基于ISSR—PCR分子標(biāo)記的滑菇遺傳多樣性分析

李紅+張敏+肖千明++宋瑩++曹君

摘要：以遼寧省主栽的16個(gè)滑菇菌株為研究對(duì)象，應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)行了分析，從20條引物中篩選出9條多態(tài)性豐富、譜帶清晰且重復(fù)性好的引物進(jìn)行了ISSR-PCR擴(kuò)增。9條引物共擴(kuò)增出101條帶，其中多態(tài)性譜帶92條，多態(tài)位點(diǎn)百分率為91%。遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.59～0.90。在遺傳相似系數(shù)為0.69時(shí)，可將16個(gè)滑菇菌株劃為5大類(lèi)群，為今后滑菇的分類(lèi)鑒定及遺傳育種親本的選配提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：滑菇；ISSR；分子標(biāo)記；遺傳多樣性

中圖分類(lèi)號(hào)： S646.1+60.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）06-0039-03

滑菇（Pholiota nameko Ito et Imai）別稱(chēng)光帽鱗傘、光帽黃傘、滑子蘑、光滑環(huán)銹傘、光蓋環(huán)銹傘、光蓋庫(kù)恩菇、珍珠菇，是一種較為常見(jiàn)的低溫型食用菌，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和很強(qiáng)的藥理活性?；绞鞘澜缟衔宕笕斯ぴ耘嗟膬?yōu)質(zhì)食用菌之一。我國(guó)是滑菇的主要生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，產(chǎn)量居世界首位，每年大量對(duì)外出口，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)滑菇價(jià)格高于香菇和平菇等其他菌類(lèi)價(jià)格。目前滑菇栽培所用的菌株同名異物和同物異名現(xiàn)象嚴(yán)重，因此對(duì)滑菇菌株進(jìn)行有效的分類(lèi)和親緣關(guān)系鑒定是滑菇育種成功與否的首要因素。

ISSR是1994年由Zietkiewicz等創(chuàng)建的一種簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記，它是在SSR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，根據(jù)基因組廣泛存在SSR的特點(diǎn)，利用SSR本身設(shè)計(jì)引物，無(wú)需預(yù)先克隆和測(cè)序[1]。ISSR通常為顯性標(biāo)記，呈孟德?tīng)柺竭z傳，具有很好的穩(wěn)定性和多態(tài)性，DNA用量少、技術(shù)要求低、成本低廉、通用性好，已成功地運(yùn)用于居群生物學(xué)研究、菌株鑒定、物種的分類(lèi)系統(tǒng)學(xué)比較，并作為構(gòu)建遺傳圖譜的工具[2]。

在食用菌方面，ISSR技術(shù)較多用于種群內(nèi)、種群間、物種間的系統(tǒng)發(fā)育和遺傳多樣性研究。秦蓮花等利用ISSR標(biāo)記結(jié)合ITS分析，以豹皮香菇和虎皮香菇為外群，對(duì)12個(gè)香菇菌株進(jìn)行遺傳分析，結(jié)果認(rèn)為此方法是鑒別香菇菌株的良好方法[3]。王子迎等用13個(gè)ISSR引物對(duì)26個(gè)安徽野生香菇和6個(gè)栽培菌株進(jìn)行了遺傳多樣性分析，并根據(jù)ISSR分析選擇遺傳距離遠(yuǎn)近不同的親本進(jìn)行雜交，評(píng)價(jià)了其雜種優(yōu)勢(shì)[4]。馬志剛等基于重復(fù)序列（TATG），設(shè)計(jì)了7條引物，對(duì)側(cè)耳屬的22個(gè)菌株和1株雙抱蘑菇菌株的基因組DNA進(jìn)行ISSR分析，驗(yàn)證了重復(fù)序列（TATG）4在側(cè)耳屬中的存在[5]。Zhang等設(shè)計(jì)2個(gè)錨定ISSR引物，將17個(gè)香菇菌株很好地鑒別開(kāi)[6]。但在滑菇方面，尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。本研究應(yīng)用ISSR-PCR分子標(biāo)記的方法對(duì)滑菇菌株遺傳多樣性進(jìn)行分析，以期為滑菇的分類(lèi)鑒定及遺傳育種親本的選配提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試菌株

本研究以遼寧省主栽的16個(gè)滑菇菌株為研究對(duì)象（表1）。

1.2培養(yǎng)基

PDB綜合培養(yǎng)基用于總DNA提取的菌絲培養(yǎng)，配方：馬鈴薯400 g，葡萄糖40 g，磷酸二氫鉀6 g，硫酸鎂3 g，蛋白胨 6 g，水2 000 mL，pH值不需要調(diào)整。

1.3試劑和儀器

ISSR-PCR 反應(yīng)所用的Taq DNA Polymerase、dNTP、10×buffer、Mg2+購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛公司，DNA marker（DL5000）、引物購(gòu)自 TaKaRa （大連）有限公司。PCR 儀為德國(guó) Biometra 公司的 Thermocycler型。

1.4引物

本研究使用的20個(gè)引物見(jiàn)表2。

1.5菌絲體培

將活化的菌絲切下0.5 cm2菌塊，接種于PDB綜合培養(yǎng)基，23 ℃搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)數(shù)為150 r/min。將培養(yǎng)好的菌液，無(wú)菌水洗滌2次，汲干菌絲體表面的水分，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6總DNA提取及檢測(cè)

采用改良的CTAB法[7]提取基因組總DNA，0.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量。

1.7PCR反應(yīng)及電泳

引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的ISSR引物序列[8]，由TaKaRa 有限公司（大連）合成。

PCR反應(yīng)體系（20 μL）：模板DNA 200 ng/μL，dNTPs 200 μmol/L，引物0.75 μmol/L，Taq DNA聚合酶0.5 U，Mg2+ 2.5 mmol/L，10×buffer 2 μL，用ddH2O補(bǔ)至總體積20 μL。

擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性 30 s，45～55 ℃ 退火1 min（退火溫度因不同引物而定），72 ℃延伸 2 min，38個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠上電泳，用GelDoc-It型凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.8數(shù)據(jù)處理

電泳結(jié)果采取 0/1 賦值記帶，將在瓊脂糖凝膠上出現(xiàn)DNA片段的記為 1，不出現(xiàn)的記為 0，統(tǒng)計(jì)后輸入電腦，用聚類(lèi)分析軟件NTsys進(jìn)行聚類(lèi)分析，并計(jì)算遺傳相似度。

2結(jié)果與分析

2.1基因組DNA提取

16個(gè)滑菇菌株基因組DNA圖譜見(jiàn)圖1。

2.2引物篩選

從20 條ISSR引物中篩選出9條多態(tài)性豐富、譜帶清晰且重復(fù)性好的引物，對(duì)16個(gè)供試菌株進(jìn)行了ISSR-PCR擴(kuò)增。9條引物共擴(kuò)增出101條帶（圖2至圖5），其中多態(tài)性條帶為92條，多態(tài)位點(diǎn)百分率為91%。每條引物擴(kuò)增出大約11條帶，DNA片段大小為250～2 000 bp。

2.2基于ISSR分析結(jié)果構(gòu)建樹(shù)狀圖

16個(gè)菌株間的遺傳相似系數(shù)變化范圍在 0.59～0.90之間。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為 0.69時(shí)，供試菌株被聚類(lèi)成5個(gè)類(lèi)群：第1類(lèi)為早壯、N109；第2類(lèi)為N103、 N108、延滑；第3類(lèi)

為丹9、申14、C31、西羽、EH、曲新、D工羽3、HSH，其中丹9和申14親緣關(guān)系最近，遺傳相似系數(shù)達(dá)到0.9；第4類(lèi)為112、遼滑1；第5類(lèi)為華3，與其他菌株親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳距離為0.59（圖6）。

3結(jié)論與討論

選擇雜交親本是食用菌雜交育種中最為重要的環(huán)節(jié)之一。一直以來(lái)，育種工作者都是通過(guò)表型分析的DUS（distinctness，uniformity and stability，簡(jiǎn)稱(chēng)DUS）測(cè)試來(lái)鑒定和選擇親本。這種方法耗時(shí)費(fèi)力，鑒定結(jié)果也易受環(huán)境的干擾。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在分子水平上進(jìn)行親本菌株的選擇勢(shì)在必行。目前，關(guān)于滑菇分類(lèi)鑒定多局限于傳統(tǒng)分類(lèi)法和同工酶分析研究[9]，應(yīng)用分子標(biāo)記鑒定的研究報(bào)道較少。

本研究應(yīng)用ISSR-PCR分子標(biāo)記的方法對(duì)滑菇菌株遺傳多樣性進(jìn)行了分析，從20條引物中篩選出9條多態(tài)性豐富、譜帶清晰且重復(fù)性好的引物進(jìn)行了ISSR-PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示9條引物均能將供試菌株區(qū)分開(kāi)，表明ISSR分子標(biāo)記對(duì)滑菇菌株遺傳多樣性分析是可行的。16個(gè)滑菇菌株遺傳相似性較高，遺傳背景比較一致，部分品種間親緣關(guān)系較近，可能與來(lái)源同一地區(qū)有關(guān)。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.009