不同消毒處理對竹芋組培無菌外植體獲得的影響

夏時云　付任勝　張德嵐　馬武赟

摘要:以過渡栽培植株的側(cè)芽或頂芽為外植體,研究了不同消毒處理對竹芋組培無菌外植體獲得的影響。結(jié)果表明:采用抗菌素浸泡5 h、熏蒸12 min并配合常規(guī)消毒處理(75%酒精浸泡1 min;3.0%～5.0%的次氯酸鈉和0.1%升汞1∶1混合溶液浸泡10～12 min)對外植體進(jìn)行綜合滅菌,能較快地殺滅竹芋外植體表面細(xì)菌,使初次接種污染率控制在20%以下。

關(guān)鍵詞:竹芋;組織培養(yǎng);消毒處理;污染率;外植體

中圖分類號:S682.1+61文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1006-6500(2009)02-0006-03

Effect of Different Disinfection Treatment on Sterile Explant Obtaining in Tissue Culture of Calathea spp

XIA Shi-yun1,FU Ren-sheng1,ZHANG De-lan2,MA Wu-yun2

(1.Tianjin Research Center of Agricultural Biotechnology,Tianjin 300192,China;2.Tianjin Agricultural College, Tianjin 300384,China)

Abstract:The effect of different disinfection methods on explant obtaining in Calathea spp was studied. The results showed that pre-treatment and antibiotic marinating for 5 h and suffocating for 12 min as well as ordinary disinfection for 12 min for surface disinfection could effectively control explant contamination. The contaminate rate with this method would be less than 20%.

Key words: Calathea spp;tissue culture;disinfection treatment;contaminate rate;explant

竹芋(Calathea spp)是目前比較流行的多年生觀葉常綠草本植物,市場需求一直呈遞增趨勢。目前,國內(nèi)大多竹芋品種是從國外引進(jìn)的。竹芋一般分蘗較少,用常規(guī)分株繁殖難以擴(kuò)大生產(chǎn),因此,研究竹芋組培快繁技術(shù)體系具有重要意義。

竹芋植物的芽大部分位于栽培基質(zhì)內(nèi),且地下部分有較發(fā)達(dá)的通氣組織,組織內(nèi)部有大量的寄生或內(nèi)生菌,在竹芋組培中,采用常規(guī)的酒精、HgCl2等溶液滅菌,只能殺死表面的細(xì)菌,無法滲入外植體內(nèi)部,不能徹底殺滅組織材料的內(nèi)生菌,在初代培養(yǎng)和增殖過程中易出現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)菌污染[1],如培養(yǎng)基表面出現(xiàn)多色的水漬樣,有些底部呈現(xiàn)白色暈狀;有時也出現(xiàn)真菌污染,如培養(yǎng)基表面出現(xiàn)各種霉菌,嚴(yán)重影響組培苗的正常生長,甚至導(dǎo)致死亡[1-7]。筆者以過渡栽培植株的側(cè)芽或頂芽為外植體,采用抗菌素浸泡、熏蒸并配合常規(guī)消毒處理對外植體進(jìn)行綜合滅菌,能較快地殺滅竹芋外植體表面細(xì)菌;在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中適量添加生物殺菌劑,能較大幅度地降低外植體的污染率,取得較理想效果。

1材料和方法

1.1材 料

市購盆栽“雙線竹芋”、“青蘋果”竹芋,購回后挖出,洗凈基質(zhì)并消毒處理,無土栽培2～3個月,每隔1周噴灑1次500倍多菌靈溶液,取植株萌動的頂芽和側(cè)芽作試驗(yàn)材料。

1.2方 法

1.2.1預(yù)處理將外植體先用洗衣粉水浸泡30 min,自來水沖洗30 min。

1.2.2抗菌素浸泡在500～800倍多菌靈溶液中分別浸泡2,3,4,5,6 h,自來水沖洗干凈。設(shè)未浸泡的為CK1。

1.2.3熏蒸將預(yù)處理與抗菌素浸泡后的外植體在密封玻璃容器中,用高錳酸鉀∶甲醛=1∶2 熏蒸5,10,15,20 min后備用。設(shè)未熏蒸為CK2。

1.2.4常規(guī)消毒處理超凈臺上,用75%酒精浸泡1 min;在3.0%～5.0%次氯酸鈉∶0.1%升汞=1∶1混合溶液中分別浸泡8,10,12,15 min,無菌水沖洗5～6次。

1.3 培養(yǎng)條件

取已消毒的外植體,剝離莖尖接種于適量添加生物殺菌劑的誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)。溫度(25±2)℃,光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx,光照周期14 h/d。10 d后觀察污染情況。

2結(jié)果與分析

2.1不同抗菌素浸泡時間對竹芋初代培養(yǎng)外植體污染率的影響

將預(yù)處理后的外植體用抗菌素不同時間浸泡并熏蒸15 min、常規(guī)消毒15 min處理(見材料和方法,下同),無菌水沖洗后的外植體接種在培養(yǎng)基中,培養(yǎng)10 d后,調(diào)查外植體污染情況。從表1可見:(1)經(jīng)不同時間抗菌素浸泡后,初代培養(yǎng)外植體的污染率顯著不同,并隨浸泡時間延長而降低,污染率在12.0%～84.0%,而未經(jīng)浸泡的高達(dá)96.7%;(2)在浸泡處理中,以抗菌素浸泡5 h的效果好,污染率只有18.1%;(3)本試驗(yàn)中,雖然抗菌素浸泡6 h能獲得更低的污染率(12.0%),但我們發(fā)現(xiàn),浸泡6 h后,初代培養(yǎng)時受到抑制,莖尖幾乎停止生長,對竹芋誘導(dǎo)培養(yǎng)極為不利。

本試驗(yàn)只用了較高濃度的多菌靈浸泡處理,取得了較好的效果。但其它抗菌素如代森錳鋅、百菌清及鏈霉素、慶大霉素等是否有效,以及配合使用的協(xié)同效果,需進(jìn)一步試驗(yàn)。

2.2不同熏蒸時間對竹芋初代培養(yǎng)外植體污染率的影響

將預(yù)處理后的外植體先用抗菌素浸泡5 h,再進(jìn)行不同時間熏蒸處理,最后常規(guī)消毒15 min,無菌水沖洗的外植體接種在培養(yǎng)基中,培養(yǎng)10 d后,調(diào)查污染情況。從表2可見,經(jīng)不同時間的熏蒸處理,初代培養(yǎng)的外植體污染率為23.5%～77.2%,隨熏蒸時間延長而降低。在不同處理中,以熏蒸15 min的效果最好,污染率為26.2%,比對照降低53.5個百分點(diǎn)。熏蒸20 min能獲得更低的污染率(23.5%),但初代培養(yǎng)時莖尖灰白,生長不良。因此,熏蒸時間不宜過長,時間過長對熏蒸的外植體殺傷力太大?？刹扇⊙?2～15 min,再結(jié)合其他滅菌處理,可以取得較理想的效果。

2.3不同時間常規(guī)消毒對竹芋初代培養(yǎng)外植體污染率的影響

外植體經(jīng)預(yù)處理和抗菌素浸泡5 h及熏蒸12 min后,在超凈臺上進(jìn)行不同時間的常規(guī)消毒處理,無菌水沖洗后接種在培養(yǎng)基中,培養(yǎng)10 d后的外植體污染率見表3。從表3可見,常規(guī)消毒時間不同,初代培養(yǎng)的外植體污染率也不同,并隨常規(guī)消毒時間延長而降低,污染率在14.6%～48.7%。表明常規(guī)消毒對竹芋外植體消毒滅菌有很好的效果。在常規(guī)消毒中,以消毒10～12 min 較好,污染率為31.1%～32.9%。處理15 min容易使初代培養(yǎng)的莖尖死亡。

3結(jié) 論

植物組織培養(yǎng)過程中,外植體消毒處理難,易出現(xiàn)污染是最常見的問題[2-7]。從以前所報道的試驗(yàn)結(jié)果來看,在竹芋外植體消毒滅菌方法中,大多數(shù)研究者只提供了1種或2種表面滅菌的方法,且還只停留在實(shí)驗(yàn)室階段[1]。我們以過渡栽培植株的側(cè)芽或頂芽為外植體,研究了不同消毒處理對竹芋組培無菌外植體獲得的影響。結(jié)果表明:采用抗菌素浸泡5 h、熏蒸12 min、常規(guī)消毒處理10～12 min對外植體進(jìn)行綜合滅菌,能較快地殺滅竹芋外植體表面細(xì)菌。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中適量添加生物殺菌劑,能較大幅度地降低外植體的污染率,使初次接種污染率控制在20%以下,為今后竹芋工廠化組培快繁中的污染問題提供了一種有效的克服方法。這些方法在其他植物的組培苗工廠化生產(chǎn)中,也有較好的借鑒意義和應(yīng)用前景。在生產(chǎn)上應(yīng)對外植體進(jìn)行徹底滅菌和嚴(yán)格的無菌操作,避免出現(xiàn)污染,盡可能多地獲得無菌外植體,為建立起竹芋初次培養(yǎng)無菌體系奠定基礎(chǔ)。

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