敲除pknG提高谷氨酸棒桿菌L-谷氨酸和GABA產(chǎn)量

王楠楠， 倪亞蘭， 史 鋒*

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122；3.江南大學(xué) 食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無(wú)錫214122）

敲除pknG提高谷氨酸棒桿菌L-谷氨酸和GABA產(chǎn)量

王楠楠1，2，3， 倪亞蘭1，2，3， 史 鋒*1，2，3

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122；3.江南大學(xué) 食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無(wú)錫214122）

γ-氨基丁酸（GABA）具有多種生理功能，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)。在谷氨酸棒桿菌ATCC13032中表達(dá)來(lái)自短乳桿菌的兩個(gè)谷氨酸脫羧酶（GAD）編碼基因gadB1、gadB2，可將其自身積累的L-谷氨酸有效轉(zhuǎn)變成GABA。為了進(jìn)一步提高GABA產(chǎn)量，首先在ATCC13032中敲除了絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PknG的編碼基因pknG，以提高GABA的前體物質(zhì)L-谷氨酸的供應(yīng)，然后將GAD表達(dá)質(zhì)粒pJYW-4-gadB1-gadB2轉(zhuǎn)入pknG敲除菌株和ATCC13032中，構(gòu)建出重組菌SNW203和SNW200，最后對(duì)兩個(gè)重組菌進(jìn)行上罐發(fā)酵。結(jié)果表明：相對(duì)于SNW200，菌株SNW203的L-谷氨酸和GABA產(chǎn)量都有所提高。發(fā)酵72 h后，GABA產(chǎn)量為（30.2±0.3）g/L，相對(duì)于SNW200提高了55.4%，L-谷氨酸和GABA的總摩爾濃度為0.3 mol/L，提高了36.4%。這說(shuō)明敲除pknG能夠促進(jìn)重組谷氨酸棒桿菌的L-谷氨酸和GABA生物合成。

γ-氨基丁酸；谷氨酸棒桿菌；pknG基因

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有降血壓、鎮(zhèn)靜安神[1]、健肝利腎、調(diào)節(jié)激素分泌[2]、抑制癌癥等功能。因此，GABA作為一種功能性因子被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)。GABA是由谷氨酸脫羧酶（Glutamate decarboxylase，GAD）催化L-谷氨酸發(fā)生α-脫羧反應(yīng)生成的。幾種細(xì)菌GAD基因已被確定，比如大腸桿菌 （Escherichia coli）和乳酸菌 （Lactic acid bacteria，LAB）。LAB是對(duì)人類和動(dòng)物有益的益生菌群，因此是最適合生產(chǎn)GABA的微生物[3]。然而，通過(guò)LAB生產(chǎn)GABA需要添加L-谷氨酸作為前體物質(zhì)，并且LAB的培養(yǎng)需要昂貴的氮源。

谷氨酸棒桿菌 （Corynebacterium glutamicum），是一種好氧型的、非致病革蘭氏陽(yáng)性菌，它是一種重要的工業(yè)微生物，用來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸和其它氨基酸[4]，及其它各種有機(jī)酸[5]。C.glutamicum中不存在GAD基因，在簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基中就能生長(zhǎng)，相對(duì)于LAB的培養(yǎng)，成本很低。本課題組前期在C.glutamicum ATCC13032共表達(dá)了兩個(gè)GAD基因（gadB1和gadB2），搖瓶發(fā)酵84 h時(shí)，GABA產(chǎn)量達(dá)到了（18.7±2.1）g/L[6]。L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為GABA的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了0.60 mol/mol。為了進(jìn)一步提高GABA的產(chǎn)量，作為GABA的唯一的前體物質(zhì)L-谷氨酸的合成必須加強(qiáng)。

C.glutamicum中，L-谷氨酸是由谷氨酸脫氫酶（Glutamate dehydrogenase，GDH）催化α-酮戊二酸（α-Ketoglutarate，α-KG）直接合成的，但是α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體 （α-Ketoglutarate dehydrogenase complex，ODHC）也會(huì)催化α-KG生成琥珀酰輔酶A，因此減少了L-谷氨酸合成的代謝流。而pknG會(huì)影響ODHC的活性，具體作用機(jī)制如圖1。

圖1 ODHC的亞基組成和OdhI、PknG對(duì)ODHC活性的調(diào)控Fig.1 ODHC subunits and the regulation of ODHC activity by OdhI and PknG

ODHC由三個(gè)亞基（圖1）組成：α-酮戊二酸脫氫酶 （E1亞基，OdhA）、二氫硫辛酰琥珀酰轉(zhuǎn)移酶（E2亞基，AceF）、二氫硫辛酸脫氫酶（E3亞基，Lpd）[7]。OdhI（α-酮戊二酸脫氫酶抑制劑）是E1亞基OdhA的一個(gè)抑制蛋白質(zhì)，非磷酸化的OdhI可以與OdhA相互作用，從而抑制ODHC的活性。而絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PknG催化OdhI磷酸化而使OdhI失活[8]，所以敲除PknG的編碼基因pknG會(huì)降低ODHC的活性，從而有利于L-谷氨酸的合成。為此對(duì)pknG基因進(jìn)行敲除，研究它對(duì)重組菌GABA及其前體物質(zhì)L-谷氨酸合成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物 本研究中用到的菌株和質(zhì)粒見表1，引物見表2。

1.1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

1）培養(yǎng)E.coli時(shí)均用LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉10；篩選轉(zhuǎn)化子需加入30 mg/L卡那霉素。

表1 本研究中所使用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids in this research

表2 本研究中用到的引物Table 2 Primers in this research

2）C.glutamicum用LBG培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10，葡萄糖5。

3）C.glutamicum感受態(tài)培養(yǎng)基 （g/L）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，吐溫80 1，甘氨酸30。

4）C.glutamicum電轉(zhuǎn)化恢復(fù)培養(yǎng)基LBHIS（g/ L）：酵母膏2.5，蛋白胨5，氯化鈉5，腦心浸液18.5，山梨醇91；篩選轉(zhuǎn)化子需加入30 mg/L卡那霉素或者15 mg/L氯霉素。

5）C.glutamicum工程菌發(fā)酵種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 25，玉米漿 30，尿素 8，K2HPO4·3H2O 1，MgSO40.2；卡那霉素30 mg/L；pH 7.2。

6）C.glutamicum工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖100，玉米漿2，尿素4，K2HPO4·3H2O 2，MgSO40.4，MnSO4·7H2O 0.2，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.29；卡那霉素30 mg/L，pH 7.2。

1.1.3 工具酶和主要試劑 各種限制性內(nèi)切酶，rTaq DNA聚合酶，T4 DNA連接酶，DNA Ladder Marker，購(gòu)自Fermentas公司公司；核酸染料GoldView，購(gòu)于上海賽百盛基因技術(shù)有限公司；OPA，GABA標(biāo)樣，購(gòu)于Sigma公司；蛋白胨，酵母膏，腦心浸液，購(gòu)于英國(guó)OXOID公司；色譜純乙腈，甲醇，0.22 μm有機(jī)相和水相濾膜，購(gòu)于上海安普科學(xué)儀器有限公司；其它試劑均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 pknG敲除菌株的構(gòu)建 基因的敲除采用譚延振[12]和Hu等[9]報(bào)道的方法，原理是基于同源重組和位點(diǎn)特異性重組。首先，在E.coli JM109中構(gòu)建pknG基因的敲除質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)入 C.glutamicum ATCC13032中，使其發(fā)生同源重組從而敲除目的基因，然后轉(zhuǎn)入攜帶cre基因的質(zhì)粒使位于kan片段兩端的lox位點(diǎn)發(fā)生位點(diǎn)特異性重組，從而去除kan片段，最后去除攜帶cre的質(zhì)粒，進(jìn)而得到pknG敲除菌株。E.coli JM109和C.glutamicum感受態(tài)細(xì)胞制備方法和轉(zhuǎn)化方法參照Xu等[13]報(bào)道的方法。

1）pknG敲除質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程：pknG敲除質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程如圖2所示：首先，以C.glutamicum ATCC13032的基因組為模板，pknGU-F/pknGU-R（5’-3’端引入的酶切位點(diǎn)是：Hind III和Xho I）和pknGD-F/pknGD-R（酶切位點(diǎn)是：Xba I和Kpn I）這兩對(duì)引物，分別PCR擴(kuò)增出pknG基因的上游同源臂片段pknGU和下游同源臂片段pknGD。其次，以質(zhì)粒pDTW-202為模板，kanL-F/kanL-R（酶切位點(diǎn)是：Xho I和Xba I）為引物，擴(kuò)增出kan基因片段，片段兩端含有被Cre酶識(shí)別的lox位點(diǎn)。最后將pknG基因的上下游片段、kan片段和相應(yīng)酶切過(guò)的pBluescript II SK的質(zhì)粒連接，得到的新質(zhì)粒即是pknG基因敲除質(zhì)粒，命名為pSNW3。

2）pknG敲除菌株的構(gòu)建過(guò)程：

①將敲除質(zhì)粒pSNW3電轉(zhuǎn)入C.glutamicumATCC13032，涂布于含有卡那霉素的恢復(fù)培養(yǎng)基 LBHIS平板上，30℃培養(yǎng)3 d左右。

圖2 pknG基因敲除質(zhì)粒pSNW3的構(gòu)建過(guò)程Fig.2 Construction of pknG gene deletion plasmid pSNW3

②挑取平板上的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)并進(jìn)行PCR驗(yàn)證，選取驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子，即同源重組后基因組帶有kan基因片段的菌株，kan兩端帶有可以被Cre酶識(shí)別的lox位點(diǎn)。對(duì)此菌株進(jìn)行感受態(tài)細(xì)胞的制備。

③為了去除基因組上的kan基因，把質(zhì)粒pDTW109電轉(zhuǎn)入上述感受態(tài)細(xì)胞中，此質(zhì)粒是帶有Cre酶的溫敏型質(zhì)粒，在37℃會(huì)丟失。然后涂布于含有氯霉素的恢復(fù)培養(yǎng)基LBHIS平板上，25℃培養(yǎng)一段時(shí)間至轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出，使基因組上的kan兩端發(fā)生位點(diǎn)特異性重組。

④選取平板上的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，挑取轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證kan基因片段是否去除，如果kan已經(jīng)去除，將其接種于液體LBG培養(yǎng)基，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，去除質(zhì)粒pDTW109。

⑤挑取過(guò)夜培養(yǎng)的菌液于LBG固體劃線，30℃培養(yǎng)24 h后挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證和抗性驗(yàn)證。PCR驗(yàn)證正確并且在含有卡那霉素或者氯霉素的平板上均不生長(zhǎng)的即為pknG敲除菌株，命名為SNW103。

1.2.2 GAD表達(dá)菌株的構(gòu)建 gadB1和gadB2是編碼GAD的兩個(gè)基因，研究表明[10]，基因gadB1-gadB2的共表達(dá)比兩個(gè)基因的單獨(dú)表達(dá)更有利于GABA的積累。

對(duì)pknG敲除菌SNW103和野生型ATCC13032進(jìn)行感受態(tài)細(xì)胞制備，將攜帶卡那霉素抗性基因的GAD表達(dá)質(zhì)粒pJYW-4-gadB1-gadB2[11]分別轉(zhuǎn)入兩個(gè)菌株。構(gòu)建GAD表達(dá)菌SNW103/pJYW-4-gadB1-gadB2，命名為SNW203；ATCC13032/pJYW-4-gadB1-gadB2，命名為SNW200。

1.2.3 C.glutamicum工程菌株的上罐發(fā)酵C.glutamicum工程菌株的上罐發(fā)酵方法參照Wang等[11]報(bào)道的方法。發(fā)酵周期為72 h，每隔12 h取樣一次，待發(fā)酵結(jié)束后，用高壓液相色譜（HPLC）測(cè)定各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的L-谷氨酸和GABA的產(chǎn)量。

1.2.4 發(fā)酵過(guò)程中殘?zhí)呛桶被岷繙y(cè)定 殘?zhí)牵喊l(fā)酵過(guò)程中取出的發(fā)酵液離心取上清液，用ddH2O稀釋100倍后直接用生物傳感分析儀測(cè)定葡萄糖的質(zhì)量濃度。

氨基酸含量測(cè)定：氨基酸含量測(cè)定方法是鄰苯二甲醛（OPA）自動(dòng)柱前衍生化法[10]。

2 結(jié)果與討論

2.1 敲除pknG的GAD菌的構(gòu)建

首先，構(gòu)建pknG敲除質(zhì)粒pSNW3，構(gòu)建過(guò)程如1.2.1所述。隨后將pknG敲除質(zhì)粒pSNW3轉(zhuǎn)入C.glutamicum ATCC13032進(jìn)行同源重組，使抗性標(biāo)記基因kan與pknG基因進(jìn)行替換。然后通過(guò)Cre酶識(shí)別的lox位點(diǎn)進(jìn)行位點(diǎn)特異性重組，去除抗性標(biāo)記基因kan，得到pknG敲除菌株SNW103。構(gòu)建過(guò)程如1.2.1所述。對(duì)構(gòu)建得到的敲除菌株基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證，以GU/GD（上游同源臂和下游同源臂中間位置設(shè)計(jì)的引物）為引物，產(chǎn)物大小為1 000 bp左右，如圖3的1泳道。圖3的2泳道是對(duì)野生型ATCC13032基因組PCR得到的產(chǎn)物，大小為2 581 bp，是pknG基因未敲除的大小。對(duì)比可以得出，pknG基因敲除成功。

圖3 敲除菌株SNW103和野生型ATCC13032基因組PCR驗(yàn)證電泳圖Fig.3 Verification of the deletion strain SNW103 and wild type ATCC13032 by PCR

最后將GAD共表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入pknG敲除菌株SNW103和ATCC13032中，得到pknG敲除GAD菌SNW203和野生型GAD菌SNW200。

2.2 pknG敲除GAD菌SNW203和野生型GAD菌SNW200的上罐發(fā)酵

分別對(duì)菌株SNW203和SNW200進(jìn)行上罐發(fā)酵。

2.2.1 發(fā)酵過(guò)程的控制 在L-谷氨酸和GABA合成過(guò)程中，GDH（最適pH為7.5）和GAD（最適pH為4.5）是非常重要的兩個(gè)酶。為了使這兩個(gè)酶發(fā)揮活性，必須將發(fā)酵過(guò)程控制為兩個(gè)不同pH階段。0～36 h，L-谷氨酸發(fā)酵階段；36～72 h，GABA合成階段。

在發(fā)酵前期0～36 h，發(fā)揮作用的主要是GDH，L-谷氨酸大量合成。在發(fā)酵起始時(shí)，添加4 g/L的尿素作為氮源來(lái)維持菌體的生長(zhǎng)，這時(shí)，pH會(huì)上升，所以流加2 mol/L HCl來(lái)控制pH值在7.0～7.5之間；當(dāng)pH開始下降時(shí)，流加質(zhì)量濃度10 g/dL尿素控制pH值在7.0～7.5之間，同時(shí)提供了L-谷氨酸合成時(shí)所需要的氮源。

在發(fā)酵后期36～72 h，發(fā)揮作用的主要是GAD，GABA大量合成。36 h之后，停止添加尿素，L-谷氨酸的積累量達(dá)到了很高，這時(shí)，pH會(huì)下降。當(dāng)pH降到適合GAD發(fā)揮活性的值時(shí)，GAD開始發(fā)揮作用，L-谷氨酸開始轉(zhuǎn)化成GABA，這時(shí)pH又會(huì)升高。要使GAD充分發(fā)揮活性，pH要維持在5.0～5.5之間，所以流加2 mol/L HCl來(lái)控制pH值。

發(fā)酵周期72 h，種子轉(zhuǎn)接體積分?jǐn)?shù)是8%，發(fā)酵在裝有1.2 L發(fā)酵培養(yǎng)基的3 L NBS罐中進(jìn)行，溫度30℃，溶氧控在體積分?jǐn)?shù)30%，轉(zhuǎn)速和溶氧偶聯(lián)。每隔12 h取樣，分別測(cè)定OD562、殘?zhí)恰-谷氨酸和GABA產(chǎn)量。

2.2.2 發(fā)酵過(guò)程中OD562、殘?zhí)且约昂奶堑淖兓?發(fā)酵過(guò)程中，菌株SNW203和SNW200的OD562變化情況如圖4所示。0～12 h是菌體快速生長(zhǎng)的時(shí)期，24 h之后緩慢增長(zhǎng)，36～72 h基本平穩(wěn)，但稍有下降。發(fā)酵72 h結(jié)束時(shí)，SNW203的OD562稍高于菌株SNW200，說(shuō)明pknG基因敲除后沒(méi)有影響菌體的生長(zhǎng)。

圖4 SNW203和SNW200的生長(zhǎng)Fig.4 Growth of SNW203 and SNW200 cells

菌株SNW203和SNW200發(fā)酵過(guò)程中的殘?zhí)呛秃奶乔闆r見圖5。

圖5 菌株SNW203和SNW200的殘?zhí)呛秃奶亲兓疐ig.5 Residual glucose and glucose consumption of SNW203 and SNW200

從殘?zhí)亲兓瘉?lái)看，0～24 h，葡萄糖被快速消耗，此過(guò)程是菌體快速生長(zhǎng)和L-谷氨酸快速合成時(shí)期，所以葡萄糖消耗很快。24 h之后，如果殘?zhí)切∮?0 g/L，則需要補(bǔ)加葡萄糖使其維持在20 g/L以上。24～36 h，葡萄糖消耗比較緩慢，主要用于L-谷氨酸的合成。36～72 h之間，葡萄糖消耗得很少，這個(gè)過(guò)程主要是L-谷氨酸轉(zhuǎn)化成GABA的過(guò)程，所以耗糖比較少。發(fā)酵72 h結(jié)束時(shí)，菌株SNW200的總耗糖為 （112.7±7.5）g/L，菌株SNW203的總耗糖為（135.1±10.2）g/L，比菌株SNW200高出19.9%。

2.2.3 發(fā)酵過(guò)程L-谷氨酸和GABA的產(chǎn)量以及總濃度的變化 發(fā)酵過(guò)程中，菌株SNW203和SNW200的L-谷氨酸和GABA的產(chǎn)量變化如圖6所示。兩個(gè)菌株L-谷氨酸和GABA的積累趨勢(shì)是相似的，但是產(chǎn)量相差很大。在對(duì)照菌株SNW200中，0～36 h，L-谷氨酸大量積累，36 h到達(dá)最高值（34.7±5.8）g/L，隨后緩慢下降。36 h之后，L-谷氨酸開始轉(zhuǎn)化成GABA，GABA開始積累，到72 h發(fā)酵結(jié)束時(shí)，GABA的最終產(chǎn)量為（19.4±2.6）g/L。最終L-谷氨酸轉(zhuǎn)化成GABA的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到了88%。在pknG敲除GAD菌SNW203中，0～36 h，L-谷氨酸大量積累，36 h到達(dá)最高值（44.8±5.3）g/L，隨后迅速下降，L-谷氨酸的最高產(chǎn)量比菌株SNW200的最高產(chǎn)量高了29.2%。36 h之后，L-谷氨酸開始轉(zhuǎn)化成GABA，GABA開始積累，72 h發(fā)酵結(jié)束后，GABA的最終產(chǎn)量為（30.2±0.3）g/L，比SNW200高出55.4%。最終L-谷氨酸的摩爾轉(zhuǎn)化率為96%。

圖6 菌株SNW203和SNW200的L-谷氨酸和GABA濃度變化Fig.6 L-glutamateand GABA concentrationsof SNW203 and SNW200

菌株SNW203和SNW200的L-谷氨酸和GABA的總摩爾濃度的變化如圖7所示。

圖7 SNW203和SNW200的L-谷氨酸和GABA總濃度變化Fig.7 Total concentration of L-glutamate and GABA of SNW203 and SNW200

在對(duì)照菌株SNW200中，0～36 h，L-谷氨酸和GABA的總摩爾濃度在不斷升高，36 h達(dá)到最高值0.26 mol/L，隨后有所降低，72 h發(fā)酵結(jié)束后，L-谷氨酸和GABA的總摩爾濃度是0.22 mol/L，GABA的糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到了0.33 mol/mol。

在pknG敲除GAD菌SNW203中，0～36 h，L-谷氨酸和GABA的總摩爾濃度在不斷升高，48 h達(dá)到最高值0.32 mol/L，隨后有所降低，發(fā)酵72 h結(jié)束時(shí)，L-谷氨酸和GABA的總摩爾濃度是0.30 mol/L，相對(duì)于SNW200提高了36.7%，發(fā)酵過(guò)程中的總摩爾濃度始終比SNW200高。GABA的糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到了0.39 mol/mol。

綜上所述，敲除pknG基因后，有利于L-谷氨酸和GABA的積累。

另外，從圖 6中可以看出，36～48 h，菌株SNW203的L-谷氨酸是迅速下降，而GABA是迅速升高，上升和下降的速度高于對(duì)照菌株SNW200。并且在48 h，絕大部分的L-谷氨酸已經(jīng)轉(zhuǎn)化成了GABA，轉(zhuǎn)化速度非?？臁Ｒ虼嗽诎l(fā)酵過(guò)程中，可以進(jìn)一步考慮縮短菌株SNW203的發(fā)酵周期，這樣更有利于GABA的工業(yè)化生產(chǎn)。

3 結(jié)語(yǔ)

在C.glutamicum ATCC13032中共表達(dá)了兩個(gè)GAD基因（gadB1和gadB2），可以有效地將其自身合成的L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為GABA。為了進(jìn)一步提高GABA的產(chǎn)量，作為GABA的唯一的前體物質(zhì)L-谷氨酸的合成必須加強(qiáng)。因此本研究中敲除pknG基因，來(lái)提高L-谷氨酸的供應(yīng)，進(jìn)而提高GABA的產(chǎn)量。首先，構(gòu)建了pknG敲除菌株SNW103，然后將共表達(dá)GAD質(zhì)粒轉(zhuǎn)入SNW103和ATCC13032，得到pknG敲除GAD菌SNW203和對(duì)照GAD菌SNW200。

兩個(gè)GAD菌株的上罐結(jié)果表明，pknG敲除后，GABA的產(chǎn)量從（19.4±2.6）g/L提高到（30.2±0.3）g/L，提高了55.4%。L-谷氨酸的最高產(chǎn)量從（34.7±5.8）g/L提高到（44.8±5.3）g/L，提高了29.2%。發(fā)酵結(jié)束后，L-谷氨酸和GABA的總摩爾濃度從0.22 mol/L提高到0.30 mol/L，提高了36.4%?？梢钥闯觯贸齪knG基因后，GABA和L-谷氨酸的產(chǎn)量都有所提高，pknG基因的敲除起到了很好的效果。

72 h發(fā)酵結(jié)束后，pknG敲除GAD菌SNW203的GABA產(chǎn)量有很大幅度的提高，L-谷氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為96%，更有利于后期GABA的分離和純化，為其工業(yè)化應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)。

[1]WANGJiaojiao，BAIWeidong，LIANGBinxia.Thephysiologicalfunctionsandenrichmentresearchprogressofthe γ-aminobutyric acid[J].Academic Periodical of Farm Products Processing，2012（1）：40-45.（in Chinese）

[2]LIN Qian.Outline of physiologic function of γ-aminobutyric acid[J].Journal of Yulin Normal University，2010，31（2）：62-65.（in Chinese）

[3]LI H X，CAO Y S.Lactic acid bacterial cell factories for gamma-aminobutyric acid[J].Amino Acid，2010，39：1107-1116.

[4]TSUCHIDA T，YOSHINAGA F，KUBOTA K.Production of L-valine by 2-thiazolealanine resistant mutants derived from glutamic acid producing bacteria[J].Agric Biol Chem，1975，39：1319-1322.

[5]WENDISCH V F，BOTT M，EIKMANNS B J.Metabolic engineering of Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum for biotechnological production of organic acids and aminoacids[J].Curr Opin Microbiol，2006（9）：268-274.

[6]SHIF，JIANG J J，LIY X，et al.Enhancement ofgamma-aminobutyric acid production in recombinant Corynebacterium glutamicum by co-expressing two glutamate decarboxylase genes from Lactobacillus brevis[J].J Ind Microbiol Biotechnol，2013，40：1285-1296.

[7]KRAWCZYK S，RAASCH K，SCHULTZ C，et al.The FHA domain of OdhI interacts with the carboxyterminal 2-oxoglutarate dehydrogenase domain of OdhA in Corynebacterium glutamicum[J].FEBS Lett，2010，584：1463-1468.

[8]NIEBISCH A，KABUS A，SCHULTZ C，et al.Corynebacterial protein kinase G controls 2-oxoglutarate dehydrogenase activity via the phosphorylation status of the OdhI protein[J].J Biol Chem，2006，281：12300-12307.

[9]HU J Y，TAN Y Z，LI Y Y，et al.Construction and application of an efficient multiple-gene-deletion system in Corynebacterium glutamicum[J].Plasmid，2013，70：303-313.

[10]江君君.谷氨酸棒桿菌中共表達(dá)短乳桿菌來(lái)源的谷氨酸脫羧酶生產(chǎn)γ-氨基丁酸[D].無(wú)錫：江南大學(xué)生物工程學(xué)院，2013.

[11]WANG N N，NI Y L，SHI F.Deletion of odhA or pyc induce efficient γ-aminobutyric acid and its precursor L-glutamate overproduction in Corynebacterium glutamicum[J].Biotechnol Lett，2015.

[12]譚延振.谷氨酸棒狀桿菌基因敲除系統(tǒng)的構(gòu)建[D].無(wú)錫：江南大學(xué)生物工程學(xué)院，2012.

[13]XU D Q，TAN Y Z，HUAN X J，et al.Construction of novel shutter vector for use in Brevibecterium flavum，an industrial amino acid producer[J].J Microbiol Methods，2010，80：86-92.

Deletion of pknG Improves the Production of L-Glutamate and GABA in Recombinant Corynbacterium glutamicum

WANG Nannan1，2，3， NI Yalan1，2，3， SHI Feng*1，2，3
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Gama（γ）-aminobutyric acid（GABA），which has a variety of physiological functions，is widely used in food，pharmaceutical and other industries.Two L-glutamate decarboxylase（GAD）genes （gadB1 and gadB2）were co-expressed previously in an L-glutamate producing strain Corynebacterium glutamicum ATCC13032，making the own accumulated L-glutamate be effectively transformed into GABA.To further enhance GABA production，the pknG gene encoding serine/threonine protein kinase PknG was deleted to improve the supply of GABA precursor L-glutamate.Then the co-expression plasmid pJYW-4-gadB1-gadB2 was transformed into pknG deletion strain and ATCC13032，generating the recombinant C.glutamicum strains SNW203 andSNW200.After the strains were fermented in fermenters，the production of both L-glutamate and GABA in SNW203 increased greatly when compared with SNW200.At 72 h of fermentation，GABA production in SNW203 increased to（30.2±0.3）g/L，55.4%higher than that in SNW200 and the total concentration of L-glutamate and GABA reached up to 0.3 mol/L，36.4%higher than that in SNW200.This result indicates that the deletion of pknG improves the biosynthesis of L-glutamate and GABA in recombinant C.glutamicum.

γ-aminobutyric acid，Corynbacterium glutamicum，pknG gene

Q 815

A

1673—1689（2017）02—0187—07

2015-04-16

食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主科研課題項(xiàng)目（SKLF-ZZB-201405）。

*通信作者：史 鋒（1970—），女，江蘇丹陽(yáng)人，工學(xué)博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事微生物代謝工程與基因工程研究。

E-mail：shifeng@jiangnan.edu.cn

王楠楠，倪亞蘭，史 鋒.敲除pknG提高谷氨酸棒桿菌L-谷氨酸和GABA產(chǎn)量[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（02）：187-193.