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    質譜技術在抗體藥物分析中的應用

    2017-04-29 00:00:00高燕波
    健康前沿 2017年12期

    摘要:質譜技術是抗體藥物分析最重要的技術手段之一。本文簡述了抗體藥物的發(fā)展和質譜技術的原理。對于質譜技術在抗體藥物的分析中應用進行了歸類整理,主要分為在一級結構和高級結構分析中的應用。

    關鍵詞:抗體藥物 質譜 一級結構 高級結構

    單克隆抗體藥物的發(fā)展起源于1975年,Kohler 和Milstein 創(chuàng)立雜交瘤技術,為大量制備鼠源單克隆抗體提供了技術條件,開創(chuàng)了大規(guī)模制備單克隆抗體時代??贵w類藥物是指含有抗體片段的蛋白類藥物,所以在惡性腫瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、感染和器官移植排斥等重大疾病上得到了快速的發(fā)展,是當前生物藥物領域增長最快的一類藥物。[1]

    1.抗體藥物發(fā)展新趨勢

    在生物藥物領域,抗體藥物占據著越來越重要的地位,2015年全球銷售排名前10 位的藥物中有6 個為抗體藥物,分別是humira、enbrel、remicade、rituxan、avastin和Herceptin??贵w藥物按來源分類可以分為:鼠源單克隆抗體、人鼠嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。目前,F(xiàn)DA 批準的單克隆抗體藥物中,人源化單抗和全人源單抗數(shù)量已占據72%[2]

    1.1抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)

    抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)由單克隆抗體和小分子化合物兩部分組成。通過抗體的靶向作用,ADC 的抗體部分和腫瘤細胞表面抗原特異性識別并結合,通過細胞內吞作用,將抗體和小分子化合物一起帶進腫瘤細胞內部,釋放出小分子化合物。[3]這樣既可以降低小分子藥物的毒性,同時具有靶向結合的作用。已經上市的兩個ADC是Kadyla和Adcetris。

    1.2雙特異性抗體(BsAb)

    雙特異性抗體(BsAb)是含有兩種特異性抗原結合位點的人工抗體,能在靶細胞和功能分子(細胞)之間架起橋梁,。由于基因工程的發(fā)展,目前雙特異性抗體已經研發(fā)出多種類型[4],主要類型有三功能雙特異性抗體、IgG-scFv、三價雙特異性分子、串聯(lián)單鏈抗體(串聯(lián)scFv)、DVD-Ig 等多種形式。

    2.質譜技術

    近年來質譜儀性能的顯著改進主要基于開發(fā)出的兩種離子化技術:一種是介質輔助的激光解吸/離子化[5]技術。另一種是電噴霧離子化[6]技術。由于這兩種電離技術的出現(xiàn),使原本只能檢測小分支的質譜技術,可以運用于檢測生物大分子。

    在過去質譜技術主要運用于對一級結構和序列的表征,而現(xiàn)在質譜技術越來越多地運用于高級結構的分析,而高級結構對于抗體藥物的生物活性至關重要。

    3.質譜技術在抗體藥物一級結構分析中的應用

    3.1完整抗體藥物精確分子量測定

    當?shù)玫娇贵w藥物時,可以直接通過高分辨率的MALDI-TOF或者ESI-MS進行分子量的檢測。通過對于脫糖后分子量的檢測,可以對于抗體藥物進行初步定性分析,并將可以作為藥物常規(guī)放行的分析方法[7]。對于脫糖前的抗體藥物進行分析,可以得到抗體藥物的糖基化類型的信息及糖基化水平的分布[8],對于快速了解生產工藝與藥物質量的關系具有十分重要的意義。

    3.2藥物抗體偶聯(lián)比(DAR)

    對于賴氨酸鏈接的抗體偶聯(lián)藥物,采用C4 色譜柱及聯(lián)用的質譜對去糖基化樣品進行分析,根據偶聯(lián)不同數(shù)目藥物分子的質量數(shù)增加判斷偶聯(lián)數(shù)目[9]。對于質譜測定的結果,不僅可以給出確切的藥物抗體偶聯(lián)比值,更能夠給出鏈接不同個小分子藥物的分布情況,及反應過程副產物空鏈接頭的分布情況。[10]

    3.3肽指紋圖譜

    蛋白被特異酶切微店的蛋白酶水解后得到的肽片段質量圖譜。由于不同的抗體藥物具有不同的氨基酸序列,蛋白質被酶水解后,產生的肽片段也各不相同,肽混合物的質量數(shù)醫(yī)具有指紋特征。可以通過LC-ESI-MS進行肽片段的一級質量數(shù)的鑒定,也可以通過LC-ESI-MS/MS對于每個肽片段進行進一步確證,提高肽指紋圖譜的準確性。

    3.4翻譯后修飾研究

    蛋白質的翻譯后修飾(PTM)對于抗體藥物的生物學功能十分重要。常見的翻譯后修飾有:磷酸化、脫酰胺、甲硫氨酸氧化、糖基化修飾、N 端焦谷氨酸環(huán)化,C 端賴氨酸切除等。質譜分析儀檢測蛋白和肽片段的分子量偏差,可以實現(xiàn)高靈敏、高通量和高精確地鑒別蛋白質的翻譯后修飾的種類。[11]

    3.5 N端氨基酸序列檢測

    常規(guī)N端氨基酸檢測用Edman 降解法進行檢測,但是抗體藥物有時候會出現(xiàn)N端環(huán)化的現(xiàn)象,在這種情況下用Edman 降解法需要先對抗體進行去封閉處理,而直接使用質譜可以直接測出N端的氨基酸序列,同時可以檢測出N端環(huán)化的相對比例。[12]

    4.質譜技術在抗體藥物高級結構分析中的應用

    4.1氫/氘交換質譜(HDX-MS)

    常規(guī)的質譜只能獲得蛋白的一級結構信息。氫/氘交換質譜(HDX-MS)可以進行蛋白質構象,溶液動力學和表位映射進行分析。在能夠調查的蛋白質的高階結構和動態(tài)結構技術中,HDX-MS已經證明適合單克隆抗體和單克隆抗體 - 抗原復合物的構象分析。

    4.2離子淌度質譜法(IM-MS)。

    離子淌度是根據蛋白的電荷和形狀選擇性分離的方法,可以區(qū)分相同分子量的蛋白和肽段,可用于檢測蛋白的簡單高級結構。

    4.3高分辨率傅立葉變換離子回旋共振質譜(FTICR-MS)

    高分辨率傅立葉變換離子回旋共振質譜(FTICR-MS)能夠檢測最高質量數(shù)的質譜儀器,并且有著很高的分辨率。FTICR-MS是目前被公認為是蛋白質組學研究的有力工具,特別是和完整的蛋白質鑒定和上/下調翻譯后修飾(PTM)蛋白質的鑒定。

    4.小結

    隨著抗體藥物的不斷發(fā)展,需要對于抗體藥物的結構信息不斷進行深入的分析,質譜技術也隨著這一要求不斷進步。在現(xiàn)階段,由于生物質譜分析的成本很高,并且對于人員的要求比較高,所以使其應用受到了限制。當然隨著技術的進步,可以預見質譜分析會越來越多地運用于抗體分析中,特別是在高級結構分析的領域,通過質譜分析,可以讓我們更多獲得高級結構的信息,這對于抗體藥物的分析是極為重要的。

    參考文獻:

    [1]王蘭,朱磊,徐剛領,等.單克隆抗體類生物治療藥物研究進展[J].中國藥學雜志,2014,49(23):2058-2064.

    [2]李壯林,姚雪靜. 單克隆抗體藥物研究進展[J].藥物生物技術,2014,21(5):456-461.

    [3]Austin CD,Wen X,Gazzard L,et al. Oxidizing potential of endosomes and lyosomes limits intracellular cleavage of disulfidebased antibody-drug conjugates[J]. Proc Natl Acad Sci,2005,102(50):17987-17992.

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    [5]Vestal M L,Juhasz P. Delayed extraction matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry.[J].Rapid Commun Mass Spectrom,1995,9:1044-1050

    [6]Tisato F,Bolzati C,Porchia M.Contribution of electrospray mass spectrometry for characterization,design,and development of nitride technetium and rhenium heterocomplexes as potential radiopharmaceuticals[J]. Mass Spectrometry Reviews,Published Online,2004,23(5):309-332.

    [7]李萌,于傳飛,王馨,等. 相對分子質量測定作為單抗藥物常規(guī)放行分析方法的可行性商榷[J]. 藥物分析雜志,2015,12:2076-2082.

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    [9]于傳飛,李萌,郭瑋,等. 一種抗體藥物偶聯(lián)物中藥物抗體偶聯(lián)比的測定[J]. 藥學學報,2014,03:363-367.

    [10]Wakankar A Chen Y,Gokarn Y,et al. Analytical methods for physicochemical characterization of antibody drug conjugates. [J]. MAbs. 2011;3(2):161-172.

    [11]Duan X T,Dai L P,Chen S C,et al. Nano-scale liquid chromatography/mass spectrometry and on-the-fly orthogonal array optimization for quantification of therapeutic monoclonal antibodies and the application in preclinical analysis. [J]. J Chromatogr A,2012,1251(17):63-73.

    [12]Stackhouse N,Miller AK,Gadgil HS. A high-throughput UPLC method for the characterization of chemical modifications in monoclonal antibody molecules. [J].J Pharm Sci. 2011;100(12):5115-5125.

    作者簡介:高燕波(1990~),女,研究方向為抗體藥物研發(fā)。正在攻讀上海交通大學生物工程專業(yè)碩士;Email:gaoyanbo_1990@163.com

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