胎衣不下奶牛血清和胎盤中激素含量變化的研究

朱永剛，王磊，王旭榮，張景艷，崔東安，張凱，張康，王學(xué)智，李建喜，楊志強(qiáng)

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，蘭州 730050）

胎衣不下奶牛血清和胎盤中激素含量變化的研究

朱永剛，王磊，王旭榮，張景艷，崔東安，張凱，張康，王學(xué)智，李建喜，楊志強(qiáng)

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，蘭州 730050）

本試驗在產(chǎn)犢后立即無菌采集32頭奶牛血液，其中17頭為胎衣正常排出奶牛，15頭為胎衣不下奶牛。胎衣正常排出奶牛在胎衣排出后立即采集胎盤，胎衣不下奶牛在確診后再次靜脈采血并采集其胎盤；用酶聯(lián)免疫吸附測定法對胎衣不下奶牛和胎衣正常排出奶牛血清和胎盤中的激素含量進(jìn)行檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果表明，胎衣不下奶牛血清和胎盤中孕酮、纖維蛋白溶酶原和前列腺素（PGF2α）的含量與胎衣正常排出組相比差異顯著降低（P＜0.05），而雌二醇含量則顯著升高（P＜0.05）。本試驗通過對胎衣不下和胎衣正常排出奶牛血清和胎盤中激素的含量進(jìn)行檢測并比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)奶牛胎衣不下的發(fā)生與血清和胎盤組織中的孕酮、雌二醇、纖維蛋白溶酶原和前列腺素（PGF2α）的含量變化有密切相關(guān)的聯(lián)系，表明奶牛胎衣不下的發(fā)生可能與機(jī)體內(nèi)激素分泌紊亂具有很大的關(guān)聯(lián)。

胎衣不下；孕酮；雌二醇；前列腺素（PGF2α）；纖維蛋白溶酶原

奶牛胎衣不下（Retained fetal membranes, RFM）是指奶牛分娩的第三個階段（胎衣排出期）胎兒排出后12h內(nèi)未能排出胎衣的產(chǎn)科病癥[1]。據(jù)文獻(xiàn)中報道，美國的奶牛胎衣不下發(fā)病率一般在1.3%～39.2%[2,3]；而我國奶牛胎衣不下發(fā)病率多在12%～30%之間[4,5]，個別地區(qū)甚至高達(dá)50%[6～8]。奶牛胎衣不下的繼發(fā)疾病很多，如不及時治療，會引發(fā)乳房炎、子宮內(nèi)膜炎、子宮積膿和子宮脫出等產(chǎn)后疾病，影響奶牛泌乳性能、繁殖能力，嚴(yán)重者甚至?xí)斐赡膛Ｋ劳鯷9～11]。據(jù)統(tǒng)計，奶牛胎衣不下的平均花費，包括治療費用、人工費用、間接損失等，大約每頭患牛需要285美元[2]，經(jīng)濟(jì)損失十分嚴(yán)重。因此，奶牛胎衣不下是奶牛產(chǎn)后亟待解決的疾病之一。雖然近年來對該病的發(fā)病原因進(jìn)行了大量研究，但是致使其發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)制至今尚不清楚，直接影響了臨床上對該病的防治效果。因此，全面了解奶牛胎衣不下的發(fā)生機(jī)理，采取有效的檢測方法進(jìn)行早期診斷和治療是非常重要的。

胎衣不下的發(fā)病原因十分復(fù)雜，由于胎衣排出過程發(fā)生在分娩的第三個階段，所以其發(fā)生很大程度上取決于奶牛體內(nèi)的一些激素的作用。以往對胎衣不下的研究主要通過對血液中或者胎盤中的激素進(jìn)行單一分析，無法客觀、全面地揭示奶牛胎衣不下的發(fā)病原因[12～15]。酶聯(lián)免疫吸附測定法具有靈敏、特異、快速、簡便、可同時檢測多種樣品等特點，適用于實驗室血清學(xué)診斷以及大規(guī)模的疫病調(diào)查[16]。為此，本試驗利用酶聯(lián)免疫吸附測定法對血清和胎盤中相關(guān)激素水平的變化進(jìn)行研究，尋找胎衣不下奶牛整體的激素變化特點，為奶牛胎衣不下的發(fā)病機(jī)理以及預(yù)防和治療的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物選擇

2016年2～3月，在甘肅省荷斯坦牛繁育示范中心按照年齡、胎次、產(chǎn)后體況評分和分娩日期相近的原則，挑取32頭圍產(chǎn)期荷斯坦牛為試驗動物。

1.2 試驗試劑與儀器

孕酮免疫分析試劑盒、雌二醇免疫分析試劑盒、纖維蛋白溶酶原免疫分析試劑盒，均購自臺灣Abnova公司；前列腺素（PGF2α），購自美國Cloud-Clone Corp 公司；離心機(jī)，德國Eppendorf公司生產(chǎn)；酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司生產(chǎn)。

1.3 樣品采集及分組

試驗牛產(chǎn)犢后立刻頸靜脈無菌采血，每頭10mL，室溫靜置待血液完全凝固后，4℃、4 000r/min離心10min分離血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

產(chǎn)后經(jīng)獸醫(yī)診斷，將32頭奶牛分為胎衣不下組（17頭）和胎衣正常排出組（15頭）。診斷標(biāo)準(zhǔn)為產(chǎn)犢后12h內(nèi)，胎衣未排出或未完全排出，則該奶牛被判為胎衣不下。

胎衣正常排出奶牛產(chǎn)后自頸靜脈無菌采血后，采集自然脫離子宮的新鮮干凈子葉，用無菌生理鹽水沖洗殘留血跡后，放入封口袋密封，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。對胎衣不下奶牛在確診后頸靜脈再采血一次，后期血液處理方法同上，然后實施手術(shù)剝離滯留在子宮內(nèi)的胎衣，用無菌生理鹽水沖洗殘留血跡，采集子葉放入封口袋密封，置-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 奶牛主要臨床指標(biāo)觀察

觀察奶牛胎衣不下的發(fā)生率和子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率，記錄胎衣排出的時間、惡露排盡時間、首次發(fā)情時間、受孕時間等。

1.5 血清和胎盤組織中激素的檢測

檢測前將冷凍保存的子葉放入冰冷的生理鹽水中，除去血液，濾紙拭干，準(zhǔn)確稱重，放入5mL的勻漿管中，按重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水于勻漿管中，冰水浴條件下，用眼科小剪盡快剪碎組織塊，在勻漿管中充分研磨成勻漿。將制備好的10%勻漿液置于普通離心機(jī)或低溫低速離心機(jī)中，以3000r/min，離心15min，取組織上清液和冷凍保存的血清，按照試劑盒說明書檢測孕酮、雌二醇、前列腺素（PGF2α）和纖維蛋白酶原的含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SAS9.2統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用成組法、t檢驗法對試驗?zāi)膛Ｑ汉吞ケP中激素含量變化進(jìn)行處理分析。然后通過SAS9.2 統(tǒng)計軟件對各項指標(biāo)進(jìn)行差異性檢測。

2 結(jié)果

2.1 主要臨床指標(biāo)觀察結(jié)果

胎衣正常排出組的15頭奶牛，分娩后的惡露排出時間和顏色均正常，有14頭奶牛在產(chǎn)后90d內(nèi)受孕，受孕率93.3%；胎衣不下組的17頭奶牛，有4頭在產(chǎn)后90d內(nèi)受孕，其中有8頭發(fā)生明顯子宮炎癥。胎衣不下組的總受孕率為23.5%，與胎衣正常排出組相比，差異極顯著。結(jié)果見表1。

表1 奶牛產(chǎn)后主要臨床指標(biāo)觀察結(jié)果

2.2 血清和胎盤組織中孕酮、雌二醇、PGF2α及纖維蛋白溶酶原

由表2可知，胎衣不下組血清和胎盤中的孕酮含量均高于胎衣正常排出組，差異顯著（P＜0.05），且隨著時間推移含量下降。胎衣不下組血清和胎盤中雌二醇的含量均低于胎衣正常排出組，差異顯著（P＜0.05），且隨著時間推移含量下降。胎衣不下組血清和胎盤中前列腺素（PGF2α）的含量均低于胎衣正常排出組，差異顯著（P＜0.05），且隨著時間推移含量下降。胎衣不下組血清和胎盤中的纖維蛋白溶酶原含量均低于胎衣正常排出組，差異顯著（P＜0.05），且胎盤組織中的纖維蛋白酶原含量高于血清中的纖維蛋白酶原含量，差異顯著（P＜0.05）。

表2 奶牛血清和胎盤中激素含量的變化

3 討論

妊娠晚期，雌激素能夠促使子宮肌細(xì)胞收縮蛋白的增加，使子宮興奮產(chǎn)生收縮；另外，雌激素還可以誘導(dǎo)子宮肌縫隙連接蛋白connexin43的表達(dá)，促進(jìn)前列腺素的合成，增加催產(chǎn)素的受體，從而激活子宮，啟動分娩[15]。MA等[17]研究表明，羊的分娩發(fā)動是由胎兒下丘腦下部-垂體-腎上腺素引起的，分娩過程中子宮內(nèi)大量的雌激素迅速上升，而維持子宮靜息的孕激素含量下降，從而導(dǎo)致子宮被激活。在其他激素如前列腺素、催產(chǎn)素的作用下，子宮開始收縮，分娩啟動。而同樣對于牛來說，也是由胎兒啟動分娩的[18]。本試驗發(fā)現(xiàn)，胎衣不下奶牛血清中和胎盤中雌激素的含量均低于胎衣正常排出牛，這表明胎衣不下與奶牛體內(nèi)雌激素的含量較低密切相關(guān)，并且隨著奶牛在產(chǎn)后雌激素持續(xù)下降，促使了胎衣不下的發(fā)生。

孕酮是維持妊娠子宮肌靜狀態(tài)的主要激素，孕酮能夠使子宮肌層受到抑制，處于松弛狀態(tài)，阻止分娩的啟動。論士春等[13]研究表明，血漿中高水平的孕酮能夠抑制子宮的收縮，還能通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用使垂體后葉素的分泌減少，從而阻止胎衣的排出。周幫會等[19]研究表明，胎衣不下奶牛胎盤中孕酮含量極顯著地高于正常組奶牛。這都與本試驗結(jié)果相近。本試驗結(jié)果表明，胎衣不下奶牛血清和胎盤中孕酮含量顯著高于正常組，且隨著胎衣在子宮內(nèi)停留，孕酮的含量降低緩慢，從而促進(jìn)胎衣不下的形成。

前列腺素（PGF2α）常常是通過參與其他自體活性物質(zhì)、激素和神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)解而起作用，其生理作用主要是影響排卵、刺激子宮平滑肌收縮等[20]。其在奶牛繁殖方面主要應(yīng)用于同期發(fā)情、分娩引產(chǎn)和治療子宮疾病[21]，并且在小動物臨床上應(yīng)用廣泛，主要用于治療子宮蓄膿、超期妊娠、假妊娠、終止妊娠和能夠治療產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎等[22～24]。劉智喜[25]研究表明，對胎衣不下奶牛注射外源性的PGF2α能夠促進(jìn)胎衣的排出。本試驗結(jié)果中，正常組胎盤中和血清中PGF2α含量均顯著高于胎衣不下組，并且胎衣不下組奶牛在產(chǎn)犢到產(chǎn)犢后12h內(nèi)，體內(nèi)PGF2α呈現(xiàn)下降趨勢，這可能說明胎衣不下與奶牛機(jī)體內(nèi)PGF2α的含量有密切相關(guān)的聯(lián)系。

纖維蛋白溶酶原是一種血漿蛋白，主要由肝細(xì)胞產(chǎn)生。纖維蛋白溶酶原經(jīng)過纖維蛋白酶原激活因子激活，轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘睦w維蛋白溶酶。纖維蛋白溶酶可以降解纖維蛋白原，也能夠?qū)⒔饘俚鞍酌盖绑w轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘慕饘俚鞍酌竅26]。因此檢測血中纖維蛋白溶酶原的含量，可以了解體內(nèi)纖溶活動的強(qiáng)弱。中獸醫(yī)一般認(rèn)為母畜胎衣不下多由圍產(chǎn)期飼養(yǎng)不當(dāng)，管理不善，風(fēng)冷相干，致使血脈受寒，淤血郁結(jié)所致[27]。從上可知，胎衣不下是氣虛血滯癥之一，與奶牛血液流變學(xué)指標(biāo)密切相關(guān)；而纖維蛋白原是血液流變學(xué)的重要指標(biāo)之一，不但能夠通過形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)影響血漿的流動，還能促進(jìn)紅細(xì)胞聚集來影響血液黏度。黃會嶺等[28]研究表明，胎衣不下奶牛血漿中纖維蛋白酶原含量明顯高于健康組，這與本結(jié)果相似，胎衣不下奶牛組織和血清中纖維蛋白溶酶原含量顯著高于健康奶牛。因此可以使用一些活血化瘀的中藥方劑或者降低纖維蛋白溶酶原含量的藥品來預(yù)防胎衣不下。

4 小結(jié)

本研究分析表明，奶牛胎衣不下的發(fā)生與奶牛血清和胎盤中的孕酮、雌激素、前列腺素和纖維蛋白溶酶原的含量密切相關(guān)。因此，臨床上可以通過一些外源性藥物來降低體內(nèi)孕酮和纖維蛋白溶酶原含量，或者提高雌激素、前列腺素的含量來達(dá)到預(yù)防胎衣不下的目的。

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Serum and Placental Hormone Changes in Retained Placenta Cows

ZHU Yong-gang, WANG-Lei, WANG Xu-rong, ZHANG Jing-yan, CUI Dong-an, ZHANG Kai, ZHANG Kang, WANG Xue-zhi, LI Jian-xi, YANG Zhi-qiang
(Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Science of CAAS/Engineering &Technology Research Center of Traditional Chinese Veterinary Medicine of Gansu Province, Lanzhou 730050)

In order to study the change characteristics of hormone in serum and placenta of retained placenta cows and establish the prevention and treatment of retained placenta, which can elucidate the pathogenesis of the disease. this study aims to analysis the serum and placental hormone of retained placenta cows based on enzyme-linked immunosorbent method. Thirty-two serums were collected after calving, of which seventeen were cows without retained fetal membranes and fifteen were cows with retained fetal membranes. Placenta were collected after serum were collected in cows without retained fetal membranes. The venous blood and the placenta were collected after the cows with retained fetal membranes were diagnosed. The enzyme-linked immune adsorbent were used to test the hormone levels in the serum and placenta of cows with retained fetal membranes and cows without retained fetal membranes, and the testing results were analyzed. The results showed that the content of of progesterone, fibrinogen, and the prostaglandin in the serum and placenta of cows with retained fetal membranes compared with the cows without retained fetal membranes group differences significantly reduced (P＜0.05), but estradiol levels were significantly increased (P＜0.05). The hormone content in serum and placenta of cows with retained fetal membranes and cows without retained fetal membranes were tested in this experiment, which found that the morbidity of retained fetal membranes were associated with the the content changes of progesterone, estradiol ,fibrinogen and prostaglandin in serum and placental tissue, which indicates that retained fetal membranes can happen may associated with hormone secretion disorder within the body.

Retained fetal membranes; Progesterone; Estradiol; Prostaglandin F2α; Plasminogen

S858.23

A

1004-4264（2017）04-0044-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.04.012

2016-11-04

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項項目（201303040）；國家奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-37-06）。

朱永剛（1991-），男，安徽安慶人，碩士，主要從事奶牛疾病相關(guān)的研究工作。

楊志強(qiáng)（1957-），男，四川武勝人，碩士，主要從事奶牛疾病相關(guān)的研究工作。