載納米銀絲蛋白/海藻酸鈉海綿的制備及表征

陳雍， 趙朋，鄧超， 陳敬華

（江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

載納米銀絲蛋白/海藻酸鈉海綿的制備及表征

陳雍， 趙朋，鄧超， 陳敬華*

（江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

以絲蛋白（SF）和海藻酸鈉（SA）為基質(zhì)構(gòu)建新型負(fù)載納米銀生物敷料。以SF溶液為穩(wěn)定劑，采用紫外光照射法合成了納米銀，加入SA后，經(jīng)氯化鈣/乙醇/水（摩爾比，1∶71∶77）處理3 h，將上述材料潤洗凍干后得到負(fù)載納米銀的SF/SA復(fù)合海綿 （AgNPs-SF/SA）。透射電子顯微鏡（TEM）觀察顯示，合成的納米銀平均粒徑為（5.03±1.42）nm，在絲蛋白溶液中分布均勻。掃描電子顯微鏡（SEM）圖像顯示，與純絲蛋白海綿相比，AgNPs-SF/SA顯示連通的多孔結(jié)構(gòu)。SA的加入增強(qiáng)了海綿的吸水性和保水性；在SF和SA的協(xié)同作用下，AgNPs-SF/SA的水蒸氣透過率有所提高。以K-B擴(kuò)散法和菌液培養(yǎng)法測定了AgNPs-SF/SA的抗菌性，結(jié)果顯示，AgNPs-SF/SA對金黃色葡萄球菌和銅綠色假單胞菌的抗菌性優(yōu)于陽性對照AQUACEL?Ag；24 h和48 h的菌液培養(yǎng)顯示，AgNPs-SF/SA具有更持久的抗菌活性。綜上所述，AgNPs-SF/SA的物理性能和抗菌性能優(yōu)良，有望作為一種新型的抗菌生物敷料用于預(yù)防和治療創(chuàng)面感染。

生物敷料；抗菌活性；絲蛋白；海藻酸；納米銀

感染是燒創(chuàng)傷護(hù)理過程中最為常見的并發(fā)癥之一，可以導(dǎo)致微生物入侵，阻礙表皮組織的再生和修復(fù)，延遲傷口愈合，促使瘢痕形成，甚至威脅患者的生命安全[1-2]。因此，預(yù)防和治療創(chuàng)面感染始終是傷口修復(fù)的重要前提。目前，通過創(chuàng)面局部應(yīng)用廣譜抗生素來防治感染會產(chǎn)生細(xì)菌耐藥及可能存在過敏和毒性風(fēng)險，且臨床上通常將抗菌材料與棉織物復(fù)合使用，生物相容性差，不利于創(chuàng)面的修復(fù)[3-4]。因此，制備載有安全，廣譜抗菌劑的生物敷料對創(chuàng)面修復(fù)具有重要意義。

納米銀作為微生物抗菌劑具有長久的歷史，因其本身具有持久、高效、廣譜的抗菌優(yōu)點(diǎn)，在抗生素應(yīng)用具有局限性的現(xiàn)狀下受到廣泛關(guān)注[5]。由于具有獨(dú)特的小尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)，即使在低濃度下納米銀也能輕易進(jìn)入病原體發(fā)揮殺菌作用[6-8]。因此將納米銀引入以生物大分子材料為基質(zhì)的生物敷料中能夠提高敷料的抗菌性能。

絲蛋白是蠶絲經(jīng)脫膠得到的一種無生理活性的天然高分子材料，不僅來源豐富，價格低廉，而且具有良好的生物相容性，生物可降解性，能促進(jìn)細(xì)胞的吸附及增長，具有較低的炎癥反應(yīng)，其在醫(yī)用生物敷料，藥物載體等方面的研究日趨廣泛和深入[9-10]。并且絲蛋白能作為穩(wěn)定劑，分散劑及催化劑在光照條件下還原納米銀，為納米銀的引入提供了簡便綠色的方法[11]。但是一些研究表明用乙醇處理的絲蛋白海綿存在較高疏水性[12]，凍干的絲蛋白海綿機(jī)械性能差[13-14]，限制了其在醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)展。海藻酸鈉應(yīng)用于醫(yī)用敷料具有高吸濕性，高透氧性及良好的生物降解性及生物相容性，海藻酸鈉的引入能改善復(fù)合材料的機(jī)械物理性能，以滿足復(fù)合材料在醫(yī)學(xué)敷料方面的應(yīng)用[15]。

1 材料與方法

1.1 原料及所用儀器

蠶繭，購于安徽兄弟藥業(yè)有限公司；海藻酸鈉（CP，相對分子質(zhì)量300 000），國藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑有限公司；水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（M·H瓊脂培養(yǎng)基），上海科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；水解酪蛋白肉湯培養(yǎng)基（M·H肉湯培養(yǎng)基），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；金黃色葡萄球菌和銅綠色假單胞菌，無錫市第三人民醫(yī)院檢測科提供；其他試劑均購自國藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑有限公司。AQUACEL?Ag型銀離子敷料購自康維德（中國）醫(yī)療用品有限公司。

UV-1800型紫外可見分光光度計，島津國際貿(mào)易（上海）有限公司產(chǎn)品；JEM-2100型透射電子顯微鏡，日本JEOL公司產(chǎn)品；S-4800型掃描電子顯微鏡，日本日立儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 絲蛋白溶液的制備 稱取10 g剪碎的蠶繭，置于煮沸的碳酸鈉（0.02 mol/L）溶液45 min，用去離子水洗凈，烘干，得到干燥脫膠的絲素蛋白。將干燥脫膠的絲素蛋白溶解于氯化鈣/乙醇/水（摩爾比= 1∶2∶8）溶液，70℃水浴加熱1 h，振蕩，使絲蛋白充分溶解，待溶液冷卻后，12 000 r/min離心20 min，除去不溶雜質(zhì)，透析3 d，得到干凈脫膠絲蛋白溶液。在此方法下獲得的絲蛋白，其數(shù)均分子量為110 000[16]。

1.2.2 納米銀的合成 將0.68 g/dL硝酸銀按體積比1∶4加入1.5 g/dL絲蛋白溶液中，置于365 nm紫外燈下反應(yīng)6 h，即得到含納米銀的絲蛋白溶液。

1.2.3 載納米銀絲蛋白/海藻酸鈉復(fù)合海綿的制備3%海藻酸鈉溶液與上述含納米銀絲蛋白溶液按體積比1∶1混合，將共混溶液除去氣泡注入模具中，置于-20℃中預(yù)凍2 h，-80℃過夜，凍干。取出凍干樣品，用氯化鈣/乙醇/水（摩爾比=1∶71∶77）溶液浸泡處理，緩慢振蕩3 h，用去離子水洗凈，凍干，得到含納米銀絲蛋白/海藻酸鈉復(fù)合海綿。本實驗中，0.006 g海藻酸鈉與9.36×10-7mol Ca2+發(fā)生交聯(lián)，由此計算得到海藻酸鈉羧基與Ca2+的交聯(lián)度近似為6%。

1.2.4 納米銀及復(fù)合海綿的結(jié)構(gòu)表征 取2 mL載納米銀絲蛋白溶液置于石英池中，用紫外-可見分光光度計在200～900 nm范圍內(nèi)掃描，記錄圖譜。用JEM-2100型透射電子顯微鏡觀察粒子粒徑與形態(tài)。用S-4800型場發(fā)射掃描電子顯微鏡在加速電壓1.0 kV條件下觀察材料形貌和納米銀分布。

所以，運(yùn)用數(shù)學(xué)史應(yīng)該有中西數(shù)學(xué)價值觀以及社會政治、文化差異的介紹與對比。其中，最重要的是讓學(xué)生正確認(rèn)識我們民族的數(shù)學(xué)在世界數(shù)學(xué)發(fā)展中的地位，并了解其配合西方數(shù)學(xué)的過程中發(fā)生了怎樣的改變，思考今后應(yīng)如何更好發(fā)展，只有這樣才能更好地認(rèn)識中國傳統(tǒng)數(shù)學(xué)的形式、價值觀，促進(jìn)其對所學(xué)數(shù)學(xué)的理解和認(rèn)識。

1.2.5 復(fù)合海綿的吸水性、保水率及水蒸氣透過率表征

1）平衡吸水倍率（g/g）[17]：干燥海綿樣品（W0）在磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）浸泡30 min，待其完全溶脹后，輕輕拭去樣品表面液體，稱重（Wt）。樣品平衡吸水倍率按式（1）計算：

2）保水率[18]：將完全溶脹于磷酸鹽緩沖液（pH= 7.4）的樣品（Ws）置于有濾網(wǎng)的離心管內(nèi)，500 r/min離心3 min，稱重（W）。樣品保水率按式（2）計算：

3）水蒸氣透過率（WVTR）[19]：參照美國標(biāo)準(zhǔn)局公布的ASTME96—00方法，將干燥樣品覆蓋于裝有10 mL去離子水的燒杯杯口，密封杯口邊緣防止水汽損失，稱重（W0）然后置于干燥器中保持溫度37℃，相對濕度79%。以無覆蓋物的燒杯為空白對照，24 h后取出稱重（Wt），測燒杯表面積A。樣品水蒸氣透過率按式（3）計算：

1.2.6 復(fù)合敷料抗菌性能測定

1）抑菌圈法定性分析。取銅綠色假單胞菌和金黃色葡萄球菌于M·H肉湯培養(yǎng)基中復(fù)蘇，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中緩慢振蕩（120 r/min），培養(yǎng)過夜。然后用M·H肉湯培養(yǎng)基將細(xì)菌懸浮液稀釋至600 nm處OD值為0.08～0.1。用滅菌后的棉球蘸取菌液，反復(fù)均勻的涂布于M·H瓊脂培養(yǎng)基上，用鑷子輕輕將直徑1.0 cm的海綿樣品貼在帶菌培養(yǎng)基平板上，37℃孵箱中培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈大小。以含銀商品敷料AQUACEL?Ag作為陽性對照。用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈寬度，根據(jù)國標(biāo)GB/T 20944.1—2007抗菌效果評價[20]計算

上式中，H為抑菌圈寬度；D為抑菌帶外徑的平均值（mm）；d為樣品直徑（mm）。

2）試管法定量分析。取銅綠色假單胞菌和金黃色葡萄球菌于肉湯培養(yǎng)基中復(fù)蘇，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中緩慢振蕩（120 r/min），培養(yǎng)過夜。然后用M· H肉湯培養(yǎng)基將細(xì)菌懸浮液稀釋至600 nm處OD值0.07，將直徑為1.0 cm的海綿樣品浸沒在裝有2 mL細(xì)菌懸浮液的滅菌試管中，在37℃孵箱中培養(yǎng)24 h，測細(xì)菌懸浮液OD值。以含銀商品敷料AQUACEL?Ag作為陽性對照。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米銀的表征

2.1.1 紫外可見分光光度計（UV-vis）測定 如圖1所示，在絲蛋白溶液中，納米銀在波長430～450 nm產(chǎn)生明顯特征吸收峰，并且隨著時間延長，納米銀吸收強(qiáng)度增強(qiáng)，表明隨著反應(yīng)時間的延長，越來越多的銀被還原成的單質(zhì)銀聚集成納米銀，溶液中的銀主要以納米粒子的形式存在。該結(jié)果表明在絲蛋白溶液中利用光化學(xué)還原反應(yīng)成功合成納米銀。Xiang等[11]在絲蛋白溶液中合成穩(wěn)定的納米銀，能在避光或光照下保存30 d，絲蛋白可以作為納米銀合成的良好穩(wěn)定劑，分散劑及催化劑。納米銀可在自然光照反應(yīng)合成，但是自然光照條件不易控制，紫外燈照射條件易控制，反應(yīng)效率高，能快速合成納米銀[11，21]。

圖1 納米銀的紫外-可見光譜圖Fig.1 UV-Vis absorption spectra of nano-silver in the SF solution

2.1.2 透射電子顯微鏡（TEM）觀察 如圖2所示，所得納米銀近似球形，平均粒徑（5.03±1.42）nm，銀均勻分散在絲蛋白溶液中，無團(tuán)聚現(xiàn)象。在反應(yīng)過程中絲蛋白可以作為納米銀合成的良好穩(wěn)定劑，分散劑及催化劑，反應(yīng)過程不需添加其他任何化學(xué)物質(zhì)，減少反應(yīng)過程中其他物質(zhì)的形成與干擾。形成的納米銀粒徑小，這有利于提高其與細(xì)胞的有效接觸面積，使其發(fā)揮更強(qiáng)的抗菌性能[7，22]。

圖2 絲蛋白溶液中納米銀的TEM圖和粒徑大小分布圖Fig.2 TEM image of the AgNPs in SF solution and distribution of particle size

2.2 復(fù)合海綿的形貌觀察

由圖3可知，交聯(lián)后的復(fù)合海綿樣品的微觀結(jié)構(gòu)呈規(guī)則均一的多孔結(jié)構(gòu)，相較于純絲蛋白海綿樣品，孔徑增大且排列更加規(guī)則?？讖降脑龃筇岣吡瞬牧系奈院屯笟庑?，同時有利于細(xì)胞的吸附和納米銀的釋放，增加了納米銀同細(xì)菌的接觸反應(yīng)起到抗菌效果，這為材料應(yīng)用于生物敷料提供了有利條件。

2.3 海綿樣品的吸水性、保水性及水蒸氣透過率性能

圖3 樣品SEM圖Fig.3 SEM images of sponges

由圖4（a）可知各個海綿樣品均具有良好的吸水性能，且實驗過程復(fù)合海綿能在極短時間內(nèi)達(dá)到溶脹平衡。純絲蛋白本身具有較高的溶脹性能，溶脹平衡時吸水量是本身材料的22.7倍，復(fù)合海綿溶脹平衡的吸水量達(dá)到材料本身39.7倍，材料的吸水性明顯得到提高。海藻酸鈉的引入增加了材料的親水基團(tuán)。其次，材料的孔徑也隨之增大，使得吸水性增強(qiáng)，能有效吸取傷口滲出液，為創(chuàng)面修復(fù)維持理想環(huán)境，同時減少感染風(fēng)險。圖4（b）顯示復(fù)合海綿的保水率較純絲蛋白保水率有所提高，接近純海藻酸鈉保水率，親水基團(tuán)的增加及海藻酸鈉的加入使海綿成規(guī)則片狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，提高了樣品的儲水能力。圖4（c）結(jié)果表明復(fù)合海綿的水蒸氣透過率均高于單組份海綿，較空白對照降低323.12 g/（m2·d）。避免了水蒸氣的過度損失造成傷口過分干燥，同時也避免大量滲出液積累延緩傷口愈合，為創(chuàng)面提供了一個相對濕潤環(huán)境。

圖4 海綿樣品的物化性能Fig.4 PropertiesofhomogenousSF，AgNPs-SF/SA composite and homogenous SA sponges

2.4 抑菌性能測定

金黃色葡萄球菌和銅綠色假單胞菌是傷口感染的常見革蘭氏陽性球菌和革蘭氏陰性桿菌。由圖5可見，復(fù)合海綿周圍形成明顯抑菌圈，對金黃色葡萄球菌和銅綠色假單胞菌的抑菌帶寬度分別為（2.51±0.14）mm、（1.82±0.15）mm，未添加硝酸銀的絲蛋白/海藻酸鈉復(fù)合海綿周圍無明顯抑菌圈。根據(jù)國標(biāo)GB/T 20944.1—2007抗菌效果評價[20]，結(jié)果表明AgNPs-SF/SA復(fù)合敷料對金黃色葡萄球菌和銅綠色假單胞菌的抗菌效果好。

圖5 平板法測定海綿的抗菌性能比較圖Fig.5 Antimicrobial properties against S.aureus and P. aeruginosa as evaluated by the Kirby-Bauer method

圖6（a）與（b）分別為24 h時浸有樣品與對照組的細(xì)菌生長情況圖，圖片顯示AgNPs-SF/SA復(fù)合樣品浸沒的細(xì)菌懸浮液顏色清亮，表明很少細(xì)菌繁殖，空白對照呈渾濁狀態(tài)，表明細(xì)菌生長良好，與平板法所得結(jié)果相應(yīng)。圖6（c）與（d）分別為各時間點(diǎn)所對應(yīng)的OD值，結(jié)果顯示在12 h時樣品浸沒的金黃色葡萄球菌和銅綠色假單胞菌細(xì)菌懸浮液OD值分別為0.13和0.10，均與陽性對照無顯著性差異，與陰性對照具有顯著性差異。在12 h以后陽性對照浸沒的金黃色葡萄球菌及銅綠色假單胞菌細(xì)菌懸浮液OD值均顯著上升，在24 h時分別達(dá)到1.15和1.13，樣品浸沒的銅綠色假單胞菌懸浮液OD值上升至0.7，由此可知樣品對金黃色葡萄球菌和銅綠色假單胞菌均具有高效、持久的抗菌效果，抗菌效果均優(yōu)于陽性對照，且對金黃色葡萄球菌的抗菌效果優(yōu)于銅綠色假單胞菌。

圖6 24 h金黃色葡萄球菌與銅綠色假單胞菌懸浮液圖及不同時間點(diǎn)金黃色葡萄球菌和銅綠色假單胞菌懸浮液OD值Fig.6 Photos of S.aureus and P.aeruginosa solutions after the growth for 24 h and the time courses of OD valuesofS.aureusand P.aeruginosa solutions

3 結(jié)語

本研究中利用光學(xué)還原法在可溶性絲蛋白溶液中合成納米銀，并通過氯化鈣/乙醇/水交聯(lián)得到載納米銀絲蛋白/海藻酸鈉復(fù)合海綿。納米銀在絲蛋白溶液中分散性好，無團(tuán)聚現(xiàn)象，平均粒徑在5.03 nm，所得到的該復(fù)合材料具有均一的多孔結(jié)構(gòu)，且具有較高的吸水性和保水率，水蒸氣透過率良好，對典型的創(chuàng)面感染細(xì)菌金黃色葡萄球菌及銅綠色假單胞菌敏感性強(qiáng)，抑菌效果良好，有望成為新型的納米銀抗菌生物敷料。

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Preparation and Characterization of Nano-Silver Loaded Fibroin/Alginate Sponge

CHEN Yong， ZHAO Peng， DENG Chao， CHEN Jinghua*
（School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

This study aimed to fabricate a novel Ag nano-particles（AgNPs）loaded biologic dressing based on silk fibroin（SF）and sodium alginate（SA）.AgNPs were first synthesized in the stabilizer，SF solution，under UV irradiation，and after the addition of SA，were then treated by CaCl2/ethanol /water（molar ratio，1∶71∶77）for 3 h.After rinsing and freeze-drying，AgNPs loaded SF/SA composite sponge（AgNPs-SF/SA）was obtained.Transmission electron microscopy observation（TEM）showed that AgNPs were evenly distributed in the SF solution with a mean diameter of 5.03 nm.Scanning electron microscopy（SEM）images showed that compared with pure SF sponge，AgNPs-SF/SA had a linked porous structure.Addition of SA improved the water absorption and retention ability of the sponge and the synergistic effect of SF and SA increased the water vaportransmission rate.K-B disk diffusion and bacterial solution culture methods indicated that AgNPs-SF/SA possessed a higher and more continuous anti-bacterial potential than the positive control，AQUACEL?Ag，against P.aeruginosa and S.aureus.In conclusion，the excellent physical and anti-bacterial properties demonstrated that AgNPs-SF/SA could be a novel anti-bacterial biologic dressing for prevention and treatment of wound infection.

biologic dressing，anti-bacteria potential，silk fibroin，alginate，nano-silver

R 318.08

A

1673—1689（2017）02—0200—07

2015-02-08

江蘇省產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合創(chuàng)新資金-前瞻性聯(lián)合研究項目（BY2014023-170）。

*通信作者：陳敬華（1971—），男，湖北黃石人，理學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事生物大分子和生物功能材料的研究。

E-mail：jhchenwhut@126.com

陳雍，趙朋，鄧超，等.載納米銀絲蛋白/海藻酸鈉海綿的制備及表征[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（02）：200-206.