離體法及在體法對(duì)黃連水煎液中腸吸收多成分的初步研究

劉洋+隗麗+李雪蓮+潘孟+王子禹+董玲

[摘要] 藥物藥效的發(fā)揮與其在機(jī)體內(nèi)始終處在吸收、分布、代謝、排泄這種動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程密不可分，而吸收作為口服藥物進(jìn)入機(jī)體的首要環(huán)節(jié)格外受到重視。中藥作為多成分與多靶點(diǎn)的藥物，單一成分的性質(zhì)與其在多成分環(huán)境中所表現(xiàn)出來(lái)的性質(zhì)會(huì)有差別。該文以黃連提取物中的生物堿為主要研究對(duì)象，建立黃連中生物堿成分含量測(cè)定的分析方法。并通過(guò)離體翻轉(zhuǎn)腸囊實(shí)驗(yàn)及腸道灌流并行采血實(shí)驗(yàn)初步鎖定黃連水提液中可透過(guò)腸壁吸收并吸收入血的成分，為后續(xù)對(duì)黃連多成分的吸收代謝研究提供數(shù)據(jù)參考與支持。

[關(guān)鍵詞] 黃連水煎液；多成分；離體法；在體法；中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)

In vitro and in vivo intestinal absorption of Huanglian decoction in

multi-component environment

LIU Yang，WEI Li，LI Xue-lian，PAN Meng，WANG Zi-yu，DONG Ling*

（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

[Abstract] The effect of drugs in the body is always inseparable with the dynamic processes of absorption， distribution， metabolism and excretion. For oral drug， absorption， as the first link to enter the body， is particularly valued. Traditional Chinese medicine has multiple components and multiple targets， and the nature of its single composition is different from that in the multicomponent environment. Alkaloids in Huanglian extract was used as the main object in this study to establish an analytical method for determining the content of alkaloids in Huanglian. In addition， the compositions of the Huanglian aqueous extract solution which can be absorbed through intestinal wall into blood， were initially determined by the means of everted gut sac and in intestinal perfusion with venous sampling experiment. This paper can provide data reference and support for the further study on the absorption and metabolism of Huanglian.

[Key words] Huanglian decoction； multiple components； in vitro； in vivo；biopharmaceutics classification system of chinese materia medica

中藥多成分多靶點(diǎn)顯效的特點(diǎn)已被廣泛認(rèn)同，且近年來(lái)質(zhì)效關(guān)聯(lián)等理念在中藥質(zhì)量控制方面的應(yīng)用已日漸深入，綜合考慮中藥特點(diǎn)及其臨床療效進(jìn)行質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)成為研究熱點(diǎn)。藥物藥效的發(fā)揮與其在機(jī)體內(nèi)始終處在吸收、分布、代謝、排泄這種動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程密不可分，而吸收作為口服藥物進(jìn)入機(jī)體的首要環(huán)節(jié)格外受到重視。根據(jù) BCS 在生物藥劑學(xué)研究范圍中指向于藥物吸收的特征，并結(jié)合中藥多成分的復(fù)雜性與臨床療效實(shí)際，課題組提出的“中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)”（biopharmaceutics classification system of chinese materia medica，CMMBCS）[1]將 BCS 以吸收為核心的分類理念貫徹，并遵循定性為先、定量跟進(jìn)的研究思路，以吸收與否為界，分別定性與定量研究吸收成分與非吸收成分，并做CMMBCS分類。

在定性研究時(shí)，中藥成分的吸收完全是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，首先要在此過(guò)程中對(duì)要吸收的目標(biāo)成分進(jìn)行鎖定，其次再充分考慮多成分環(huán)境下其他成分對(duì)目標(biāo)成分的影響。然后再對(duì)吸收成分的吸收程度進(jìn)行系統(tǒng)分析和定量研究，對(duì)可吸收成分的溶解性和腸滲透性數(shù)據(jù)進(jìn)行科學(xué)歸類，并通過(guò)建立溶出度和溶解度的關(guān)聯(lián)關(guān)系而完善CMMBCS?；凇岸喑煞謱哟尾町惐容^法”的理論，課題組前期已經(jīng)對(duì)葛根芩連方中君藥葛根的主要成分葛根素進(jìn)行了多成分環(huán)境下的模擬研究[2-3]，及臣藥黃連的主要成分小檗堿在黃連水煎液多成分環(huán)境下的CMMBCS研究[4]。本文在前期研究基礎(chǔ)上，采用離體法及在體法，深入到中藥整體腸吸收的目標(biāo)成分鎖定，為多成分環(huán)境對(duì)目標(biāo)成分的影響研究及后續(xù)的CMMBCS分類提供研究基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他中藥CMMBCS的定性研究提供參考依據(jù)。

黃連在中醫(yī)藥傳統(tǒng)方劑中使用廣泛，《傷寒論》在12方中均用到黃連，約占同時(shí)期方數(shù)的86%[5]，據(jù)統(tǒng)計(jì)，宋以前13部方書中含黃連的方劑約為5%[6]。近年來(lái)，黃連降血脂、降血糖及抗癌等療效的深入研究以及新發(fā)現(xiàn)，引起了人們的廣泛關(guān)注。有研究[7]考察了小檗堿在黃連解毒湯模擬體系及全方中的腸吸收情況，發(fā)現(xiàn)在模擬體系及全方中小檗堿的吸收顯著增加，也從側(cè)面說(shuō)明了復(fù)雜環(huán)境中的成分對(duì)小檗堿確有影響，也顯現(xiàn)出了復(fù)方的優(yōu)勢(shì)。Yan等[8]對(duì)口服黃連和左金丸后血中的小檗堿、巴馬汀和藥根堿的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，在這2種給藥方式中每個(gè)成分的藥代動(dòng)力學(xué)曲線都不同，也說(shuō)明了不同多成分環(huán)境對(duì)目標(biāo)成分的吸收代謝等行為有著不同的影響。因此，更進(jìn)一步地對(duì)黃連多成分的吸收進(jìn)行研究，有重要的參考價(jià)值。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（SPD-20A型紫外檢測(cè)器，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，日本島津公司）；BT-25S電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；DZKW-4電熱恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；98-1-B型電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；KH7200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；STARTER 2100實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（奧豪斯儀器上海有限公司）；蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)器（BT100-1F，保定蘭格恒流泵有限公司）；注射泵（LSP02-1B，保定蘭格恒流泵有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（SIGMA，德國(guó)）。

1.2 藥物與試劑

鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)110713-201212，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；木蘭花堿對(duì)照品（批號(hào)M2903S1，上海源葉生物科技有限公司）；非洲防己堿對(duì)照品（批號(hào)Y13M6W1，上海源葉生物科技有限公司）；表小檗堿對(duì)照品（批號(hào)H25F3X1，上海源葉生物科技有限公司）；鹽酸藥根堿對(duì)照品（批號(hào)Z15T4B1，上海源葉生物科技有限公司）；鹽酸黃連堿對(duì)照品（批號(hào)ZS0924BE14，上海源葉生物科技有限公司）；鹽酸巴馬汀對(duì)照品（批號(hào)KS0922CF14，上海源葉生物科技有限公司）；鹽酸小檗堿原料（批號(hào)130808，陜西中鑫生物技術(shù)有限公司）；乙腈（色譜級(jí)，美國(guó)Fisher公司）；純凈水（娃哈哈集團(tuán)公司）；黃連藥材購(gòu)于北京同仁堂，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王晶娟副教授鑒定為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.的干燥根莖；其他試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠，雄性，體重200～250 g，北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（京）2014-0004。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的配制

2.1.1.1 鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液的配制 精密稱定鹽酸小檗堿對(duì)照品適量置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻后得鹽酸小檗堿儲(chǔ)備液，精密移取1 mL鹽酸小檗堿儲(chǔ)備液置于25 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻后得鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液。

2.1.1.2 混合對(duì)照品溶液的配制 分別精密稱定木蘭花堿、非洲防己堿、表小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對(duì)照品適量置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻后得各對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密移取木蘭花堿、非洲防己堿、表小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液適量置于同一10 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻備用，得混合對(duì)照品母液。

2.1.2 供試品溶液的制備

精密稱取黃連粉末（過(guò)60目篩）0.2 g，精密稱定，加50 mL甲醇-鹽酸（100∶1），稱定質(zhì)量，加熱回流提取30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，精密移取續(xù)濾液2 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.1.3 Krebs-Ringer′s營(yíng)養(yǎng)液（K-R液）

稱取NaCl 7.80 g，KCl 0.35 g，CaCl2 0.37 g，NaHCO3 1.37 g，NaH2PO4 0.32 g，MgCl2 0.02 g，葡萄糖1.40 g；加蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH到7.39～7.41，放置備用。

2.1.4 黃連水煎液的制備

取適量黃連藥材加10倍量水，常溫浸泡30 min，煎煮保持微沸30 min，趁熱濾過(guò)；藥渣加8倍量的水煎煮保持微沸30 min，趁熱濾過(guò)，合并2次濾液，濃縮，冷至常溫，加水定容得生藥質(zhì)量濃度為60 g·L-1的黃連水煎液。

2.1.5 灌流液制備

取黃連水煎液用K-R液稀釋至生藥濃度為3 g·L-1的灌流液。

2.2 含量測(cè)定方法的建立

2.2.1 色譜條件與適用性試驗(yàn)

2.2.1.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定 分別取2.1項(xiàng)下供試品溶液與鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，適當(dāng)稀釋后，在200～600 nm進(jìn)行紫外掃描。

2.2.1.2 色譜條件 Waters Atlantis T3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 um）；檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm；流速0.6 mL·min-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相乙腈（A）-水（B，含0.3%磷酸，0.5%三乙胺，調(diào)pH 3.0），梯度洗脫（0～2 min，13%A；2～4 min，13%～20%A；4～50 min，20%～25%A；50～55 min，25%～30%A；55～63 min，30%～70%A；63～65 min，70%～95%A；65～70 min，95%～13%A；70～80 min，68%～13%A）。

2.2.2 供試品溶液制備方法的確定

分別對(duì)提取方法、提取溶劑、提取溶劑用量、提取時(shí)間進(jìn)行考察。通過(guò)超聲提取、加熱回流提取及加熱回流后超聲提取，篩選制備黃連供試品溶液的方法；通過(guò)水、水-鹽酸（100∶1）、甲醇、甲醇-鹽酸（100∶1）、乙醇、乙醇-鹽酸（100∶1）條件篩選提取溶劑制備黃連供試品溶液；通過(guò)25，50，75 mL篩選溶劑用量制備黃連供試品溶液；通過(guò)30，60，90 min篩選提取時(shí)間制備黃連供試品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

2.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密移取2.1.1項(xiàng)下混合對(duì)照品母液0.15，0.25，0.50，0.75，1.0，2.0 mL分別置于5 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，配制成一系列濃度的混合對(duì)照品溶液。過(guò)0.22 μm微孔濾膜，精密吸取上述溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積。分別以木蘭花堿、非洲防己堿、表小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿各對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸。

2.2.3.2 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，按上述色譜條件分別重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。

2.2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批黃連粉末（過(guò)60目篩）6份，按2.1.2項(xiàng)下方法操作，平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。

2.2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取新配制的供試品溶液，分別在0，2，4，8，12，24 h按上述色譜條件測(cè)定峰面積。

2.2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取黃連粉末0.1 g，分別加入精密稱定的7種生物堿對(duì)照品，按2.1.2項(xiàng)下方法操作，平行操作6份，按上述色譜條件測(cè)定峰面積并計(jì)算加樣回收率。

2.3 離體法及在體法對(duì)黃連水煎液中腸吸收多成分研究

2.3.1 大鼠離體翻轉(zhuǎn)腸囊研究

大鼠禁食不禁水12～18 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，打開腹腔，迅速取出約（10±2） cm 長(zhǎng)各腸段（十二指腸、空腸、回腸及結(jié)腸），將大鼠腸管與腸系膜剝離，生理鹽水沖洗干凈后將腸段翻轉(zhuǎn)，使黏膜層在外，漿膜層在內(nèi)，用手術(shù)線結(jié)扎腸段一端形成囊狀。向小囊中加入2 mL空白Krebs-Ringer′s營(yíng)養(yǎng)液，將腸囊置于含藥營(yíng)養(yǎng)液的錐形瓶中，并置于水浴鍋中37 ℃保溫。期間向錐形瓶中持續(xù)通入氧及二氧化碳的混合氣體以保持離體腸囊的活性。60 min后取出腸囊內(nèi)液體，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，注入高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.3.2 腸道灌流并行采血研究

大鼠禁食不禁水12～18 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，右側(cè)頸靜脈插管連接到蠕動(dòng)泵進(jìn)行供血。打開腹部，選取腸段，用37 ℃的生理鹽水沖洗干凈，結(jié)扎實(shí)驗(yàn)用腸段以外的血管。對(duì)所取灌流腸段對(duì)應(yīng)的腸系膜靜脈插管，并連接到蠕動(dòng)泵，收集腸系膜靜脈流出血液。腸段進(jìn)口端與注射泵相連，將注射泵流速調(diào)為0.2 mL·min-1，灌流藥液，約30 min后吸收達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。開始計(jì)時(shí)收集流出的藥液和血液。每隔15 min更換腸液和血液的收集管，采用質(zhì)量法進(jìn)行水分校正。試驗(yàn)結(jié)束后，用生理鹽水沖洗腸段，將所用腸段剪下，測(cè)量其長(zhǎng)度和內(nèi)徑，并處死大鼠。所取血液樣品3 500 r·min-1離心15 min，取上層血漿，加入3倍量的甲醇沉淀蛋白，渦旋2 min，1萬(wàn)r·min-1離心15 min，取上清液氮吹至干后200 μL甲醇復(fù)溶，1萬(wàn) r·min-1離心10 min，取上清液注入高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)；灌流液樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后過(guò)0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，注入高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 數(shù)據(jù)分析[9]

翻轉(zhuǎn)腸囊法腸滲透性的表觀吸收系數(shù)Papp計(jì)算如下。

Papp=ΔQ/Δt2πrL·C0

C0為小檗堿初始濃度（mg·L-1）；ΔQ/Δt為60 min內(nèi)腸囊內(nèi)溶液中小檗堿的量（μg·s-1）；L為腸段長(zhǎng)度（cm）；r為腸半徑（cm）。

3 結(jié)果

3.1 黃連多成分HPLC圖的建立

3.1.1 黃連多成分HPLC圖

結(jié)果顯示，鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液在429，349，265，230 nm處有吸收，黃連供試品溶液在435，348，265，228 nm處有吸收，由于在348 nm處樣品吸收干擾較小，應(yīng)選擇348 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。但是，在液相圖譜中，265 nm波長(zhǎng)下色譜峰較多，尤其是木蘭花堿色譜峰在348 nm波長(zhǎng)下無(wú)吸收，而在265 nm波長(zhǎng)下能檢測(cè)到。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇265 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)來(lái)同時(shí)測(cè)定多個(gè)生物堿的含量。

在2.2.1.2色譜條件下，系統(tǒng)適應(yīng)性良好，見(jiàn)圖1。

3.1.2 黃連供試品溶液

最終確定用50 mL甲醇-鹽酸（100∶1）加熱回流提取30 min時(shí)提取效果最好，且有良好的重復(fù)性。

3.1.3 方法學(xué)分析

結(jié)果表明，本方法線性良好，儀器精密度及方法重復(fù)性良好，樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定，加樣回收率99.53%～104.0%，RSD均小于3.0%。

3.2 黃連水煎液離體法的腸吸收測(cè)定

黃連水煎液離體翻轉(zhuǎn)腸囊實(shí)驗(yàn)中空白K-R試液、經(jīng)適當(dāng)稀釋后的黃連水煎液以及腸囊中樣品測(cè)定圖譜見(jiàn)圖2，空白K-R液對(duì)各腸段測(cè)定無(wú)干擾。腸滲透系數(shù)Papp計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。

由以上結(jié)果可知，黃連水煎液中有7個(gè)生物堿類成分均能透過(guò)腸壁吸收，但在各腸段吸收程度各不相同，總體而言，各生物堿以十二指腸吸收為最好，其次是回腸、結(jié)腸，空腸吸收最差。

3.3 黃連水煎液在體法的腸吸收測(cè)定

黃連水煎液大鼠在體實(shí)驗(yàn)中血液樣品定性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3，空白血漿對(duì)樣品測(cè)定無(wú)干擾。

由以上結(jié)果可知，在翻轉(zhuǎn)腸囊實(shí)驗(yàn)中吸收入腸的成分在血液樣品中同樣能夠檢測(cè)到，但與灌流原液相比，入血含量微量。

4 討論

離體翻轉(zhuǎn)腸囊法可用于初步研究藥物的腸吸收情況，尤其是藥物在不同腸段的吸收差異，也可用于生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究。該法是從體積相對(duì)較小的漿膜內(nèi)取液進(jìn)行測(cè)定以考察藥物透過(guò)腸壁吸收的量，對(duì)于溶解性較差的藥物的檢測(cè)尤其適用。由于離體腸組織活性的限制，除了在操作過(guò)程中持續(xù)供氧以外，取樣時(shí)間也不宜過(guò)長(zhǎng)[10-11]。本研究中采用離體法考察了黃連水煎液在不同腸段內(nèi)的吸收情況，結(jié)果檢測(cè)到7個(gè)生物堿成分能入腸吸收，分別為木蘭花堿、非洲防己堿、表小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿。通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)此類成分的表觀滲透系數(shù)Papp數(shù)量級(jí)在10-5～10-6級(jí)別，滲透性較差，其中木蘭花堿在各個(gè)腸段內(nèi)的吸收均比其他成分好，而其他成分的吸收情況相差不大，推測(cè)可能是由于結(jié)構(gòu)不同所致，其中木蘭花堿為阿樸菲型生物堿，而其他成分為原小檗堿型生物堿，也可能是在多成分環(huán)境中相互影響而致，具體需要通過(guò)單成分及成分配比等進(jìn)一步研究。

離體實(shí)驗(yàn)中成分需要透過(guò)肌肉層和基底膜層才能進(jìn)入腸囊，且腸囊內(nèi)液體停滯不動(dòng)，與生理?xiàng)l件不同，適于初步定性研究。鑒于此，為了更真實(shí)的反映藥物的吸收情況，還需要通過(guò)在體法進(jìn)一步考察透過(guò)腸壁吸收的成分能否吸收進(jìn)入血液循環(huán)。大鼠腸灌流并行采血法保證了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織器官完整，更為接近體內(nèi)狀態(tài)，以藥物實(shí)際入血量為其吸收的量，更能真實(shí)反映藥物真正吸收進(jìn)入肝門靜脈的情況[12-13]。本文中采用該法進(jìn)行腸吸收入血的定性研究，結(jié)果顯示上述7個(gè)成分均能入血吸收，但檢測(cè)到的成分含量均較少，具體入血含量的多少需要進(jìn)一步定量分析。

目前對(duì)中藥單一成分的吸收、分布、代謝、排泄研究較多，中藥作為多成分與多靶點(diǎn)的藥物，是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，其中單一成分的性質(zhì)與其在多成分環(huán)境中所表現(xiàn)出來(lái)的性質(zhì)會(huì)有差別。CMMBCS的研究分為定性研究和定量研究2個(gè)層次，中藥多成分研究所面臨的問(wèn)題是在研究工作前期，中藥中的“多成分組成未知”，所以在 CMMBCS 研究中應(yīng)以吸收與否為界，分別定性研究吸收成分與非吸收成分。本文采用離體法及在體法對(duì)黃連水煎液中腸吸收多成分做初步研究，通過(guò)單一成分與提取物環(huán)境中各成分的吸收參數(shù)的比較，可解釋多成分環(huán)境對(duì)藥物吸收的影響并描述中藥的吸收特征，進(jìn)一步說(shuō)明中藥的科學(xué)性及合理性，為CMMBCS開展多成分的研究提供參考及示范，有利于對(duì)之后整個(gè)中藥或者復(fù)方的吸收及代謝研究提供數(shù)據(jù)支持，同時(shí)也為中藥進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)及質(zhì)量控制提供了新的研究思路，對(duì)實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化具有重要意義。

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[責(zé)任編輯 孔晶晶]