹膜纖維化進(jìn)展，其抑制作用通過(guò)下調(diào)TGF-β/Smad通路的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

腹膜纖維化；褪黑素；TGF-β/Smad

慢性腎功能不全的發(fā)病率正逐年增高，而慢性腎功能不全最終不可避免進(jìn)展到終末期腎病，需行腎臟替代治療，現(xiàn)有的腎臟替代治療方式有腹膜透析、血液透析、腎移植。 而其中腎移植因腎源有限等因素制約，透析治療成為最主要的腎臟替代治療方式，其中腹膜透析因較血液透析經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)輕、安全性高[1-2]，并且能較好的保護(hù)殘余腎功能、延緩腎臟疾病惡化速度[3-4]而成為一部分患者首先的治療方式。但隨著腹膜透析的延長(zhǎng)，因腹膜透析液的生物不相容性、全身微炎癥狀態(tài)、反復(fù)發(fā)生腹膜炎以及尿毒癥毒素等多種因素的共同作用，可以引起腹膜結(jié)構(gòu)和功能的逐漸改變，發(fā)生腹膜纖維化，最終導(dǎo)致腹膜超濾功能衰竭，成為影響腹膜透析患者生存率及其被迫退出腹膜透析的主要原因[5-6]。對(duì)于抑制腹膜透析相關(guān)性腹膜纖維化發(fā)生發(fā)展，目前臨床上沒(méi)有效治療措施，仍是亟需解決的問(wèn)題之一。褪黑素為松果體分泌的一種具有抗炎、抗氧化、抗纖維化等吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌激素，已有研究證實(shí)，褪黑素對(duì)大鼠肝臟纖維化具有抑制作用[7-8]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)葡萄糖氯己定誘導(dǎo)大鼠腹膜纖維化從而建立腹膜透析大鼠纖維化模型，旨在探討褪黑素對(duì)大鼠腹膜纖維化的抑制作用及其機(jī)制。

材料與方法

一、研究對(duì)象

雄性SD大鼠45只，6周齡，體質(zhì)量160～180 g。飼養(yǎng)于青島大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物房，溫度(20±2) ℃，濕度50%～55%，12 h交替照明，自由進(jìn)食水。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

二、實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)措施

將45只SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組15只。對(duì)照組每天給予生理鹽水1.0 ml·100g-1·d-1腹腔注射；模型組每天給予0.1%葡萄糖氯己定1.0 ml·100g-1·d-1腹腔注射；褪黑素組在模型組基礎(chǔ)上每天再給予褪黑素5.0 mg·kg-1·d-1溶于0.5 ml 0.9%生理鹽水腹腔注射；以上操作均持續(xù)14 d。14 d后分別測(cè)量3組大鼠的腹膜超濾量，之后處死大鼠并留取大鼠腹膜組織。HE染色觀察大鼠腹膜組織形態(tài)學(xué)變化，免疫組化檢測(cè)腹膜組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)的表達(dá)，Western-blot檢測(cè)腹膜組織p-Smad2/3及Smad7的蛋白表達(dá)情況。

三、觀察指標(biāo)

1.組織形態(tài)學(xué)檢測(cè) 避開(kāi)注射部位，沿大鼠腹中線中部?jī)蓚?cè)取壁層組織1份，固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋后切片，以二甲苯脫蠟，酒精梯度復(fù)水后進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察大鼠壁層腹膜形態(tài)并比較各組腹膜厚度，各組腹膜厚度的測(cè)量值即腹膜表面和肌層間的垂直距離平均值。

2.免疫組化檢測(cè)壁層腹膜TGF-β1的表達(dá) 常規(guī)切片，將切片浸于二甲苯中30 min、梯度酒精涮洗、自來(lái)水沖洗；3%甲醇雙氧水20 min滅活內(nèi)源性酶，將玻片放入抗原修復(fù)液中修復(fù)，后切片上滴加山羊血清封閉液，室溫20 min。切片上滴加一抗，4 ℃過(guò)夜，0.1 PBS洗3次×5 min；切片上滴加生物素化二抗(IgG)，37 ℃ 20 min，0.1 PBS洗3次×5 min；切片上滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37 ℃ 20 min，0.1 PBS洗3次×5 min； DAB顯色；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核；中性樹(shù)脂封片；顯微鏡觀察、顯微照相。應(yīng)用Image-ProPlus 6.0圖像分析系統(tǒng)將陽(yáng)性強(qiáng)度量化為平均光密度值。

3. Western-blot檢測(cè)臟層腹膜p-Smad2/3及Smad7的蛋白表達(dá) ①制備SDS-PAGE 凝膠；②制備電泳樣品：取大鼠臟層腹膜組織，切碎后置于勻漿器中并研磨粉碎，裂解后留取上清液，使用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒對(duì)留取的上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)定量測(cè)定，加入適量緩沖液混勻后進(jìn)行離心，收集上清液；③電泳；④轉(zhuǎn)膜；⑤封閉；⑥一抗孵育：將PVDF膜置于稀釋好的一抗(p-Smad2/3抗體、Smad7抗體)中，室溫孵育1 h后，棄去一抗液， PVDF在TBST溶液中洗滌3次，每次5 min，以洗凈游離的膜表面一抗；⑦將PVDF膜置于稀釋好的二抗中，室溫中孵育1 h后，棄去二抗液，PVDF膜在TBST溶液中洗滌3次，每次洗滌5 min；⑧蛋白檢測(cè)：將ECL試劑盒中的A、B液按比例混合覆蓋在PVDF膜表面，置于暗盒中，并進(jìn)行曝光、拍照、掃描，最終測(cè)出灰度值。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、大鼠腹膜超濾情況

模型組大鼠死亡1只，對(duì)照組、褪黑素組未見(jiàn)死亡。模型組、褪黑素組成功建立腹膜纖維化大鼠模型，腹膜超濾量分別為(-1.23±1.90) L/min、(2.42±0.36) L/min，對(duì)照組腹膜超濾量(3.52±1.05) L/min。與對(duì)照組比較，模型組、褪黑素組大鼠腹膜超濾量明顯降低(P<0.05)；褪黑素組大鼠腹膜超濾量和模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

二、壁層腹膜組織HE染色情況

光鏡下觀察大鼠壁層腹膜形態(tài)：對(duì)照組大鼠壁層腹膜組織很薄，間皮細(xì)胞排列整齊；而模型組腹膜較對(duì)照組明顯增厚，間皮細(xì)胞排列紊亂、脫落，間皮下膠原纖維沉積、基質(zhì)增厚、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；褪黑素組較模型組腹膜變薄，以上形態(tài)學(xué)表現(xiàn)亦減輕。對(duì)照組、模型組、褪黑素組大鼠壁層腹膜厚度分別為(18.01±3.27) μm、(50.11±3.97) μm、(29.42±4.19) μm，三者間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(圖1)

三、免疫組化檢測(cè)壁層腹膜TGF-β1的表達(dá)

對(duì)照組大鼠壁層腹膜組織TGF-β1僅有少量表達(dá)或幾乎無(wú)表達(dá)，模型組表達(dá)明顯增加(P<0.05)；褪黑素組表達(dá)較對(duì)照組增加(P<0.05)，但較模型組表達(dá)受抑制(P<0.05)。對(duì)照組、模型組、褪黑素組大鼠TGF-β1平均光密度值分別為0.004 2±0.000 5、0.035 9±0.001 9、0.013 2±0.002 2，三者間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(圖2)

四、Western-blot檢測(cè)臟層腹膜p-Smad2/3及Smad7的蛋白表達(dá)

與對(duì)照組相比，模型組大鼠腹膜組織對(duì)p-Smad2/3及Smad7的表達(dá)明顯增加(P<0.05)，褪黑素組大鼠腹膜組織對(duì)p-Smad2/3及Smad7的表達(dá)較模型組減少(P<0.05)。(圖3)

討 論

慢性腎臟病的患病率正逐年提高，已成為重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)慢性腎臟病的發(fā)病率現(xiàn)已高達(dá)10.8%，而進(jìn)展為終末期腎病的患者已高達(dá)200萬(wàn)左右[9]，而腎臟替代治療為終末期腎病患者唯一有效的治療方法。目前腎臟替代治療方案有腹膜透析、血液透析、腎移植，而腹膜透析因其經(jīng)濟(jì)、有效，且能較好的保護(hù)殘余腎功能、延緩腎臟疾病惡化得到廣泛應(yīng)用。有研究顯示至2014年底全國(guó)范圍的血液凈化病例信息登記系統(tǒng)內(nèi)共登記維持性腹膜透析患者55 373例，平均以每年新增7 891例速度增長(zhǎng),增長(zhǎng)率為20.8%[10]。腹膜透析正在得到更廣泛認(rèn)可，但在腹膜透析過(guò)程中，由于透析液的生物不相容性、腹膜透析相關(guān)性腹膜炎、全身微炎癥狀態(tài)以及尿毒癥毒素等，共同引起腹膜的改變進(jìn)而啟動(dòng)腹膜纖維化，腹膜纖維化會(huì)導(dǎo)致超濾衰竭，成為患者退出腹膜透析的主要原因并亟需解決的問(wèn)題之一。

圖1 各組大鼠壁層腹膜HE染色情況(×400)

圖2 各組大鼠壁層腹膜TGF-β1表達(dá)情況(×400)

圖3 各組大鼠壁層腹膜TGF-β1表達(dá)情況(×400)

腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程涉及到眾多細(xì)胞因子及組織因子，例如TGF-β1、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等。眾多研究顯示腹膜TGF-β1是透析相關(guān)性腹膜纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子[11]，TGF-β1與受體結(jié)合后，通過(guò)Smad蛋白將信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，Smad蛋白分成3個(gè)亞家族，分別為R-Smads(受體激活型Smads)、I-Smads (抑制型Smads)以及共Co-Smads(同通路型Smads)。R-Smads中Smad2、Smad3被磷酸化而活化后，可與Co-Smads結(jié)合，參與TGF-β1/Smad通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。而I-Smads中Smad7發(fā)揮相反的作用，抑制TGF-β1/Smad通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[12]。褪黑素為松果體分泌的具有廣泛生理作用的一種吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌激素，具有強(qiáng)大的抗炎、抗氧化作用[13-14]。褪黑素可以下調(diào)炎癥反應(yīng)過(guò)程中的重要啟動(dòng)因子之一核因子B的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用，與細(xì)胞膜及細(xì)胞核等部位的自身受體結(jié)合，使抗氧化酶的活性增強(qiáng)并限制自由基的生成而發(fā)揮抗氧化作用。有研究顯示褪黑素能夠一定程度抑制大鼠肝臟、肺、腎臟的纖維化進(jìn)展?；谕屎谒氐纳鲜鲎饔茫緦?shí)驗(yàn)通過(guò)葡萄糖氯己定腹腔注射構(gòu)建大鼠建立大鼠腹膜纖維化模型[15]，探討褪黑素對(duì)腹膜纖維化大鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)中大鼠給予褪黑素干預(yù)后，腹膜組織病理學(xué)改變及腹膜對(duì)TGF-β1、p-Smad2/3的表達(dá)均減少，故認(rèn)為褪黑素能夠通過(guò)減少TGF-β1的表達(dá)，通過(guò)抑制TGF-β1/Smad通路表達(dá)而抑制葡萄糖氯己定誘導(dǎo)的大鼠腹膜纖維化的進(jìn)展。Smad7作為TGF-β信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)控蛋白，發(fā)揮與Smad2/3相反的作用，與Smad2/3競(jìng)爭(zhēng)TβRⅠ(Ⅰ型受體)，并且可以通過(guò)E3-泛素連接酶轉(zhuǎn)移至活化的TβRⅠ使其受體降解，從而抑制Smad2/3的磷酸化過(guò)程。模型組大鼠予腹腔注射葡萄糖氯己定，TGF-β1/Smad通路被激活，腹膜發(fā)生纖維化啟動(dòng)，Smad7表達(dá)增多以對(duì)抗腹膜纖維化。而本研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素組大鼠予褪黑素干預(yù)后，其腹膜纖維化程度減輕，但對(duì)腹膜纖維化其抑制作用的Smad7蛋白的表達(dá)也減少，考慮Smad7蛋白的減少可能與TGF-β1/Smad通路被抑制相關(guān)，其具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

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Inhibitory effect of melatonin on peritoneal fibrosis in rats and its mechanism

ZHAOHua,GAOYan-xia.

DepartmentofUrology,AffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266021,China

GAOYan-xia,Email:gaoyanxia31@163.com

Objective To investigate the inhibitory effect and the mechanism of melatonin on peritoneal fibrosis in rats.Methods Forty-five male SD rats were randomly divided into 3 groups (n=15 each). The control group was intraperitoneally injected with normal saline (1.0 ml·100 g-1·day-1). Model group was intraperitoneally injected with 0.1% chlorhexidine gluconate (1.0 ml·100 g-1·day-1). Model and melatonin group was intraperitoneally injected with 0.1% glucose (1.0 ml·100 g-1·day-1) and melatonin (5.0 mg·kg-1·day-1) dissolved in 0.5 ml 0.9% normal saline simultaneously. The ultrafiltration volume was measured after 14 days. The rats were then sacrificed and the peritoneal tissue was obtained. HE staining was used to observe the morphological changes of peritoneal tissue. The expression of TGF-β1 in parietal peritoneum was detected by immunohistochemistry. Western blotting was applied to detect the expression of p-Smad2/3 and Smad7 proteins in visceral peritoneum.Results As compared with the control group, the peritoneal ultrafiltration volume in the model group was decreased, and the peritoneal thickness was significantly increased. In the model group, peritoneal fibrosis presented as mesothelial cell disorder, subcutaneous collagen fiber deposition, inflammatory cell infiltration, etc. What’s more, the expression of TGF-β1, p-Smad2, Smad7 protein was significantly increased. As compared with the model group, the peritoneal ultrafiltration volume in the model+melatonin group was improved, the peritoneal fibrosis was alleviated, the peritoneal tissue was thinned, and the expression of TGF-β1, p-Smad2/3 and Smad7 protein was significantly decreased.Conclusions Melatonin can inhibit the progress of peritoneal fibrosis in rats, and its inhibitory effect is achieved by down-regulating the expression of TGF-β/Smad pathway.

Peritoneal fibrosis; Melatonin; TGF-β/Smad

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.04.011

266021 青島，青島大學(xué)附屬醫(yī)院腎內(nèi)科(趙華)；266036 青島，山東大學(xué)齊魯醫(yī)院(青島)泌尿內(nèi)科(高延霞)

高延霞，E-mail:gaoyanxia31@163.com

2016-10-13

2017-01-05)