葛根芩連湯中小檗堿的中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)屬性研究

劉洋+朱美玲+孫慧娟+王子禹+陳江鵬+董月柳+董玲

[摘要] 中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)（CMMBCS）的頂層研究之一是中藥復(fù)方對(duì)單一成分的影響研究，除單成分自身溶解性和滲透性外，需結(jié)合復(fù)方中多成分環(huán)境下其溶解性和滲透性各自提升度來進(jìn)行分類。該文主要是研究葛根芩連復(fù)方中小檗堿的CMMBCS分類屬性的變化，即小檗堿在葛根芩連湯中的溶解性和滲透性，考察其在整個(gè)復(fù)方環(huán)境中的變化及分類。采用經(jīng)典搖瓶法和高效液相色譜法測(cè)定其在復(fù)方中的溶解度變化，并采用大鼠離體外翻腸囊實(shí)驗(yàn)進(jìn)行小檗堿腸吸收定性，采用在體單向灌流法進(jìn)行小檗堿腸吸收定量研究，同時(shí)和腸道血管并行采血實(shí)驗(yàn)進(jìn)行吸收入血的定性和定量研究。

[關(guān)鍵詞] 葛根芩連湯；小檗堿；溶解性；腸滲透性；中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)

Biopharmaceutics classification system of Chinese materia

medica of berberine in Gegen Qinlian decoction

LIU Yang，ZHU Mei-ling，SUN Hui-juan，WANG Zi-yu，CHEN Jiang-peng，DONG Yue-liu，DONG Ling*

（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

[Abstract] One of the top-level researches of biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica （CMMBCS） is the study on single component in compound Chinese medicine. The medicines shall be classified according to its solubility and intestinal permeability， as well as the ascending degree in multicomponent environment. Based on above， we chose berberine as the main object to explore the change rules of its solubility and intestinal permeability in Gegen Qinlian decoction. Shaking flask-HPLC was used to detect the solubility changes of berberine in compounds. The qualitative investigation of berberine in intestinal absorption was measured by everted gut sac， and the quantitative research of berberine in intestinal absorption was measured by single-pass intestinal perfusion experiment， while the qualitative and quantitative research of berberine absorption into blood was measured by in intestinal perfusion with venous sampling experiment.

[Key words] Gegen Qinlian decoction；berberine；solubility；intestinalpermeability；CMMBCS

口服藥物的水溶解性及腸滲透性，是判斷其胃腸道吸收效果的2個(gè)重要參數(shù)，也是生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)（BCS）對(duì)藥物進(jìn)行屬性分類的依據(jù)[1-2]。藥物的 BCS 屬性部分決定了這個(gè)藥物在用藥機(jī)體中吸收程度，對(duì)評(píng)價(jià)藥物的吸收至關(guān)重要，不僅對(duì)已上市藥品的生物利用度-吸收關(guān)聯(lián)分析提供了科學(xué)框架，更為新藥的開發(fā)提供理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支撐。鑒于FDA，EMA及WHO將生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)引入到指導(dǎo)原則中進(jìn)行藥物生物等效性豁免的評(píng)價(jià)研究，其科學(xué)性與適應(yīng)性近幾年在不斷地得到印證。目前BCS在不斷地完善和發(fā)展，也衍生出了其他以不同側(cè)重點(diǎn)進(jìn)行分類研究的分類系統(tǒng)[3-5]。但BCS針對(duì)的是單一成分的化學(xué)藥品，在中藥相關(guān)領(lǐng)域的研究甚少。然中藥與化藥口服吸收的本質(zhì)和核心是一致的，結(jié)合中藥自身特點(diǎn)與生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)，本課題組創(chuàng)新性地提出了中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)（CMMBCS）[6]。并且基于“多成分層次差異比較法”的指導(dǎo)，從單一成分到多成分到整個(gè)中藥整體進(jìn)行研究[7-11]。本文在之前研究的基礎(chǔ)上，以葛根芩連湯中的小檗堿為主要研究對(duì)象，深入到研究單一成分在中藥復(fù)方環(huán)境下的BCS屬性變化規(guī)律。從而進(jìn)一步豐富中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)的整體研究，并為其之后的發(fā)展提供數(shù)據(jù)及研究成果的參考及支持。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（SPD-20A型紫外檢測(cè)器，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，日本島津公司）；BT-25S電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；DZKW-4電熱恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；KH7200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；STARTER2100實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（奧豪斯儀器上海有限公司）；蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)器（BT100-1F，保定蘭格恒流泵有限公司）；注射泵（LSP02-1B，保定蘭格恒流泵有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（SIGMA，德國）。

1.2 藥物與試劑

鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)110713-201212，中國食品藥品檢定研究院）；鹽酸小檗堿原料（批號(hào)130808，陜西中鑫生物技術(shù)有限公司）；葛根素對(duì)照品（批號(hào)110752-201313，中國食品藥品檢定研究院）；黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)110715-201318，中國食品藥品檢定研究院）；甘草酸銨對(duì)照品（批號(hào)110731-201317，中國食品藥品檢定研究院）；乙腈（色譜級(jí)，美國Fisher公司）；葛根、黃連、黃芩、炙甘草藥材均購于北京同仁堂，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王晶娟副教授鑒定為豆科植物野葛Pueraria lobata （Willd.）Ohwi的干燥根、毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.的干燥根莖、唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根及甘草的炮制加工品。磷酸、鹽酸、枸櫞酸、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、三乙胺、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀 （AR，北京化工廠）；純凈水（娃哈哈集團(tuán)公司）。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠，雄性，體重200～250 g，北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（京）2014-0004。

2 方法

2.1 供試液的配制

2.1.1 小檗堿對(duì)照品儲(chǔ)備液 精密量取小檗堿對(duì)照品溶液用甲醇稀釋至刻度，制備濃度為1.0 g·L-1的小檗堿對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.2 葛根芩連湯 取適量葛根-黃芩-黃連-炙甘草（8∶3∶3∶2）加10倍量水，浸泡30 min，煎煮保持微沸30 min，趁熱濾過，藥渣加入8倍量的水煎煮保持微沸30 min，趁熱濾過，合并2次濾液，濃縮并冷至室溫，加水定容得葛根芩連湯。

2.1.3 Krebs-Ringer′s營(yíng)養(yǎng)液（K-R液） 稱取NaCl 7.80 g，KCl 0.35 g，CaCl2 0.37 g，NaHCO3 1.37 g，NaH2PO4 0.32 g，MgCl2 0.02 g，葡萄糖1.40 g；加蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH到7.39～7.41，放置備用。

2.1.4 灌流液制備 取葛根芩連湯用K-R液稀釋至生藥質(zhì)量濃度為40，160，240 g·L-1灌流液。

2.1.5 pH 7.4緩沖液 取磷酸二氫鉀6.81 g，加0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液395 mL稀釋至1 000 mL，即得。

2.2 葛根芩連湯中小檗堿含量測(cè)定方法

2.2.1 色譜條件 Luna C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm，Phenomenex，USA）；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相乙腈（A）-水（B，含0.4%磷酸，0.8%三乙胺），梯度洗脫（0～11 min，13%A；11～12 min，13%～17%A；12～17 min，17%A；17～26 min，17%～24%A；26～38.5 min，24%～29%A；38.5～45 min，29%～32%A；45～65 min，32%～68%A；65～75 min，68%～13%A）。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密量取小檗堿對(duì)照品貯備液（1.0 g·L-1）制備質(zhì)量濃度分別為0.200 4，0.400 8，2.004，10.02，20.04，40.08，80.16，120.24 mg·L-1的對(duì)照品溶液，精密取上述對(duì)照品溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，以藥物濃度C（mg·L-1）為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 取葛根芩連供試品溶液，重復(fù)6次進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 配置葛根芩連供試品溶液6份，分別精密吸取上述溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算RSD，考察方法的重現(xiàn)性。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取葛根芩連供試品溶液，分別于0，2，6，12，24 h取樣檢測(cè)，進(jìn)樣量20 μL，記錄峰面積。

2.2.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知小檗堿濃度的葛根芩連供試品溶液，加入小檗堿對(duì)照品，HPLC測(cè)指標(biāo)成分的含量，測(cè)加樣回收率。

2.3 葛根芩連湯中小檗堿溶解度的測(cè)定

按2.1葛根芩連湯制備方法制備生藥濃度分別為20，40，160，240 g·L-1的葛根芩連湯，并且調(diào)溶液pH至7.4，向其中加入過量的小檗堿，（37±1）℃水溶加熱，同時(shí)振搖至不再溶解得到飽和溶液。室溫下靜置，微孔濾膜過濾，得續(xù)濾，用相應(yīng)緩沖溶液稀釋到一定濃度。高效液相色譜法測(cè)定其平衡溶解度。

2.4 葛根芩連湯中小檗堿滲透性的研究

2.4.1 離體翻轉(zhuǎn)腸囊法腸滲透定性研究 大鼠禁食不禁水12～18 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，打開腹腔，分別迅速取出約（10±2） cm 長(zhǎng)十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸段。小心剝離腸周圍脂肪及腸系膜，用37 ℃生理鹽水將腸段沖洗干凈。將腸段翻轉(zhuǎn)，使黏膜層在外，漿膜層在內(nèi)，線結(jié)扎腸段。腸囊中注入2 mL空白Krebs-Ringer′s腸營(yíng)養(yǎng)液。將其移入已有Krebs-Ringer′s 腸營(yíng)養(yǎng)液的錐形瓶中平衡10 min后將腸囊置于盛有30 mL藥液中，置于水浴鍋中37 ℃保溫，為保持離體腸管的活性，向錐形瓶中持續(xù)通氧及二氧化碳混合氣體。60 min后取出腸囊內(nèi)液體并測(cè)量腸段長(zhǎng)度及內(nèi)徑，0.45 μm微孔濾膜過濾，高效液相進(jìn)行檢測(cè)。

2.4.2 在體單向腸灌流腸滲透定量研究 大鼠禁食不禁水18 h，稱重，10%水合氯醛麻醉，沿腹中線剪開腹部3～4 cm，分離實(shí)驗(yàn)用腸段，各腸段取約10 cm，腸段進(jìn)口端與注射泵相連，用預(yù)熱至37 ℃的生理鹽水以5 mL·min-1的速度對(duì)所取腸道進(jìn)行沖洗。流速調(diào)為0.2 mL·min-1灌流藥液，約30 min后吸收達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。開始計(jì)時(shí)，用已知質(zhì)量的小瓶在出口處每隔15 min收集1次，計(jì)算收集前后小瓶質(zhì)量稱量差，同時(shí)測(cè)定收集液的密度，以此方法對(duì)灌流液的體積校正。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠并剪下被灌流的腸段，測(cè)量其長(zhǎng)度和內(nèi)徑。按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定不同時(shí)間段流出藥液中鹽酸小檗堿含量。

2.4.3 腸道灌流并行采血法腸滲透定性和定量研究 大鼠禁食不禁水18 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，右側(cè)頸靜脈插管連接到蠕動(dòng)泵進(jìn)行供血。打開腹部，選取腸段，用37 ℃的生理鹽水沖洗干凈，結(jié)扎實(shí)驗(yàn)用腸段以外的血管。對(duì)所取灌流腸段對(duì)應(yīng)的腸系膜靜脈插管，并連接到蠕動(dòng)泵，收集腸系膜靜脈流出血液。腸段進(jìn)口端與注射泵相連，將注射泵流速調(diào)為0.2 mL·min-1，灌流藥液，約30 min后吸收達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。開始計(jì)時(shí)收集流出的藥液和血液。每隔15 min更換腸液和血液的收集管。采用質(zhì)量法進(jìn)行水分校正。試驗(yàn)結(jié)束后，用生理鹽水沖洗腸段，將所用腸段剪下，測(cè)量其長(zhǎng)度和內(nèi)徑，并處死大鼠。所取血液樣品3 500 r·min-1離心15 min，取上層血漿，加入3倍量的甲醇沉淀蛋白，渦旋2 min，1萬 r·min-1離心15 min，取上清液定容至5 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液注入高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)；灌流液樣品經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾，注入高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.4.4 數(shù)據(jù)分析[12] 翻轉(zhuǎn)腸囊法腸滲透性的表觀吸收系數(shù)Papp計(jì)算如下。

Papp=ΔQ/Δt2πrL·C0

其中，C0為小檗堿初始濃度（mg·L-1）；ΔQ/Δt為60 min內(nèi)腸囊內(nèi)溶液中小檗堿的量（μg·s-1）；L為腸段長(zhǎng)度（cm）；r為腸半徑（cm）。

在體大鼠單向灌流中采用質(zhì)量法校正水分吸收，計(jì)算有效滲透系數(shù)Peff、腸吸收速率常數(shù)Ka和腸吸收分?jǐn)?shù)Fa，如下。

Peff=-Qin·ln（Cout（cor）/Cin）2πrL

Ka=（1-Cout（cor）Cin）QinV

Fa=（1-Cout（cor）Cin）×100%

Cout（cor）=CoutQoutQin

Cout=Mout/Doutt

其中，Qin為灌流液流速（mL·min-1），L為灌流腸段長(zhǎng)度（cm）；r為灌流腸段半徑（cm）；Cin為灌流液中鹽酸小檗堿初始質(zhì)量濃度（mg·L-1）；Cout（cor）為經(jīng)質(zhì)量法校正后的灌流收集液中鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度（mg·L-1）；V=πr2L為灌流腸道體積（mL）；Qout為通過灌流液流出的速度（mL·min-1）；Cout為灌流收集液中鹽酸小檗堿濃度（mg·L-1）；Mout為灌流收集液質(zhì)量（g），Dout為灌流收集液密度（g·mL-1），t為取樣周期（min）。

腸道灌流并行采血實(shí)驗(yàn)采用質(zhì)量法校正水分吸收，計(jì)算有效滲透系數(shù)Pblood。

Pblood=ΔMB/Δt2πrLC

C=Cout（cor）-C0ln（Cout（cor）/C0）

其中，ΔMB/Δt是血液樣品中鹽酸小檗堿物質(zhì)的量（μg·s-1）；C是灌流腸段內(nèi)鹽酸小檗堿對(duì)數(shù)平均濃度（mg·L-1）；L是灌流腸段長(zhǎng)度（cm）；r是灌流腸段半徑（cm）；Cout（cor）是鹽酸小檗堿校正后灌流收集液濃度（mg·L-1），C0是鹽酸小檗堿初始灌流液濃度（mg·L-1）。

3 結(jié)果

3.1 藥物濃度的測(cè)定

鹽酸小檗堿的線性回歸方程為Y=95 717X-8 552.9，R2=0.999 1，結(jié)果表明，小檗堿在0.200 4～120.24 mg·L-1線性關(guān)系良好。本方法測(cè)定的精密度及穩(wěn)定性RSD均小于1.0%。加樣回收率99.90%～102.5%，RSD均小于5.0%。

3.2 小檗堿的溶解度

測(cè)定不同生藥濃度葛根芩連湯中小檗堿的溶解度數(shù)據(jù)，結(jié)果見表1。

由結(jié)果可知，小檗堿在不同生藥濃度葛根芩連湯中溶解度略有不同，D0計(jì)算結(jié)果在0.77～0.89，均小于1。但相對(duì)于小檗堿單一成分的溶解度而言（D0>1）[11]，在不同生物濃度復(fù)方環(huán)境下，小檗堿溶解度卻由低溶解度提升為高溶解度藥物，這表明小檗堿在不同濃度的復(fù)方環(huán)境下的溶解度對(duì)小檗堿在機(jī)體中的吸收不會(huì)產(chǎn)生影響[13]。

3.3 小檗堿的滲透性

3.3.1 離體翻轉(zhuǎn)腸囊法結(jié)果 葛根芩連湯翻轉(zhuǎn)腸囊實(shí)驗(yàn)中腸囊中樣品測(cè)定結(jié)果見圖1，表明葛根芩連湯中小檗堿能夠透過小腸壁吸收。

1.小檗堿（圖2同）；A. 對(duì)照品；B. 葛根芩連湯翻轉(zhuǎn)腸囊樣品；C. 葛根芩連湯K-R液樣品。

圖1 葛根芩連湯HPLC圖

Fig.1 HPLC chromatograms of Gegen Qinlian decoction

3.3.2 在體單向腸灌流結(jié)果 不同濃度葛根芩連湯中小檗堿在體單向腸灌流的結(jié)果見表2。

結(jié)果顯示葛根芩連湯中小檗堿的滲透性隨著生藥濃度的增加而增大，且與小檗堿（80 mg·L-1）黃連水煎液中小檗堿濃度相當(dāng)時(shí)[11]，葛根芩連湯（160 g·L-1）的滲透性較黃連單個(gè)藥材以及小檗堿單一成分都較大。

3.3.3 腸道灌流并行采血法結(jié)果 葛根芩連湯雙灌流（代指大鼠腸道灌流并行采血實(shí)驗(yàn)）吸收入血圖譜見圖2，表明小檗堿能經(jīng)過小腸吸收進(jìn)入血液。

3種不同生藥濃度黃連水煎液雙灌流定量結(jié)果見表3。

結(jié)果顯示葛根芩連湯中小檗堿能通過小腸吸收進(jìn)入血液，小檗堿吸收入血的滲透性隨著生藥濃度的增加而增大，且與小檗堿（80 mg·L-1）黃連水煎液中小檗堿濃度相當(dāng)時(shí)[11]，葛根芩連湯（160 g·L-1）入血的滲透性增大顯著，發(fā)生了數(shù)量級(jí)的變化。

4 討論

從之前的研究結(jié)果可知[11]，小檗堿單一成分的溶解性和滲透性均較低，為BCS第IV類藥物，依據(jù)CMMBCS分類標(biāo)準(zhǔn)，初步定為CMMBCS-IV類，雖然黃連水煎液中小檗堿溶解性和滲透性有所改變，但提升不顯著，初步定為自身溶解性和滲透性差且在單個(gè)藥材環(huán)境下提升不顯著的CMMBCS-IV類。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，葛根芩連湯中小檗堿的生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)的屬性溶解性和滲透性相比較于單一小檗堿和黃連水煎液中的小檗堿都有不同。由溶解度實(shí)驗(yàn)可知小檗堿在葛根芩連湯中的溶解度較單一成分及單個(gè)藥材更大，有質(zhì)的提升，根據(jù)FDA指導(dǎo)原則[13]，葛根芩連湯中的小檗堿為高溶解度藥物。由翻轉(zhuǎn)腸囊定性實(shí)驗(yàn)可以定性看出葛根芩連湯中小檗堿可以透過腸壁吸收。在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示葛根芩連湯中的小檗堿隨著生藥濃度的增加吸收速率增大，表明其存在被動(dòng)擴(kuò)散。與單一小檗堿（80 mg·L-1）滲透性相比，葛根芩連湯（40 g·L-1）環(huán)境下的小檗堿的滲透性有顯著性差異，且葛根芩連湯（160，240 g·L-1）環(huán)境下的小檗堿的滲透性差異極顯著。小檗堿在葛根芩連湯（160，240 g·L-1）環(huán)境下的有效滲透系數(shù)大于0.2×10-4 cm·s-1，這表明小檗堿在此濃度的復(fù)方環(huán)境下由難吸收藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橐子谖盏乃幬铩Ｔ谛￠迚A濃度相當(dāng)時(shí)，小檗堿在葛根芩連湯（160 g·L-1）、黃連水煎液（3 g·L-1）、小檗堿（80 mg·L-1）下的吸收不同，小檗堿在復(fù)方中的吸收>單一藥材>單一成分，也闡釋了復(fù)方用藥的合理性。且在葛根芩連湯中小檗堿的腸吸收的滲透系數(shù)和吸收入血的滲透系數(shù)比較于單一藥材和單一成分提高了很多，表明了葛根芩連湯復(fù)方環(huán)境能夠明顯促進(jìn)小檗堿的吸收?？紤]到小檗堿在葛根芩連湯中溶解度有質(zhì)的提升，滲透性雖提升顯著，但并未達(dá)到藥物高滲透性的標(biāo)準(zhǔn)。因此，在葛根芩連湯中，小檗堿屬自身溶解性差并且在復(fù)方環(huán)境下提升較好和滲透性差但在復(fù)方環(huán)境下提升良好的CMMBCS-Ⅲ類。

對(duì)于中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)，研究多成分環(huán)境對(duì)成分自身溶解性和滲透性的影響是其的主要特點(diǎn)。所以，CMMBCS的研究所用溶解性和滲透性數(shù)據(jù)必須是在多成分環(huán)境下測(cè)定的數(shù)據(jù)。其立論依據(jù)是，多成分環(huán)境可能改變中藥中某些成分自身原來固有溶解性和滲透性，進(jìn)而改變中藥整體乃至復(fù)方的生物藥劑學(xué)屬性。但對(duì)中藥及復(fù)方而言，化學(xué)成分眾多，成分之間還會(huì)發(fā)生復(fù)雜的反應(yīng)，且很多成分的藥理藥效機(jī)制并未十分清楚，研究困難較大。本文基于CMMBCS進(jìn)行了初步的探索，為今后中藥多成分及復(fù)方的研究提供參考依據(jù)。

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[責(zé)任編輯 孔晶晶]