表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

左松 張炯

·實(shí)驗(yàn)研究·

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

左松 張炯

目的 探討表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及作用機(jī)制。方法 將50只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和EGCG(低，中，高)劑量組，每組10只。利用血管夾夾閉大鼠雙側(cè)腎蒂45 min，構(gòu)建大鼠腎缺血再灌注損傷模型?；謴?fù)腎臟血流灌注24 h后，處死大鼠，收集血清。利用ELISA法檢測(cè)血清肌酐(SCr)、血清尿素氮(BUN)、干擾素(interferon-γ, IFN-γ)、腫瘤壞死因子(tumor meerosis factor-α, TNF-α)和白介素6(interleukin- 6, IL-6)表達(dá)水平；取腎臟標(biāo)本PAS染色法觀察腎組織病理形態(tài)；黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)過(guò)氧化氫酶(Cata-lase，CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性；硫代巴比妥酸法檢測(cè)丙二醛(malonaldehyde, MDA)的含量；免疫蛋白印記(Western blotting) 法檢測(cè)p53、Wnt、p21和β-catenin表達(dá)水平；實(shí)時(shí)定量PSCR(RT-PSCR)檢測(cè)腎臟IFN-γ、TNF-α和IL-6含量。結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型組SCr、BUN、IFN-γ、TNF-α、 IL-6、 MDA、p53、Wnt、p21、β-catenin、IFN-γ、TNF-α和IL-6 表達(dá)水平以及腎組織病理改變均明顯增高，而CAT,GPx 和SOD活性明顯降低。與模型組相比， EGCG高劑量組SCr、BUN、IFN-γ、TNF-α、 IL-6、 MDA、p53、Wnt、p21、β-catenin、IFN-γ、TNF-α和IL-6 表達(dá)水平以及腎組織病理改變均明顯降低，而CAT,GPX和SOD活性明顯增高。結(jié)論 EGCG預(yù)處理可通過(guò)抑制炎癥和氧化應(yīng)激而減輕腎臟缺血再灌注損傷，其作用機(jī)制與抑制Wnt/β-catenin/p53信號(hào)通路激活相關(guān)。

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯；腎缺血再灌注損傷；炎癥；氧化應(yīng)激

腎臟缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)是臨床上常見(jiàn)的危重病理生理過(guò)程，常見(jiàn)于腎動(dòng)脈血流阻斷、腎移植和低休克等危重情況, 可導(dǎo)致急性腎損傷或移植腎術(shù)后功能恢復(fù)延遲。如何預(yù)防IRI是一個(gè)亟待解決的重大臨床問(wèn)題[1-4]。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)是提取于綠茶的主要活性成分，可有效清除氧自由基和調(diào)節(jié)免疫[5-6]。近年來(lái)，研究還發(fā)現(xiàn)EGCG對(duì)腸、腦、心臟等器官缺血損傷有保護(hù)作用[7-9]。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠腎臟IRI模型[1-4],探討EGCG對(duì)腎臟IRI的保護(hù)作用及其機(jī)制。

材料與方法

一、材料

1.實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 EGCG(美國(guó)Sigma公司,批號(hào)20140726)，水合氯醛(谷歌生物，批號(hào)MB1699)；Wnt (美國(guó)CST公司,批號(hào)13808), β-catenin (美國(guó)CST公司,批號(hào)1002)，p53(美國(guó)CST公司,批號(hào)8357),p21(CST，USA, 9867), TRIzol reagent (美國(guó)Invitrogen公司,批號(hào)15596-026), 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)GeneCopoeia公司,批號(hào)K1622)，PAS試劑(宜賓市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科病理實(shí)驗(yàn)室)。紫外分光光度計(jì)(Thermo fisher)，RT-PSCR儀(BIO-RAD IQ5)，逆轉(zhuǎn)錄儀(eppendorf)，顯微鏡(Olympus BX51)及成像系統(tǒng)(HITMAS-30)。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只雄性SD大鼠，體質(zhì)量(220±25) g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境,12 h光照周期，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

二、實(shí)驗(yàn)分組

將50只SD大鼠分為假手術(shù)組、模型組和EGCG低、中、高劑量組。EGCG低、中、高劑量組術(shù)前45 min分別給予EGCG 10、20、40 mg/kg腹腔注射，假手術(shù)組和模型組則給予等量生理鹽水腹腔注射。模型組和EGCG低、中、高劑量組制備大鼠腎臟IRI模型。具體IRI模型制備方式參考文獻(xiàn)[10]：大鼠術(shù)前禁食不禁水12 h，用3.5%水合氯醛10 ml/kg腹腔注射麻醉，腹部備皮，碘伏消毒后，腹部正中切口暴露雙側(cè)腎臟，鈍性分離雙側(cè)腎動(dòng)脈，保護(hù)輸尿管，距腎門(mén)0.5 cm處用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)腎動(dòng)脈，夾閉45 min后松開(kāi)動(dòng)脈夾恢復(fù)灌注，腎臟由暗紅色恢復(fù)紅潤(rùn)表明再灌注成功，然后逐層縫合切口。假手術(shù)組只暴露雙側(cè)腎蒂(不夾閉)，暴露45 min后再關(guān)閉切口。大鼠麻醉清醒后轉(zhuǎn)入代謝籠內(nèi)自由進(jìn)水及進(jìn)食,恢復(fù)腎臟血流灌注24 h后處死大鼠，摘除大鼠右腎并收集血清。

三、方法

1.腎臟病理檢查 取腎臟標(biāo)本，多聚甲醛固定,脫水浸蠟,石蠟包埋,4 μm切片, 行PAS染色, 光鏡下觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)，在病變嚴(yán)重處采用Paller法對(duì)腎小管損傷程度評(píng)分，即每高倍鏡視野(PH)隨機(jī)選擇(10)個(gè)有病變的腎小管，按(100)個(gè)腎小管記分：腎小管明顯擴(kuò)張、細(xì)胞扁平計(jì)1分；刷狀緣損傷計(jì)1分，脫落計(jì)2分；管型計(jì)2分，腎小管管腔內(nèi)有脫落的、壞死的細(xì)胞(未成管型或細(xì)胞碎片)計(jì)1分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考相關(guān)文獻(xiàn)[11]。

2.Western檢測(cè)蛋白表達(dá) 按說(shuō)明書(shū)方法提取各組腎臟細(xì)胞總蛋白，定量，變性，上樣，電泳, 轉(zhuǎn)膜, 封閉，孵一抗Wnt (1∶1 000), β-catenin (1∶500)，p53 (1∶500), p21(1∶500)和β-actin(1∶4 000)，洗膜, 孵二抗IgG( 1∶400)、洗膜，顯影，分析，具體方法參考說(shuō)明書(shū)。

3.PSCR檢測(cè) 取腎臟組織細(xì)胞，研磨，提取總RNA，檢測(cè)RNA含量，反轉(zhuǎn)錄，上樣檢測(cè)。PSCR以β-actin為內(nèi)參, 具體方法參考文獻(xiàn)[6]，引物序列如表1所示，擴(kuò)增條件為：95 ℃(10 min)→95 ℃(10 s)→60 ℃(1 min)×40個(gè)循環(huán)，利用圖像分析儀器上進(jìn)行掃描分析，將白介素-6(interleukin-6, IL-6), 腫瘤壞死因子(tumor meerosis factor-α, TNF-α)和干擾素(interferon-γ, IFN-γ)基因擴(kuò)增產(chǎn)物的密度與β-actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物的密度之比作為基因表達(dá)值。

4.ELISA檢測(cè)血清中的相關(guān)指標(biāo) 收集各組大鼠血清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟檢測(cè)SCr、BUN、IL-6、TNF-α、IFN-γ細(xì)胞因子在血清中表達(dá)水平。

表1 RT-PSCR引物序列

5.腎組織測(cè)定 黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)腎黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)過(guò)氧化氫酶(Cata-lase，CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性;用硫代巴比妥酸法檢測(cè)腎臟硫代巴比妥酸法檢測(cè)丙二醛(malonaldehyde, MDA)含量,具體操作參看說(shuō)明書(shū)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，資料采用單因素方差分析(ANOVA)，多個(gè)樣本之間的兩兩比較采用T檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、腎功能變化

與假手術(shù)組相比, 模型組血清SCr和BUN水平均明顯升高(P<0.05), 提示IRI可致大鼠腎功能?chē)?yán)重受損。與模型組相比, EGCG低、中、高劑量組血清SCr和BUN水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且隨著EGCG濃度的的升高，血清SCr和BUN水平是依次下降的，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示EGCG在10～40 mg/kg范圍內(nèi)，為大鼠腎臟提供最佳保護(hù)效果的濃度為40 mg/kg。(表2)

表2 EGCG預(yù)處理對(duì)腎缺血再灌注損傷的影響

注：與假手術(shù)組相比，aP<0.05；與模型組相比,bP<0.05

二、EGCG對(duì)各組腎組織病理結(jié)構(gòu)的影響

與假手術(shù)組相比，模型組腎小管上皮細(xì)胞明顯腫脹, 大量刷狀緣脫落，腎小管囊狀擴(kuò)張空泡變性和壞死,其損傷評(píng)分為(3±1)分，而假手術(shù)組為(0.3±0.2)分，提示IRI可導(dǎo)致腎臟病理結(jié)構(gòu)明顯改變。與模型組相比, EGCG高劑量組腎小管上皮細(xì)胞腫脹, 刷狀緣脫落，腎小管囊狀擴(kuò)張，空泡變性和壞死明顯減少，其損傷評(píng)分(2±0.5)分，與模型組相比明顯減輕(P<0.05)。結(jié)果提示，最佳濃度EGCG(40 mg/kg)預(yù)處理可明顯減輕腎臟病理結(jié)構(gòu)改變。(圖1)

三、EGCG對(duì)各組信號(hào)通路的影響

與假手術(shù)組相比，模型組Wnt、β-catenin、p53和p21表達(dá)明顯增高(P<0.05)。而EGCG高劑量組和模型組相比，Wnt、β-catenin、p53和p21表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(圖2)

四、EGCG對(duì)促炎癥細(xì)胞因子表達(dá)影響

與假手術(shù)組相比，模型組TNF-α, IFN-γ 和IL-6水平均明顯增高(P<0.05)；EGCG高劑量組與模型組相比, TNF-α, IFN-γ和 IL-6 表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)。(圖3)

五、EGCG對(duì)各組MDA含量的影響

TBA檢測(cè)顯示假手術(shù)組MDA含量(100±20) ng/L，模型組MDA含量(2 400±200) ng/L，2組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；EGCG高劑量組MDA含量(850±120) ng/L，與模型組相比，MDA含量明顯降低(P<0.05)。

六、EGCG對(duì)各組CAT、 GPx和SOD活性的影響。

與假手術(shù)組相比, 模型組CAT、GPx和SOD活性明顯降低(P<0.05)，但EGCG高劑量組與模型組相比，CAT、GPx和SOD的活性明顯增高(P<0.05) 。(圖4)。

圖1 PAS染色檢測(cè)EGCG對(duì)腎臟病理結(jié)構(gòu)的影響(4×100)

注:假手術(shù)組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;A為假手術(shù)組,B為模型組,C為EGCG高劑量組圖2 WB檢測(cè)EGCG預(yù)處理對(duì)Wnt,β-catenin,p53和p21蛋白表達(dá)的影響

注:假手術(shù)組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;A為假手術(shù)組,B為模型組,C為EGCG高劑量組圖3 EGCG對(duì)促炎癥細(xì)胞因子表達(dá)影響

討 論

IRI是器官或組織血供中斷，重新器官或組織血供，導(dǎo)致器官與組織損傷進(jìn)一步加重的臨床危象。腎臟作為高灌注血流器官之一，對(duì)缺血或缺血再灌注損傷尤其敏感。因此如何防治IRI是一個(gè)亟待解決的重大臨床問(wèn)題，既往研究IRI涉及炎癥、凋亡和氧化應(yīng)激等[1-3]。本研究結(jié)果顯示IRI可導(dǎo)致促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IFN-γ表達(dá)以及促氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA含量明顯增高，而抗氧化應(yīng)激產(chǎn)物CAT、GPx和SOD活性明顯降低，進(jìn)一步證實(shí)了炎癥和氧化應(yīng)激是IRI密切相關(guān)[1-3]，抑制炎癥和氧化應(yīng)激是減輕IRI的有效途徑。

注:假手術(shù)組相比,aP<0.05;與模型組,與EGCG組相比,bP<0.05;A為假手術(shù)組,B為模型組,C為EGCG高劑量組圖4 黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)EGCG對(duì)腎組織CAT,GPx和SOD活性影響

天然植物是一個(gè)巨大的藥學(xué)寶庫(kù)，尤其是表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗凋亡、抑制炎癥和清除氧自由基等多種生物學(xué)活性[7-9]，可通過(guò)抗凋亡減輕腎缺血再灌注損傷[10]，但對(duì)炎癥和氧化應(yīng)激是否有影響尚不清楚。本研究結(jié)果顯示EGCG預(yù)處理可明顯減少SCr、BUN、TNF-α、IL-6、IFN-γ和MDA的表達(dá)，增加CAT、GPx、SOD活性，以及明顯減少腎臟病理改變，這提示EGCG對(duì)腎臟IRI的保護(hù)作用與抑制炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)。

腫瘤抑制蛋白p53是一重要的信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，可介導(dǎo)炎癥、凋亡、氧化應(yīng)激等反應(yīng)，p21是其激活的定向靶向產(chǎn)物[11-12]，而p53蛋白的激活可受Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)節(jié)[13-14]。本研究結(jié)果顯示IRI可增加Wnt、β-catenin、p53、p21的表達(dá)，而EGCG預(yù)處理可明顯減少Wnt、β-catenin、p53、p21的表達(dá)。因既往有研究顯示抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路可減輕IRI[15]，因此本研究未用Wnt拮抗劑驗(yàn)證阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路能否減輕IRI，這將是接下來(lái)進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

綜上所述，EGCG可通過(guò)抗炎和抑制氧化應(yīng)激而減輕腎臟缺血再灌注損傷。其作用機(jī)制與抑制Wnt/β-catenin/p53 信號(hào)通路相關(guān)，但是否還有其他通路涉及其中，尚需進(jìn)一步研究。

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Protective effect of EGCG on renal ischemia-reperfusion injury

ZUOSong,ZHANGJiong.

DepartmentofNephrology,YibinFirstPeople’sHospital,Yibin644000,China

ZHANGJiong,E-mail: 774067870@qq.com

Objective To explore the protective effects of EGCG on renal ischemia-reperfusion injury (IRI) and the mechanism.Methods Male SD rats were randomly divided into Sham, IRI and EGCG (low, middle and high dose) groups. The model of IRI was induced by clamping the bilateralrenal pedicles for 45min and removing right kidney, successive reperfusion for 24 h. The levels of SCr, BUN, IFN-γ, TNF-αand IL-6 in the serum were examined by ELISA. The expression levels of Wnt, β-catenin, p53 and p21 were detected by Western blotting. The expression of MDA was measured by TBA. Moreover, the morphrologic changes of kidney and the activation of CAT, GPX and SOD in the kidney were measured by PAS and hydrogen peroxide enzyme, respectively.Results Compared to Sham group, the levels of SCr, BUN, IFN-γ, TNF-α, IL-6, Wnt, β-catenin, p53, p21 and MDA were significantly increased, the pathological changes of the kidney significantly aggravated and activities of CAT, GPx and SOD significantly reduced in the kidney in the IRI group. Compared to IRI group, the levels of SCr, BUN, IFN-γ, TNF-α, IL-6, Wnt, β-catenin, p53, p21 and MDA were significantly reduced, pathological changes of the kidney alleviated and activities of CAT, GPXand SOD in the kidney increased in the EGCG group.Conclusions EGCG preconditioning can reduce kidney IRI by suppressing inflammation and oxidative stress in rats, which may be associated with the inhibition of Wnt/β-catenin/p53 signal pathway activation.

Epigallocatechin gallate; Kidney ischemia reperfusion injury; Inflammation; Oxidative stress

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.04.010

國(guó)家自然科學(xué)基金資助(No.81500575)

644000 宜賓，宜賓市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科(左松)；610000 成都，四川省人民醫(yī)院腎內(nèi)科(張炯)

張炯，E-mail: 774067870@qq.com

2016-11-23

2017-02-05)