白薇提取物的抗氧化和抑菌活性

彭旋+陳楚英+陳金印+萬春鵬

摘要：分別用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇和蒸餾水提取白薇粉末，采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基法、鐵離子還原能力（FRAP）測定法研究其抗氧化活性；通過杯碟法測定不同溶劑提取物對意大利青霉的抑菌效果；用生長速率法研究白薇乙醇提取物對其他15種植物病原菌的抑菌活性?？寡趸囼灡砻鳎喊邹狈勰┱麴s水、丙酮、乙醇提取物的抗氧化活性較好，其清除DPPH自由基的IC50分別為15.66、25.37、28.27 mg/mL，其總酚含量分別為70.19、63.20、53.84 mg/g，可見抗氧化活性與總酚含量密切相關(guān)。抑菌活性試驗表明：白薇粉末乙酸乙酯、丙酮、乙醇乙醇提取物對意大利青霉有抑菌活性，且乙醇提取物抑菌圈直徑最大，為31.50 mm；乙醇提取物對其他15種植物病原菌均有一定的抑菌活性，其中對棗擬莖點霉、辣椒疫霉菌、西瓜尖鐮孢菌活性最強，EC50分別為0.194、1.019、4.185 mg/mL。研究結(jié)果表明，白薇乙醇提取物具有較好的抗氧化活性和較強的抑菌活性，可用于植物源保鮮劑的開發(fā)。

關(guān)鍵詞：白薇；抗氧化；總酚；總黃酮；抑菌活性

中圖分類號：R285；TS255.3文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2017）04-0140-04

白薇（Cynanchum atratum）為蘿摩科（Asclepiadacea）鵝絨藤屬（Cynanchum）植物直立白薇（Cynanchum atratum Bunge）或蔓生白薇（Cynanchum versicolor Bunge）的干燥根及根莖，在全國大部分地區(qū)均有分布，主要生長于山地。據(jù)《中藥大辭典》記載，白薇根及根莖部分可供藥用，有“清熱散腫、利尿通淋、解毒療瘡”的功效。目前，國內(nèi)外對白薇的研究主要集中在化學成分的分離鑒定與藥理作用。化學成分研究表明，白薇主要含有C21甾體皂苷、白薇素、揮發(fā)油、強心苷，而且發(fā)現(xiàn)白薇皂苷具有抗菌消炎作用[1]。

柑橘是我國南方的主要水果品種之一，在采后貯藏過程中易受青綠霉菌侵染，導致果實腐爛，隨后大量病果被到處丟棄，造成巨大的經(jīng)濟損失、環(huán)境污染。另外，受空氣中的氧和果實中酶的作用，果實油脂中的不飽和脂肪酸會氧化分解為醛、酮和低級脂肪酸，降低果實的品質(zhì)[2]。為了降低采后柑橘果實爛果率，目前生產(chǎn)上主要使用咪鮮胺、噻菌靈等化學殺菌劑，而使用化學殺菌劑易造成果實藥劑殘留，危害人體健康。面對這種情況，開發(fā)具有較強抗氧化性和能抑制柑橘等植物采后主要病害病原菌雙重功能的保鮮劑是比較理想的辦法。筆者所在課題組前期篩選發(fā)現(xiàn)，白薇對柑橘青霉菌具有較強的抑制作用。因此，本研究以石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、水為提取溶劑，采用超聲波輔助方法提取白薇，比較白薇不同溶劑提取物體外抗氧化性和對柑橘采后主要病原菌意大利青霉（Penicillium italicum）的抑菌活性；進一步研究白薇乙醇提取物對其他15種植物病原菌的抑菌活性，以期為植物源果蔬保鮮劑相關(guān)研究提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

白薇，購自江西省樟樹市華豐藥業(yè)有限公司，粉碎，過40目篩，常溫保存?zhèn)溆?。柑橘青霉病病菌：柑橘意大利青霉（P. italicum）；棗褐斑病病菌：棗擬莖點霉菌（Phomopsis mauritiana）；柑橘黑腐病病菌：柑橘鏈格孢菌（Alternaria citri）；柑橘蒂腐病病菌：柑橘囊孢殼菌（Phytophthora capsici）；萵苣菌核病病菌：萵苣菌核核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）；辣椒疫病病菌：辣椒疫霉（Phytophthora capsici）；柑橘酸腐病病菌：柑橘白地霉（Geotrichum citri-aurantii）；茄褐紋病病菌：茄褐紋擬莖點霉（Phomopsis vexans）；柑橘灰霉病病菌：柑橘灰霉菌（Botrytis cinerea）；蘆筍莖枯病病菌：蘆筍天門冬擬莖點霉（Phomopsis asparagi）；西瓜枯萎病病菌：西瓜尖鐮孢菌（Fusarium oxysporum f.sp. niveum）；柑橘綠霉病病菌：柑橘指狀青霉（Penicillium digitatum）；獼猴桃軟腐病三大致病菌：葡萄座腔菌（Botryosphaeria parva）、獼猴桃擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsis fici）、獼猴桃擬莖點霉（Phomopsis sp.）。以上菌株均由江西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院植物病理實驗室提供；PDA培養(yǎng)基，筆者所在實驗室自制。

1.2儀器與試劑

HH-6恒溫數(shù)顯水浴鍋（常州國華電器有限公司）；5804R冷凍離心機（德國Eppendorf）；R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUI）；KQ-500B超聲波清洗機（昆山超聲儀器有限公司）；YXQ-LS-70A立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司）；MIR-254恒溫培養(yǎng)箱（日本三洋電機公司）；LX-300冷卻水循環(huán)機（北京長流科學儀器公司）；HS-1300U超凈工作臺（蘇靜集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；UV-2450紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；AUY220電子分析天平（日本島津公司）；FW100高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

福林酚（Folin-Ciocalteu）試劑、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），購自Sigma公司（美國）；沒食子酸、蕓香苷標準品，購自中國生物制品研究所（北京）；其他試劑為市售試劑，所有試劑均為分析純產(chǎn)品。

1.3白薇提取物樣品的制備

稱取30 g備用藥粉，共6份，分別加入1 L不同溶劑（石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、蒸餾水），超聲波輔助提取2 h（40 kHz，25 ℃），抽濾，濾渣加1 L相同溶劑重復(fù)提取1次。將2次濾液合并，于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，最后真空冷凍干燥，稱質(zhì)量，加適當體積的溶劑配成100 mg/mL提取物儲備液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?

1.4測定方法

1.4.1總酚含量的測定[3]精確稱取0.5 g沒食子酸，用乙醇溶解定容至100 mL，分別移取0、1、2、3、5、10 mL到100 mL容量瓶內(nèi)，定容。從上述不同濃度的標準溶液中分別移取 0.1 mL 到10 mL容量瓶中，分別加入6 mL水，混合后加入 0.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，混合；3 min后，加入1.5 mL 20% Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至10 mL。將上述標準溶液于 20 ℃ 放置2 h后，在765 nm波長處測定吸光度D765 nm，以D765 nm為橫坐標、沒食子酸濃度為縱坐標，繪制標準曲線，求線性回歸方程。吸取0.1 mL適宜濃度的提取物（使D765 nm落在標準曲線的范圍內(nèi)），按上述方法進行顯色反應(yīng)，按照回歸方程計算提取物的總酚含量。

1.4.2總黃酮含量的測定[4]精確稱取10.0 mg蕓香苷標準品（120 ℃烘干至恒質(zhì)量），用甲醇定容至50 mL，配成 0.2 mg/mL 蕓香苷標準溶液。吸取蕓香苷標準品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置于10 mL容量瓶內(nèi)，加入 2 mL 0.1 mol/L AlCl3溶液、1 mL pH值為5.2的NaAc-HAc緩沖溶液，用甲醇定容，40 ℃水浴顯色10 min，在421 nm處測定吸光度D421 nm，以D421 nm為橫坐標、蕓香苷濃度為縱坐標，繪制標準曲線，求線性回歸方程。吸取1 mL適宜濃度的提取物（使D421 nm落在標準曲線的范圍內(nèi)），按上述蕓香苷標準品顯色方法進行顯色反應(yīng)，按照回歸方程計算提取物的總黃酮含量。

1.4.3DPPH·抗氧化活性測定參考劉海英等的方法[5]測定白薇不同提取物清除DPPH·自由基能力。在3.0 mL 0.06 mmol/L DPPH·乙醇溶液中加入10 L不同濃度（1、3、5、7、9 mg/mL）樣品提取物，混勻后避光反應(yīng)30 min，測定 517 nm 處吸光度D517 nm（1）。按照下列公式計算各樣品對 DPPH· 自由基的清除率：

DPPH·清除率={D517 nm（0）-[D517 nm（1）-D517 nm（s）]}/D517 nm（0）×100%。

式中：D517 nm（0）為對照吸光度（僅含DPPH·乙醇溶液）；D517 nm（s）為空白對照（蒸餾水）的吸光度（樣品與無水乙醇用以消除樣品本身顏色的影響）。

1.4.4鐵離子還原能力（FRAP）測定參考姜洪芳等的方法[6]測定白薇不同提取物還原力。吸取0.5 mL不同濃度（1、3、5、7、9 mg/mL）提取物于試管中，依次加入0.5 mL 0.05 mol/L 磷酸緩沖液（pH值6.6）、0.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，于50 ℃水浴保溫20 min，快速冷卻，再加入0.5 mL 10%三氯乙酸，于3 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液，再依次加0.8 mL蒸餾水、0.2 mL 0.1%三氯化鐵溶液，充分混勻，靜置10 min后，于700 nm處測吸光度D700 nm，用蒸餾水作參比。

1.4.5杯碟法抑菌活性測定用杯碟法測定白薇提取物對柑橘青霉菌抑菌活性[7]，用無菌水將活化好的意大利青霉菌洗入三角瓶中，過濾，將濾液充分搖勻制成孢子懸浮液，用血球計數(shù)板計數(shù)，使菌液孢子濃度為1億CFU/mL。在無菌條件下，吸取1 mL意大利青霉菌懸液于融化的PDA培養(yǎng)基中，使菌液濃度在100萬CFU/mL，搖勻后倒入平板。等培養(yǎng)基凝固后，吸取200 μL濃度為100 mg/mL的提取物于牛津杯中，進行抑菌活性的測定，重復(fù)3次。將平板放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.4.6生長速率法抑菌活性測定測定白薇乙醇提取物對15種植物病原菌的抑菌活性[8]，在無菌環(huán)境下，采用二倍稀釋法，用移液器吸取不同體積的白薇乙醇提取物加入到未凝固的PDA培養(yǎng)基中，制成含藥培養(yǎng)基，其終濃度均為3.125～100.000 mg/mL，空白對照為純PDA培養(yǎng)基（不加藥劑）。葡萄座腔菌、棗擬莖點霉、萵苣菌核核盤菌、辣椒疫霉、獼猴桃擬盤多毛孢菌和西瓜尖鐮孢菌用孔徑4 mm的打孔器打取已活化的菌塊邊緣，其余菌種用孔徑6 mm的打孔器打取活化好的菌塊邊緣。用接種針將菌塊轉(zhuǎn)接到不同濃度含藥培養(yǎng)基及對照培養(yǎng)基中，每個濃度平行處理3次，將接種好的培養(yǎng)物放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～7 d，隨后用十字交叉法測量各培養(yǎng)皿菌落直徑，計算平均值，記錄各菌落生長情況。根據(jù)以下公式求出白薇乙醇提取物對各菌種的抑制率：

抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

以抑制率為因變量（y）、白薇乙醇提取物濃度的對數(shù)值為自變量（x），建立白薇乙醇提取物對15種植物病原菌的毒力回歸方程：y=a+bln（x），求得方程的相關(guān)系數(shù)r、藥劑EC50及其95%置信區(qū)間。

1.5數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003進行數(shù)據(jù)處理與作圖，用SPSS 17.0進行Duncans多重比較數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2結(jié)果與分析

2.1白薇提取物總酚和總黃酮含量

根據(jù)總酚含量線性回歸方程y=9.211 8x+0.061 2（r2=0.999 4）、總黃酮含量線性回歸方程y=43.052x-0.515 1（r2=0.998 8），計算白薇不同溶劑提取物中的總酚、總黃酮含量。從表1可以看出，白薇不同溶劑提取物的總酚、總黃酮含量存在顯著差異，其中總酚含量從高到低的提取溶劑依次是蒸餾水、丙酮、乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷和石油醚提取物，分別為70.19、63.20、53.84、30.16、22.98、12.95 mg/g；三氯甲烷提取物的總黃酮含量最高，為51.14 mg/g，其次是乙酸乙酯、丙酮、乙醇和石油醚提取物，總黃酮含量在26.34～3320 mg/g之間，蒸餾水提取物的總黃酮含量最低，為 2.47 mg/g。

母表示差異顯著（P<0.05）；表3同。[HT][FK）]

2.2白薇提取物的抗氧化活性

DPPH自由基是一類含有3個苯環(huán)的穩(wěn)定紫色自由基，在517 nm處有強吸收，在DPPH醇溶液中加入抗氧化劑，會清除自由基，從而使紫色溶液變淡，且抗氧化劑的抗氧化能力越強，溶液越淡。因此，常用DPPH自由基清除法來測定抗氧化劑的抗氧化能力[9]。通常用IC50表示抗氧化劑對DPPH自由基的清除能力，IC50為DPPH自由基清除率為50%時的抗氧化劑濃度，IC50越低，抗氧化能力越強。從圖1-A可以看出，各提取物清除DPPH自由基的能力隨著其濃度的增加而增強，呈正相關(guān)。測定樣品不同濃度對DPPH自由基的清除率，通過回歸分析得出各自的IC50，從表2可以看出，各提取物都有一定的抗氧化能力，其中白薇水提物抗氧化能力最強，其次為丙酮、乙醇提取物，乙酸乙酯、三氯甲烷、石油醚提取物抗氧化能力較弱，可見抗氧化活性與總酚含量呈正相關(guān)。

當樣品具有還原性時，會提供電子將Fe3+/鐵氰化物還原成Fe2+/鐵氰化物，F(xiàn)e2+在700 nm處通過普魯士藍有特征光吸收，吸光度越大，表明其還原能力越強。圖1-B表明，白薇提取物都具有較強還原力，且隨著濃度升高，還原力越強，但在不同提取物之間，還原力的差異較大；在試驗濃度范圍內(nèi)，白薇丙酮、乙醇和水提取物的還原能力明顯強于三氯甲烷、石油醚提取物；乙酸乙酯提取物的還原能力強于三氯甲烷、石油醚提取物。

2.3抗氧化能力與總酚、總黃酮含量相關(guān)性分析

比較分析白薇提取物抗氧化能力（IC50）與其總酚含量之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)抗氧化能力越強的提取物，其總酚含量也越高（表1、表2）。對白薇提取物IC50和總酚含量進行相關(guān)性分析，從圖2-A可知，白薇提取物的總酚含量與IC50的線性回歸方程為y=0.976 3x+84.048（r2=0.950 5），兩者呈顯著負相關(guān)，表明總酚含量越高，IC50越小，抗氧化能力越強，提示總酚可能是白薇提取物抗氧化能力的關(guān)鍵物質(zhì)。另外，通過圖2-B對總黃酮含量與IC50的相關(guān)性分析可知，兩者無顯著的相關(guān)性（r2=0.290 3）。

2.4抑菌活性

選用對柑橘意大利青霉抑菌直徑最大的乙醇提取物，測定該提取物對其他15種植物病原菌的室內(nèi)毒力。EC50是藥劑對病原菌抑制作用強弱的直觀反映，藥劑對病原菌EC50越小，表明藥劑對其抑制能力越強。毒力回歸方程的斜率（b）越大，說明隨著藥劑濃度升高，其抑制能力增加得越快，病原菌對藥劑濃度越敏感。從表4可見，白薇乙醇提取物對15種植物病原菌均表現(xiàn)出一定的抑制效果，其中乙醇提取物對棗擬莖點霉的毒力最強，EC50為0.194 mg/mL，對獼猴桃擬莖點霉的EC50為120.940 mg/mL，抑制效果最弱；對其他菌種EC50由小到大排序為辣椒疫霉、西瓜尖鐮孢菌、柑橘意大利青霉、柑橘鏈格孢菌、柑橘指狀青霉、蘆筍天門冬擬莖點霉、柑橘灰霉菌、柑橘白地霉、柑橘囊孢殼菌、獼猴桃擬盤多毛孢菌、萵苣菌核核盤菌、葡萄座腔菌和茄褐紋擬莖點霉，EC50在1.019～45.313 mg/mL范圍內(nèi)。根據(jù)毒力回歸方程的斜率（b）可知，柑橘指狀青霉對白薇乙醇提取物最敏感，b=0.303。

3討論與結(jié)論

多酚類、黃酮類成分對植物的抗氧化和抗菌有重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，山柰酚、槲皮素和其他黃酮醇等種類的黃酮有抗菌、止癢和抗過敏作用[10]。本試驗發(fā)現(xiàn)，白薇乙醇提取物具有較強抗氧化活性，并對一些植物病原菌具有較好的抑制效果。Katalinic等研究發(fā)現(xiàn)，樣品清除DPPH自由基能力與其多酚類物質(zhì)含量有很大關(guān)系[11]。本試驗也證明，總酚含量越高的樣品，其清除DPPH自由基能力越強，說明可以將總酚含量作為初步篩選抗氧化樣品的判斷依據(jù)。一種物質(zhì)的還原能力在一定程度上可以反映其潛在的抗氧化能力。Yen等研究發(fā)現(xiàn)，一些植物提取物的抗氧化能力和還原能力是相關(guān)聯(lián)的[12]。本試驗結(jié)果表明，具有較強清除DPPH自由基能力的水、丙酮以及乙醇提取物，還原鐵離子能力也較強。

白薇提取物對柑橘意大利青霉抑菌活性表明，白薇不同溶劑提取物對意大利青霉具有不同的抑制作用，其中以白薇乙醇提取物的抑菌直徑最大。白薇乙醇提取物對15種植物病原菌室內(nèi)毒力測定結(jié)果表明，白薇乙醇提取物對它們均有一定抑菌活性，說明白薇乙醇提取物中含有多種病原菌的抑菌活性成分，具有較廣的抑菌譜，特別是白薇乙醇提取物對6種柑橘采后病菌均有較好的抑菌效果，這為用白薇開發(fā)成柑橘防腐保鮮劑提供了理論依據(jù)，有望將其開發(fā)成天然抗氧化劑和柑橘防腐保鮮劑，從而為白薇的綜合利用提供了理論依據(jù)，同時也為得到天然、安全的抗氧化劑及抑菌單體提供了一種新的植物來源。白薇抗氧化與抑菌活性的開發(fā)利用具有良好的發(fā)展前景，其活性成分的分離鑒定與抗氧化及抑菌活性的構(gòu)效關(guān)系還有待進一步研究。

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