生物酶法降解煙梗末中果膠的研究

許春平， 劉遠(yuǎn)上， 郝 輝， 王文領(lǐng)， 孫斯文，馬宇平*

（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，河南 鄭州450016；3.河南卷煙工業(yè)煙草薄片有限公司，河南 許昌461100）

生物酶法降解煙梗末中果膠的研究

許春平1， 劉遠(yuǎn)上1， 郝 輝2， 王文領(lǐng)3， 孫斯文1，馬宇平*2

（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，河南 鄭州450016；3.河南卷煙工業(yè)煙草薄片有限公司，河南 許昌461100）

通過(guò)青霉產(chǎn)果膠酶降低煙梗末中的果膠的含量，從而提高梗末作為原料薄片工藝中的使用性能。首先通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定了酶解的最佳條件為加酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，料液比1 g∶3 mL，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間2 h，果膠酶的最大降解率為38.92%。然后經(jīng)熱重分析表明，梗末經(jīng)果膠酶降解后，最后的殘重從24.46%下降至9.84%，說(shuō)明酶解后的梗末的燃燒性得到提升。最后，利用熱裂解-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析酶解前后梗末的熱裂解產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)酶解后裂解產(chǎn)中的乙酸含量降低，香味物質(zhì)吡咯含量升高，這將有助于改善煙草薄片的吸食口感，本研究中為提高造紙法煙草薄片的品質(zhì)提供了一個(gè)新的方法。

果膠降解；生物酶法；煙草薄片；果膠酶

煙草薄片是以廢棄的煙梗、煙末、煙片等煙草質(zhì)原料，通過(guò)物理和化學(xué)方法經(jīng)重組制成煙葉的薄片。造紙法煙草薄片以其密度小、填充值高、柔韌性和耐加工性好、焦油釋放量低、可塑性強(qiáng)的特點(diǎn)，因此，造紙法成為目前國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)煙草薄片的主要方法[1]。有研究表明，在卷煙中添加煙草薄片能夠減少卷煙的焦油含量[2]，所以在卷煙中添加薄片絲成為卷煙降焦減害的一項(xiàng)重要手段。造紙法煙草薄片生產(chǎn)主要分為三個(gè)過(guò)程：萃取濃縮、制漿抄造、涂布干燥[3]，在這個(gè)過(guò)程中能夠?qū)崿F(xiàn)人為地調(diào)控?zé)煵荼∑奈锢砘瘜W(xué)性質(zhì)。

果膠是煙草及其他植物細(xì)胞壁的組成成分之一，是一類比較復(fù)雜的多糖，主要由D-半乳糖醛酸和D-半乳糖醛酸甲酯以α-1，4苷鍵連成的直鏈[4]。果膠在煙草制品中的含量為5%～13%[5]。閆克玉等[6]研究表明，果膠含量隨著煙葉部位的升高、顏色的加深、成熟度的提高、厚度的增加而增加，隨等級(jí)的降低而降低。果膠質(zhì)是親水膠體，對(duì)煙葉的吸濕性和彈性起一定作用，但果膠質(zhì)對(duì)煙草品質(zhì)不利，分解會(huì)產(chǎn)生甲醇[4]。另外，果膠在煙葉醇化過(guò)程中產(chǎn)生多達(dá)1.2%～1.5%的乙酸，會(huì)產(chǎn)生嗆咳、辛辣灼燒等刺激性氣味，對(duì)吸食健康不利[7]。去除煙草制品中的果膠逐漸受到行業(yè)研究人員的重視。曹茜等[8]用超聲波輔助法以草酸銨為浸提液去除煙梗中的果膠，去除率達(dá)到13.7%。而利用生物產(chǎn)酶法降解果膠的方法比較少。由于梗末呈粉末狀便于利用生物酶法處理，所以本實(shí)驗(yàn)中以青霉菌產(chǎn)果膠酶來(lái)降解造紙法薄片生產(chǎn)線上的二號(hào)擠干機(jī)出口梗末中的果膠，然后對(duì)其清除果膠效果進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

二號(hào)擠干機(jī)出口的梗末，由河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供。

無(wú)水乙醇，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；濃硫酸，鹽酸，2 mol/L NaOH，開(kāi)封市芳晶化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；果膠粉，上海華興化工有限公司產(chǎn)品；D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品 （97%），Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；0.15%咔唑溶液，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所提供等。

BS200S型電子分析天平，北京賽多利斯天平有限公司產(chǎn)品；UV-17001C型紫外分光光度計(jì)，上海鳳凰光學(xué)科儀有限公司產(chǎn)品；HH-4型電熱數(shù)字恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司產(chǎn)品；DSX-280A型不銹鋼手提式滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；熱重分析儀，美國(guó)TA公司產(chǎn)品；CDS PYROPROBE 2000型裂解儀，上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 果膠酶的獲得 果膠酶來(lái)自作者所在實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化出的微紫青霉（Penicillium janthinellum）sw09產(chǎn)出的果膠酶，即深層液體發(fā)酵培養(yǎng)3 d，離心去除菌絲體，發(fā)酵液再經(jīng)過(guò)超濾濃縮，冷凍干燥成酶粉，酶活力經(jīng)測(cè)定約為20 000 U/g，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，酵母浸粉3 g/L，KH2PO41 g/L，果膠粉2 g/L；pH 5。

1.2.2 梗末中果膠含量的檢測(cè) 根據(jù)楊海健[9]優(yōu)化的咔唑比色法作為測(cè)定梗末果膠含量的方法。其原理是果膠降解生成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸與咔唑產(chǎn)生顯色反應(yīng)，其含量在一定范圍內(nèi)與其吸光度呈線性關(guān)系，繪制半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線得到方程：y= 0.008 8x+0.009 8，R2=0.999 1。根據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比測(cè)定出梗末酶解前后的果膠含量。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)考查各因素對(duì)果膠酶降解果膠效果的影響 將梗末烘干，粉碎，取10 g梗末，加水設(shè)置不同的料液比（1 g∶1 mL、1 g∶3 mL、1 g∶5 mL、1 g∶7 mL、1 g∶9 mL），加入果膠酶0.5 g，40℃下酶解2 h，按下式（1）計(jì)算測(cè)定果膠降解率，根據(jù)結(jié)果確定最適料液比。然后根據(jù)得出的最適料液比，設(shè)置不同的果膠酶加入量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、2%、3%、4%、5%、6%），40℃下酶解2 h，得出最適的酶液加入量。由得出的最適料液比和果膠酶加入量，設(shè)置不同的酶解溫度（30、35、40、45、50、55℃），酶解2 h，得出最適的酶解溫度，相同方法得出最適的酶解時(shí)間。

（1）式中R為果膠降解率；W1為酶解前煙梗末中果膠質(zhì)量；W2為酶解后煙梗末中果膠質(zhì)量。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化果膠酶降解梗末果膠的條件根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)得出的條件設(shè)置不同的水平，以果膠降解率為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，選用L9（34）正交表對(duì)果膠酶降解梗末果膠的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Table of the orthogonal factor levels

1.2.5 梗末的熱重分析 用果膠酶降解梗末，用熱重分析儀分析煙梗末熱重變化，并設(shè)置空白對(duì)照組。溫度從室溫以10℃/min的速度上升至900℃。

1.2.6 果膠酶降解梗末果膠對(duì)其熱裂解產(chǎn)物的影響 利用熱裂解模擬煙草梗末在卷煙中燃燒的情況，并對(duì)其裂解產(chǎn)物進(jìn)行分析。根據(jù)賀磊[10]等的研究，煙草薄片在600℃就發(fā)生了熱分解。另外，周順[11]等的研究結(jié)果指出果膠在無(wú)氧環(huán)境下的熱解溫度為121℃。綜合考慮，這次實(shí)驗(yàn)的熱裂解溫度設(shè)置為600℃，并進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 煙梗末中果膠酶解工藝的優(yōu)化

2.1.1 單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 加酶量、酶解時(shí)間、料液比、酶解溫度對(duì)果膠酶降解梗末中果膠的影響結(jié)果見(jiàn)圖1?？芍?，果膠的降解率在一定范圍內(nèi)隨加酶量的增加而增大，在加酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到4%以后果膠的降解率已經(jīng)上升不明顯，所以，確定最適加酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%。酶解時(shí)間越長(zhǎng)果膠酶降解越充分，加酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時(shí)，酶解2 h后果膠降解率已不在上升，這可能與酶的活力和用量有關(guān)。其他條件一定，料液比在1 g∶3 mL時(shí)，有最大的降解率，這是因?yàn)榱弦罕忍∶笩o(wú)法與之充分混合，料液比太大會(huì)使酶的濃度太低，都會(huì)影響果膠的降解。酶都會(huì)有其最適反應(yīng)溫度，當(dāng)溫度為50℃時(shí)，果膠的降解率達(dá)到最高，說(shuō)明此溫度下酶的活力最好。

圖1 4種單因素對(duì)果膠降解的影響Fig.1 Effect of four variables on pectin degradation

2.1.2 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素時(shí)間得出的加酶量、酶解時(shí)間、料液比、酶解溫度最適條件，設(shè)計(jì)水平因素，用L9（34）表對(duì)果膠酶降解梗末中果膠的條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 青霉產(chǎn)果膠酶降解梗末果膠的正交試驗(yàn)Table 2 Orthogonal test of tobacco stem end pectin degradation by pectinase from P.janthinellum

續(xù)表2

進(jìn)行極差分析可知，四種因素對(duì)果膠酶降解率的影響順序?yàn)椋杭用噶浚久附鉁囟龋玖弦罕龋久附鈺r(shí)間。得出的最優(yōu)條件組合為A3B2C3D1，即加酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，料液比1 g∶3 mL，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間2 h，該條件下果膠的降解率最高達(dá)到38.92%。

2.1.3 熱失重實(shí)驗(yàn) 將梗末在最優(yōu)條件下酶處理，抽濾烘干，粉碎，取粉末用熱重分析儀分析，空白組用蒸餾水處理，其他條件與加酶實(shí)驗(yàn)組一致。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 梗末酶解前后的熱重對(duì)比分析Fig.2 Thermogravimetric comparison of stem end before and after enzymatic hydrolysis

分析可知，加酶組和空白組加熱失重趨勢(shì)基本一致，加酶組和空白組梗末在347.6℃和325.6℃失重速率最大。根據(jù)周順[11]等的研究，果膠較纖維素和淀粉的燃燒能力較差，而空白組最后的殘重為24.46%，加酶組經(jīng)降解果膠后的殘重為9.84%，與之實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，也就證明了梗末經(jīng)青霉產(chǎn)酶降解果膠后燃燒性得到了提升。

2.1.4 梗末的熱裂解實(shí)驗(yàn) 取適量的梗末，在正交實(shí)驗(yàn)得出的最優(yōu)條件下（加酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，料液比1 g∶3 mL，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間2 h）處理，抽濾，蒸餾水沖洗兩次，烘干，再次粉碎后，制樣，上熱裂解-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（PY-GC/MS）分析其裂解產(chǎn)物。對(duì)照組用等量的蒸餾水處理，其他條件與實(shí)驗(yàn)組一致。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次平行實(shí)驗(yàn)，得出數(shù)據(jù)取平均值，并對(duì)匹配度大于80%的物質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表3。分析可知，酶解前后梗末熱裂解產(chǎn)物的種類和含量并無(wú)明顯差異，有明顯差異的主要集中在小分子范圍，其中丙醇、乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯下降，丁烷、羥基丙酮、甲基吡咯質(zhì)量分?jǐn)?shù)有明顯上升。果膠熱裂解后會(huì)產(chǎn)生乙酸[7]，因此果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)多會(huì)增加煙草危害，而用青霉所產(chǎn)果膠酶處理后，梗末熱裂解產(chǎn)物中乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯降低，這是果膠酶能加速梗末內(nèi)果膠降解，果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低所導(dǎo)致的。另外，梗末經(jīng)酶處理后，酚類物質(zhì)如苯酚、間甲酚、2-乙基-5-甲基苯酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)酶解后含量有明顯提高。而烯烴類物質(zhì)，如4-環(huán)戊烯-1，3-二酮、2，5-二甲基-2，4-己二烯、苯乙烯、2，4-二甲基苯乙烯、3-甲基吲哚則明顯減少。新增加的物質(zhì)有吡咯、2-乙?；秽?，3-二甲基-1-環(huán)己烯、4-甲基愈創(chuàng)木酚、正癸烯，其中吡咯質(zhì)量分?jǐn)?shù)較多，而吡咯具有甜果香味，有助于增加卷煙的香味。

表3 梗末酶解前后熱裂解產(chǎn)物對(duì)比Table 3 Pyrolysis products of stem end before and after enzymatic hydrolysis

續(xù)表3

3 結(jié)語(yǔ)

本課題試驗(yàn)中用青霉產(chǎn)果膠酶降解梗末中的果膠，通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了果膠酶酶解的最佳條件，使得梗末中的果膠降解率達(dá)到38.92%。此外，實(shí)驗(yàn)中還進(jìn)行了熱重和熱裂解實(shí)驗(yàn)，證明了梗末經(jīng)青霉產(chǎn)酶果膠酶酶解果膠后，燃燒性能得到提升，而且酶解后梗末在燃燒后，產(chǎn)物中乙酸的含量下降，吡咯等香味植物增加，這有利用提高煙草薄片的吸食口感。綜上所述，利用青霉產(chǎn)果膠酶降解梗末果膠，方法簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)單，而且能夠有效降低梗末中的果膠，提高煙草薄片的品質(zhì)，有很好的工業(yè)化應(yīng)用前景。

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Enzymatic Degradation of Pectin in Tobacco Stem End

XU Chunping1， LIU Yuanshang1， HAO Hui2， WANG Wenling3， SUN Siwen1， MA Yuping*2
（1.College of Food and Biology Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China；2.Technical Center of China Tobacco Henan Industrial Co.Ltd，Zhengzhou 450016，China；3.Henan Cigarette Industry Tobacco Sheet Co.Ltd，Xuchang 461100，China）

This study aimed to degrade the pectin in the tobacco stem end by pectinase from Penicillium and improve its usability as raw material for the reconstituted tobacco.Optimal degradation parameters obtained by the orthogonal method were enzyme dosage 0.6 g，solid/liquid ratio 1∶3，reaction temperature 50℃and time 2 h，which resulted in a maximum degradation rate of 38.51%.Thermogravimetric analysis showed that the residual weight of tobacco stem end was decreased from 24.46%to 9.84%after enzymolysis，indicating that its burning capacity was improved.Pyrolysis-GC/MS analysis found that the content of acetic acid in the smoke was decreased and pyrrole was increased，which would benefit the smoke taste.This study provided a new method to improve the quality of reconstituted tobacco.

pectin degradation，biological enzyme method，reconstituted tobacco，pectinase

S 572；Q 539+.8

A

1673—1689（2017）02—0194—06

2015-04-22

河南中煙科技有限責(zé)任有限公司科研項(xiàng)目。

許春平（1977—），男，河南焦作人，工學(xué)博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事生物催化與煙草工程研究。

E-mail：xuchunping05@163.com

*通信作者：馬宇平（1965—），男，河南許昌人，工學(xué)碩士，研究員，主要從事煙草產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和煙草化學(xué)的研究。E-mail：mayp@mail.dihao.cn

許春平，劉遠(yuǎn)上，郝輝，等.生物酶法降解煙梗末中果膠的研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（02）：194-199.