基于P—糖蛋白的腸吸收在體單向腸灌流模型驗(yàn)證

董月柳+劉洋+尹秀文+潘孟+李雪蓮+王子禹+董玲

[摘要] 對(duì)基于P-糖蛋白（P-gp）腸吸收單灌流模型進(jìn)行驗(yàn)證。首先，通過(guò)酚紅灌流，采用質(zhì)量法進(jìn)行水分校正，通過(guò)高效液相色譜法對(duì)灌流前后酚紅水平進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證腸上皮細(xì)胞的緊密連接結(jié)構(gòu)正常，且腸上皮的完整性保持良好；其次，采用FDA指定陽(yáng)性藥地高辛對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，給予大鼠不同質(zhì)量濃度維拉帕米后，對(duì)大鼠回腸段地高辛吸收參數(shù)進(jìn)行觀察對(duì)比。酚紅在大鼠體內(nèi)回腸段存在吸收，吸收參數(shù)有效滲透系數(shù)Peff為（1.09±0.62）×10-6 cm·s-1，結(jié)果表明腸上皮細(xì)胞的緊密連接結(jié)構(gòu)正常，且腸上皮的完整性保持良好，地高辛灌流不給予維拉帕米時(shí)，地高辛在回腸段存在一定程度的吸收，吸收參數(shù)有效滲透系數(shù)Peff為（1.07±0.59）×10-5 cm·s-1，給予大鼠0.01，0.1 mmol·L-1濃度的維拉帕米后，地高辛在大鼠回腸的吸收呈上升趨勢(shì)，吸收參數(shù)有效滲透系數(shù)Peff分別為（1.58±0.69）×10-5，（3.28±0.95）×10-5 cm·s-1，高濃度時(shí)，數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。地高辛灌流實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了小腸上皮P-gp表達(dá)完整，可以用于P-gp外排轉(zhuǎn)運(yùn)體的研究。

[關(guān)鍵詞] 在體單向腸灌流模型；酚紅；地高辛；P-gp

Validation of in situ single pass perfusion model based on P-gp

DONG Yue-liu， LIU Yang， YIN Xiu-wen， PAN Meng， LI Xue-lian， WANG Zi-yu， DONG Ling*

（Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract] To validate in situ rats intestinal single pass perfusion model based on P-glycoprotein （P-gp）. Firstly， phenol red perfusion was carried out to verify the close connection structure of intestinal epithelial cells， and the integrity of the intestinal epithelium， with a gravimetric method for correcting water flux. The level of phenol red was determined by high performance liquid chromatography （HPLC） both before and after perfusion. Secondly， the positive drug digoxin specified by FDA was used to validate the model. After different mass concentrations of verapamil were given in the rats， the absorption parameters of digoxin in ileum of rats were observed and compared. The results showed that the phenol red was absorbed in rats ileum segment， with an effective permeability coefficient of （1.09±0.62）×10-6 cm·s-1. The experiment results indicated that the close connection structure of intestinal epithelial cells was normal， and the integrity of the intestinal epithelium was maintained well. In digoxin perfusion experiment， in case no verapamil was given， digoxin showed certain degree of absorption in rat ileum， with an effective permeability coefficient （Peff） of （1.07±0.59）×10-5 cm·s-1； after mass concentrations of 0.01，0.1 mmol·L-1 verapamil were given， the absorption of digoxin was on the rise in rat ileum， with an effective permeability coefficient Peff of （1.58±0.69）×10-5， （3.28±0.95）×10-5 cm·s-1 respectively （P<0.05）. Digoxin perfusion experiment verified that P-gp expression in small intestine epithelium was intact and can be used in the research of P-gp efflux transporter.

[Key words] in situ rat intestinal perfusion； phenol red； digoxin； P-gp

口服是用藥方式最常見(jiàn)的，因?yàn)樗哂蟹奖?、安全、低成本和患者依從性的特點(diǎn)[1]。口服吸收取決于藥物從劑型中釋放和在腸膜的滲透，所以藥物的溶解和滲透過(guò)程是藥物吸收最基本的條件[2]?；诖死碚摚珹midon等[3]提出了生物藥劑學(xué)分類(lèi)系統(tǒng)（biopharmaceutics classification system，BCS），根據(jù)藥物的溶解度和滲透性高低將藥物分為四類(lèi)。2000年美國(guó) FDA頒布BCS作為1種科學(xué)方法用于速釋固體口服劑型Ⅰ類(lèi)（高溶解度和高滲透性）的體內(nèi)生物利用度豁免和生物等效性試驗(yàn)[4]，以此科學(xué)框架制訂了藥品生物等效豁免的相關(guān)技術(shù)要求，即對(duì)于BCSⅠ類(lèi)的藥品上市后的變更、仿制給予免除生物等效性研究的支持。隨著B(niǎo)CS的不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)已上市藥品生物利用度的認(rèn)識(shí)具有重要價(jià)值，從而繼續(xù)前移到藥品開(kāi)發(fā)甚至前體藥物篩選，將BCS推至口服藥物成藥性論證的核心地位，通過(guò)制劑手段改變藥物的BCS分類(lèi)也成為生物藥劑學(xué)研究和新劑型研究的重要目標(biāo)之一。BCS是基于化學(xué)藥物提出來(lái)的，而中藥具有多成分的特點(diǎn)，這就決定了研究中藥的滲透性和溶解度時(shí)要考慮它所處的多成分環(huán)境，因此本課題組借鑒化學(xué)藥物BCS的優(yōu)勢(shì)結(jié)合中藥多成分的特點(diǎn)，提出了中藥生物藥劑學(xué)分類(lèi)系統(tǒng)[5]，課題組前期通過(guò)單成分到兩成分再到多成分配伍逐漸遞增的思路對(duì)葛根芩連方中的高含量成分葛根素和小檗堿在多成分環(huán)境中的滲透性和溶解度進(jìn)行研究，研究結(jié)果顯示，成分與成分之間存在相互作用[6-8]，這種相互作用引起藥物的腸滲透性的改變。藥物的主要吸收部位是小腸，藥物在小腸吸收的同時(shí)發(fā)生著多種過(guò)程[9]，在人體中低滲透的藥物可能是膜上的外排轉(zhuǎn)運(yùn)體將藥物外排引起的，例如P-gp。研究滲透性的模型，美國(guó)FDA推薦使用動(dòng)物的體內(nèi)、在體灌流模型或體外模型（切除的腸組織或者合適的上皮細(xì)胞單層膜）[10-11]，通常使用Caco-2細(xì)胞模型。然而當(dāng)外排蛋白在研究模型上存在缺陷或者表達(dá)的程度低于人體時(shí)，存在外排轉(zhuǎn)運(yùn)的藥物比被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的藥物更容易出現(xiàn)錯(cuò)誤的滲透性分類(lèi)[12]，相關(guān)研究結(jié)果也顯示，F(xiàn)DA中BCS的指導(dǎo)原則中體外細(xì)胞滲透模型不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)藥物在人體的吸收程度[13-14]，所以選擇合適的模型研究藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制至關(guān)重要。本課題通過(guò)酚紅和地高辛灌流實(shí)驗(yàn)分別對(duì)與人體相似性大的在體單向腸灌流模型的腸上皮細(xì)胞的緊密連接結(jié)構(gòu)以及P-gp表達(dá)完整性進(jìn)行驗(yàn)證，有利于更好地為藥物進(jìn)行正確的BCS分類(lèi)提供條件。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（SPD-20A型紫外檢測(cè)器，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，日本島津公司）；BT-25S電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；DZKW-4電熱恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；KH7200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；STARTER2100實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（奧豪斯儀器上海有限公司）。

1.2 試劑與藥品

酚紅對(duì)照品（批號(hào)P0882-25G，上海百賽生物技術(shù)有限公司），地高辛對(duì)照品（批號(hào)20140316，南通飛宇生物科技有限公司），乙腈（色譜級(jí)，美國(guó)Fisher公司），娃哈哈純凈水購(gòu)買(mǎi)于娃哈哈集團(tuán)公司（中國(guó)杭州），其他試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠，雄性，體重200～220 g，斯貝福（北京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào) SCXK（京）2011-0004。

2 方法

2.1 供試液的配制

2.1.1 Krebs-Ringer′s營(yíng)養(yǎng)液（K-R液）配制

稱(chēng)取NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，CaCl2 0.37 g，NaHCO3 1.37 g，NaH2PO4 0.32 g，MgCl2 0.02 g，葡萄糖1.4 g，加去離子水定容至1 000 mL，即得，加入NaHCO3，調(diào)節(jié)pH為7.4。

2.1.2 酚紅對(duì)照品儲(chǔ)備液制備

精密稱(chēng)定酚紅0.1 g置于50 mL量瓶中，用K-R液定容，得2 g·L-1的酚紅母液。

2.1.3 酚紅灌流液制備

取2.0 mL母液置于200 mL量瓶中，K-R液稀釋并定容得20 mg·L-1的酚紅溶液。

2.1.4 地高辛母液制備

精密稱(chēng)定地高辛對(duì)照品5 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，得100 mg·L-1的地高辛母液。

2.1.5 地高辛灌流液制備

取地高辛母液5 mL，置于100 mL量瓶中，用K-R液定容，得5 mg·L-1的地高辛灌流液。

2.2 含量測(cè)定方法

2.2.1 酚紅含量測(cè)定方法

2.2.1.1 酚紅色譜條件 GEMINI C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，Phenomenex），流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流動(dòng)相0.1%磷酸（A）-乙腈（B）（68∶32），等度洗脫。

2.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密吸取酚紅對(duì)照品儲(chǔ)備液，以適量的K-R 緩沖液 （pH 7.4） 將其分別稀釋為2.5，5，10，20，40，80 mg·L-1，進(jìn)樣20 μL，以質(zhì)量濃度（X，mg·L-1），對(duì)峰面積 （Y） 進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

2.2.1.3 回收率 用空白腸灌流液配制低、中、高 （2.5，20，80 mg·L-1） 3個(gè)濃度的酚紅溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，考察酚紅的回收率。

2.2.1.4 精密度 取酚紅對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定酚紅峰面積。

2.2.1.5 重復(fù)性 取低、中、高3個(gè)對(duì)照品濃度依次進(jìn)樣3次，測(cè)定酚紅峰面積。

2.2.1.6 穩(wěn)定性 取酚紅供試品高、中、低3個(gè)濃度，將供試品溶液置于37 ℃的水浴中3 h，按上述液相色譜條件測(cè)定峰面積。

2.2.2 地高辛含量測(cè)定

2.2.2.1 地高辛色譜條件 GEMINI C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，Phenomenex），流動(dòng)相1% 冰醋酸（A）-乙腈（B）（68∶32），等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密吸取地高辛對(duì)照品貯備液5 mL置于10 mL量瓶中，加入5 mL K-R 液，將其分別稀釋為質(zhì)量濃度為3.125，6.25，12.5，25，50 mg·L-1系列溶液。以地高辛濃度（X） 對(duì)峰面積（Y） 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸。

2.2.2.3 回收率 用空白腸灌流液配制低、中、高 （2.5，20，80 mg·L-1） 3個(gè)濃度的地高辛溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，考察地高辛的回收率。

2.2.2.4 重復(fù)性 取低、中、高3個(gè)對(duì)照品濃度依次進(jìn)樣3次，測(cè)定地高辛峰面積。

2.2.2.5 精密度 取地高辛對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定地高辛峰面積。

2.2.2.6 穩(wěn)定性 取地高辛母液1 mL置于20 mL量瓶中，K-R液稀釋并定容得5 mg·L-1的灌流液，將灌流液置于37 ℃的水浴中3 h，按上述液相色譜條件測(cè)定峰面積。

2.3 大鼠在體腸吸收試驗(yàn)

大鼠禁食不禁水18 h，水合氯醛麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)，沿腹中線剪開(kāi)腹部3～4 cm，找到實(shí)驗(yàn)用腸段（十二指腸段自幽門(mén)1 cm處開(kāi)始，空腸段自幽門(mén)15 cm處開(kāi)始，回腸段自盲腸上行20 cm處開(kāi)始，小腸自幽門(mén)1 cm 處開(kāi)始至盲腸前端結(jié)束，結(jié)腸段從盲腸后端開(kāi)始）取10 cm，在所取腸段兩端剪一小口，插入塑料管，用絲線固定。生理鹽水沖洗腸內(nèi)容物，在腸端連接注射泵以0.5 mL·min-1 灌流藥液，約30 min吸收穩(wěn)定后，開(kāi)始計(jì)時(shí)，用已知質(zhì)量的小瓶在出口處每隔15 min收集1次，作為1個(gè)取樣點(diǎn)，同時(shí)用下1個(gè)已知質(zhì)量的小瓶替換，收集8次后完畢，計(jì)算收集前后小瓶質(zhì)量稱(chēng)量差，測(cè)定收集液中藥物濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，用生理鹽水沖洗，并剪下被灌流的腸段，測(cè)量其長(zhǎng)度和內(nèi)徑。計(jì)算公式如下[15]。

Peff=-Qin·ln（Cout（cor）/Cin）2πrL

Ka=（1-Cout（cor）Cin）QinV

Fa=（1-Cout（cor）Cin）×100%

Cout（cor）=CoutQoutQin

Qout=Mout/Doutt

Qin為灌流液流速（mL·min-1）；L為灌流腸段長(zhǎng)度（cm）；r為灌流腸段半徑（cm）；Cin為灌流液初始濃度（mg·L-1）；Cout（cor）為經(jīng)質(zhì)量法校正后的灌流收集液濃度（mg·L-1）；V=πr2L為灌流腸道體積（mL）；Qout為通過(guò)灌流液密度測(cè)定的流出流速（mL·min-1）；Cout為灌流收集液質(zhì)量濃度（mg·L-1）；Mout為灌流收集液質(zhì)量（g），Dout為灌流收集液密度（g·mL-1），t為取樣周期（min）。

吸收參數(shù)結(jié)果以±s表示，用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 16.0處理數(shù)據(jù)，采用t檢驗(yàn)分析，當(dāng)P<0.05 時(shí)判定具有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 酚紅藥物濃度的測(cè)定

分別取空白灌流液、對(duì)照品溶液、含藥灌流液進(jìn)行液相檢測(cè)，考察該色譜條件下空白灌流液對(duì)樣品含量測(cè)定的干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1，在2.2.1.1色譜條件下，空白灌流液對(duì)樣品含量測(cè)定無(wú)干擾，說(shuō)明該方法的專(zhuān)屬性良好，酚紅的線性回歸方程為Y=15 838X+3 367.9，R2=0.999 8，結(jié)果表明酚紅在2.5～80 mg·L-1線性良好，測(cè)得的酚紅的回收率為95.60%～103.4%，精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD均小于1%。

酚紅腸吸收參數(shù)的計(jì)算結(jié)果（±s，n=3）有效滲透系數(shù)Peff為（1.09±0.62）×10-6 cm·s-1，吸收速率常數(shù)Ka為（1.19±6.7）×10-5 s-1，吸收分?jǐn)?shù)Fa為（0.33±0.087）%，從結(jié)果可知，酚紅為低滲透性藥物，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[16-17]，說(shuō)明腸上皮細(xì)胞的緊密連接結(jié)構(gòu)正常，且腸上皮的完整性保持良好。

3.2 地高辛濃度測(cè)定

分別取空白灌流液、含藥灌流液進(jìn)行液相檢測(cè)，考察該色譜條件下空白灌流液對(duì)樣品含量測(cè)定的干擾，結(jié)果見(jiàn)圖2，在1色譜條件下，空白灌流液對(duì)樣品含量測(cè)定無(wú)干擾，說(shuō)明該方法的專(zhuān)屬性良好，地高辛的線性回歸方程為Y=15 363X-2 499.7，r=0.999 1，地高辛在3.125～50 mg·L-1線性關(guān)系良好。高、中、低3個(gè)濃度的平均回收率95.56%～105.2%，精密度、重復(fù)性試驗(yàn)RSD均小于1%，穩(wěn)定性試驗(yàn)小于2%。

當(dāng)加入0.01 mmol·L-1維拉帕米時(shí)，對(duì)P-gp的抑制微弱，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示P>0.05，差異不顯著；給予0.1 mmol·L-1維拉帕米時(shí)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示P<0.05，具有顯著性差異，說(shuō)明維拉帕米對(duì)P-gp的抑制程度與其濃度有關(guān)，不同濃度的維拉帕米對(duì)回腸段的P-gp抑制作用，隨著濃度的增大而增強(qiáng)，見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明P-gp在小腸的表達(dá)完整，模型具有可行性。

4 討論

研究藥物口服吸收的常用模型分為在體、離體和Caco-2細(xì)胞模型[18]。Caco-2細(xì)胞模型具有以下優(yōu)點(diǎn)[19]：①研究藥物從小腸吸收以往主要考慮的是從腸腔一側(cè)（AP側(cè)，apical side）攝入，實(shí)際上，藥物從腸道進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，包括AP側(cè)攝入和從腸壁一側(cè)BL側(cè)，（basolateral side）外排2個(gè)過(guò)程同時(shí)進(jìn)行，用Caco-2細(xì)胞模型可以分別研究藥物從AP側(cè)的攝入，在細(xì)胞中的停留代謝及BL側(cè)的外排等過(guò)程，因此對(duì)闡明藥物在小腸中的吸收機(jī)制是十分有用的，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)則無(wú)法做到這些；②條件容易控制，數(shù)據(jù)重復(fù)性好；③與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相比，更省時(shí)和經(jīng)濟(jì)。盡管Caco-2細(xì)胞模型在評(píng)價(jià)口服藥物吸收方面有諸多的優(yōu)點(diǎn)，但是也具有明顯的不足[20]：①Caco-2是以結(jié)腸細(xì)胞系為基礎(chǔ)分化形成的類(lèi)似小腸組織，其緊密連接比小腸中實(shí)際存在的緊接連接更為緊密，這可能會(huì)導(dǎo)致基于該模型評(píng)價(jià)親水性藥物腸滲透時(shí)與體內(nèi)實(shí)際吸收有一定差距；②雖然Caco-2細(xì)胞能表達(dá)活性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系，但Caco-2 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白種類(lèi)和數(shù)量與機(jī)體小腸細(xì)胞仍有一定的差別；③機(jī)體腸細(xì)胞的黏液層是小腸吸收的主要屏障之一，但Caco-2細(xì)胞缺乏存在于小腸上皮細(xì)胞中的黏液層，這使得Caco-2 細(xì)胞的屏障特性與小腸上皮細(xì)胞也存在一定的差異。因而，Caco-2 細(xì)胞模型會(huì)導(dǎo)致對(duì)親水性、通過(guò)細(xì)胞旁路和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)的化合物的腸滲透性預(yù)測(cè)能力變差。

外翻腸囊模型是研究藥物腸吸收常用的離體模型[21]，該模型的優(yōu)點(diǎn)[22]是實(shí)驗(yàn)條件可控，減少了藥物吸收的影響因素，獲得的腸道吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)更容易分析藥物在腸道的吸收特征；該模型的缺點(diǎn)在于[23]：腸囊內(nèi)液體停滯不動(dòng)，這與機(jī)體小腸的蠕動(dòng)狀態(tài)的生理?xiàng)l件不同；另外，制備外翻腸囊時(shí)容易損傷腸粘膜，導(dǎo)致模型的腸壁細(xì)胞受損而影響模型的準(zhǔn)確性。而在體灌流模型與體外實(shí)驗(yàn)相比最大的優(yōu)點(diǎn)就是保持了小腸血管、淋巴和神經(jīng)等主要生理系統(tǒng)的完好[9]，且模型中保留了各種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的完整性。該模型最接近機(jī)體內(nèi)的狀態(tài)，更符合正常的生理?xiàng)l件，從而能夠更準(zhǔn)確預(yù)測(cè)口服藥物在體內(nèi)的吸收情況。但在體灌流模型也存在一定的不足：需要的動(dòng)物數(shù)量較大，成本高，不同動(dòng)物組別之間具有一定的差異性。所以在進(jìn)行藥物腸滲透性研究時(shí)，考慮模型之間的差異很重要，有時(shí)需要幾種模型方法聯(lián)合應(yīng)用，從而建立更好、更適宜的腸吸收預(yù)測(cè)模型，這樣才能提高對(duì)藥物的BCS分類(lèi)判定的準(zhǔn)確性。

P-gp 在小腸上皮細(xì)胞、肝膽管、腎小管及血腦屏障均有表達(dá)，它對(duì)經(jīng)p-糖蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的藥物的吸收、分布、排泄及藥物相互作用均有明顯影響[24]，所以基于P-gp的相互作用是目前研究的較多因素之一。P-糖蛋白在大鼠小腸的分布為從高到低腸段依次增加[25]，所以本實(shí)驗(yàn)選擇P-gp相對(duì)含量較高的回腸作為滲透性研究的腸段。

P-gp具有ATP依賴性的藥物外排泵的功能，能將細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出細(xì)胞外使細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度降低[26]，因而腸道P-gp的功能活性和表達(dá)水平的變化可引起某些P-gp底物藥物的口服生物利用度改變，常通過(guò)聯(lián)合用藥來(lái)抑制P-gp的外排作用是提高藥物生物利用度的有效途徑，基于此，采用P-gp 抑制劑與抗癌藥物聯(lián)合應(yīng)用已經(jīng)成為抗腫瘤治療過(guò)程中對(duì)付多藥耐藥性的解決方案[27]。所以，建立基于P-糖蛋白的在體單向腸灌流模型，充分了解藥物之間在P-gp環(huán)節(jié)可能產(chǎn)生的相互作用，不論對(duì)于合理地聯(lián)合用藥，避免藥物毒性或不良反應(yīng)，還是提高藥物滲透性分類(lèi)的準(zhǔn)確性都至關(guān)重要。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Balimane P V， Chong S， Morrison R A. Current methodologies used for evaluation of intestinal permeability and absorption[J]. J Pharm Toxicol Methods， 2000， 44（1）：301.

[2] Shah Vinod P， Amidon Gordon L. G.L. Amidon， H. Lennernas， V.P. Shah， and J.R. Crison. A theoretical basis for a biopharmaceutic drug classification： the correlation of in vitro drug product dissolution and in vivo bioavailability， Pharm Res 12， 413-420， 1995-Backstory of BCS[J]. AAPS J， 2014，doi： 10.1208/s12248-014-9620-9.

[3] Amidon G L， Lennernas H， Shah V P， et al. A theoretical basis for a biopharmaceutics drug classification： the correlation of in vitro drug product dissolution and in vivo bioavailability[J]. Pharm Res， 1995， 12 （3）：413.

[4] Bene Leslie Z.The role of BCS （biopharmaceutics classification system） and BDDCS （biopharmaceutics drug disposition classification system） in drug development[J]. J Pharm Sci， 2013， 102（1）：34.

[5] 劉洋，隗麗，董玲，等. 多成分體系下中藥生物藥劑學(xué)分類(lèi)系統(tǒng)的構(gòu)建分析[J]. 中國(guó)中藥雜志，2014，39（23）：4479.

[6] 侯成波，汪國(guó)鵬，張強(qiáng)，等. 中藥生物藥劑學(xué)分類(lèi)系統(tǒng)中多成分環(huán)境對(duì)葛根素溶解度的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2014，39（23）：4494.

[7] 劉洋，王剛，董玲，等. 中藥生物藥劑學(xué)分類(lèi)系統(tǒng)中多成分環(huán)境對(duì)葛根素滲透性的影響[J]. 中國(guó)中藥雜志，2014，39（23）：4505.

[8] 隗麗，朱美玲，董月柳，等. 鹽酸小檗堿在黃連水煎液中的生物藥劑學(xué)分類(lèi)系統(tǒng)屬性研究[J]. 中國(guó)中藥雜志，2016，41（7）：1192.

[9] Praveen V Balimane， Saeho Chong， Richard A Morrison， et al. Current methodologies used for evaluation of intestinal permeability and absorption[J]. J Pharm Toxicol Methods， 2000， 1（44）：301.

[10] FDA. Guidance for industry： waiver of in vivo bioavailability and bioequivalence studies for immediate-release solid oral dosage forms based on a Biopharm aceutics Classification System[EB/OL].[2016-11-14]. http：//www.fda.gov/About FDA /Centers Offices/Office of Medical Products and Tobacco/CDER /ucm 128219.htm.

[11] Chen M L， Amidon G L， Benet L Z， et al. The BCS， BDDCS， and regulatory guidances[J]. Pharm Res， 2011， 28（7）： 1774.

[12] Dezani T M， Dezani A B， da Silva Junior J B， et al. Single-pass intestinal perfusion （SPIP） and prediction of fraction absorbed and permeability in humans： a study with antiretroviral drugs[J]. Eur J Pharm Biopharm， 2016， 104： 131.

[13] Yang Y， Faustino P J， Volpe D A， et al. Biopharmaceutics classification of selected β-blockers： solubility and permeability class membership[J]. Mol Pharm， 2007， 4（4）： 608.

[14] Chen M L， Yu L. The use of drug metabolism for prediction of intestinal permeability[J]. Mol Pharm， 2009， 6（1）： 74.

[15] Li H， Dong L， Liu Y， et al. Comparison of two approaches of intestine absorption by puerain [J].Pharm Toxicol Methods， 2014， 70（1）： 6.

[16] 崔升淼，趙春順，何仲貴，等.大鼠腸管外翻模型對(duì)葛根素吸收機(jī)制的研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19（7）：1715.

[17] 胡一橋，鄭梁元，錢(qián)陳欽，等.離子型藥物酚紅的小腸吸收研究[J]. 中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，27（6）：355.

[18] 陳偉薇，李俊，宋玨.藥物腸吸收的研究方法進(jìn)展[J]. 安徽醫(yī)藥，2009，13（4）：350.

[19] 盧智玲，馮怡，徐德生，等. Caco-2細(xì)胞模型在中藥口服吸收及機(jī)制研究中的應(yīng)用[J].中草藥，2006，37（4）：616.

[20] 高坤，孫進(jìn)，何仲貴. Caco-2細(xì)胞模型在口服藥物吸收研究中的應(yīng)用[J]. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，22 （6）：469.

[21] 莫李立，王素軍.口服藥物吸收模型的研究進(jìn)展[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，27（1）：104.

[22] 董宇，張英豐，楊慶，等.黃連提取物在大鼠腸外翻實(shí)驗(yàn)中的吸收研究[J]. 中國(guó)中藥雜志，2008，33（9）：1056.

[23] Amidon G E， Ho N F H， French A B，et al. Predicted absorption rates with simultaneous bulk fluid flow in the intestinal tract[J]. J Theor Biol， 1981，2（89）：195.

[24] Engidawork E， Roberts J C， Hardmeier R， et al. Expression of the multidrug resistance P glycoprotein （P-gp） and multidrug resistance associated protein （MRP1） in down syndrome brains[M]//Lubec G.Protein Expression in Down Syndrome Brain. Vienna： Springer， 2001：35.

[25] Takara K， Ohnishi N， Horibe S， et al. Expression profiles of drug-metabolizing enzyme CYP3A and drug efflux transporter multidrug resistance 1 subfamily mRNAS in rat small intestine[J]. Drug Metab Dispos， 2003， 31（10）：1235.

[26] 彭文興，汪新亮，李煥德. 體內(nèi)藥物相互作用新點(diǎn)P-糖蛋白[J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2001，17（5）：386.

[27] 劉治軍，傅得興，孫春華，等. 體內(nèi)藥物相互作用研究進(jìn)展[J]. 藥物不良反應(yīng)雜志，2006，8（1）：33.

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