PTPN22和轉(zhuǎn)錄因子FOXP3基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性分析

李聲東

[摘要] 目的 探討蛋白酪氨酸磷酸酶22（PTPN22）和轉(zhuǎn)錄因子FOXP3基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性。 方法 選取2013年1～6月我院收治的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者80例為研究組，選取同期健康體檢人員80例為對(duì)照組，對(duì)比兩組研究對(duì)象的PTPN22和轉(zhuǎn)錄因子FOXP3基因多態(tài)性。 結(jié)果 FOXP3位點(diǎn)基因頻率在兩組研究對(duì)象當(dāng)中的分布存在明顯區(qū)別（P<0.05）；FOXP3基因-2383C/T同-3281C/A存在連鎖不平衡，-2383T/-3281A的單倍型攜帶者明顯加大SLE發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)（P<0.05）； PTPN22基因-1123G/C位點(diǎn)的等位基因以及基因型分布在兩組研究對(duì)象之間無(wú)明顯差異（P>0.05）。 結(jié)論 FOXP3基因-2383C/T的多態(tài)性同SLE發(fā)生發(fā)展之間存在顯著的關(guān)聯(lián)性，并且-2383T基因可能是該病重要的遺傳易感基因，同時(shí)PTPN22基因位點(diǎn)1858C/1858T以及-1123G/C同SLE發(fā)病無(wú)明顯關(guān)聯(lián)性。

[關(guān)鍵詞] PTPN22；轉(zhuǎn)錄因子FOXP3；基因多態(tài)性；系統(tǒng)性紅斑狼瘡；遺傳易感性

[中圖分類(lèi)號(hào)] R593.241 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）05-0001-04

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）屬于免疫性疾病的一種，主要特點(diǎn)是免疫物沉積到皮膚、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)以及血管當(dāng)中，導(dǎo)致炎癥以及壞死問(wèn)題[1]。研究人員發(fā)現(xiàn)SLE患者的T細(xì)胞存在調(diào)節(jié)障礙并且合并有免疫功能方面的紊亂。這些免疫缺陷與患者T細(xì)胞功能以及數(shù)量方面的障礙存在聯(lián)系[2]。FOXP3是T細(xì)胞的重要轉(zhuǎn)錄因子，在SLE的發(fā)生以及發(fā)展過(guò)程當(dāng)中可能發(fā)揮重要影響。FOXP3基因在X染色體，分子生物學(xué)的研究結(jié)果顯示FOXP3基因有著多態(tài)性，與多種免疫性疾病存在聯(lián)系[3]。蛋白酪氨酸磷酸酶22（PTPN22）是近年來(lái)受到研究人員高度重視的免疫疾病基因，編碼在T細(xì)胞傳導(dǎo)途徑當(dāng)中，通過(guò)脫磷酸化作用影響T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制免疫性疾病出現(xiàn)[4]。本研究分析PTPN22以及FOXP3基因多態(tài)性與SLE之間的關(guān)系，從而為分析系統(tǒng)性紅斑狼瘡遺傳易感性提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取2013年1～6月我院收治的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者80例為研究組，男16例，女64例，年齡22～45歲，平均（35.1±2.6）歲，所有患者均符合美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)。選取同期健康體檢人員80例為對(duì)照組，男18例，女62例，年齡23～44歲，平均（35.3±2.9）歲。兩組患者的一般資料有可比性（P>0.05），本研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.2方法

1.2.1 PTPN22檢驗(yàn)方法 采集患者的靜脈血5 mL，EDTA抗凝之后，使用碘化鈉法提取基因組DNA后保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物，特異性擴(kuò)增FOXP3基因當(dāng)中包含-3281C/3281A的DNA片段，取擴(kuò)增產(chǎn)物2 L，37℃條件下孵育2 h，反應(yīng)終止之后EB染色，染色之后使用凝膠成像判斷結(jié)果[5]。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄因子FOXP3檢驗(yàn)方法 采集患者的靜脈血5 mL，EDTA（乙二胺四乙酸二鈉鹽）抗凝之后使用蛋白酶抽提法提取DNA，使用DNA電泳法以及紫外分光法定量定性檢測(cè)之后保存?zhèn)溆谩ｋ娪久盖蟹磻?yīng)1858C/1858T位點(diǎn)的基因擴(kuò)增產(chǎn)物，消毒雙蒸水2 h之后存儲(chǔ)在37℃的水浴箱過(guò)夜，酶切后產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，電泳之后將凝膠放到EB液當(dāng)中染色1 h之后觀察拍照[6]（封三圖1）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

讀取個(gè)體樣本之后計(jì)算基因型以及等位基因頻率，確認(rèn)是否符合平衡定律，對(duì)等位基因頻率以及多態(tài)性位點(diǎn)的基因型頻率進(jìn)行檢驗(yàn)[7]，數(shù)據(jù)用SPSS18.0軟件分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組患者FOXP3基因多態(tài)性分布頻率比較

FOXP3位點(diǎn)基因頻率在兩組研究對(duì)象當(dāng)中的分布存在明顯差異（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2兩組患者FOXP3基因單倍型分布頻率比較

FOXP3基因-2383C/T同-3281C/A存在連鎖不平衡，-2383T/-3281A的單倍型攜帶者明顯加大SLE發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)（P<0.05），見(jiàn)表2。

2.3兩組PTPN22基因啟動(dòng)子-1123G/CSNP位點(diǎn)的等位基因以及基因型分布頻率比較

PTPN22基因啟動(dòng)子區(qū)域-1123G/CSNP在各組內(nèi)男女之間三種基因型頻率分布無(wú)明顯差異（P>0.05），C等位基因的分布及CC基因型的頻率在研究組和對(duì)照組之間分布也無(wú)明顯差異（P>0.05），見(jiàn)表3。

3 討論

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是各種因素聯(lián)合作用誘發(fā)的一種免疫功能失調(diào)疾病，當(dāng)前情況下人們對(duì)該病的致病因素尚未完全明確，但是研究人員普遍認(rèn)為細(xì)胞免疫功能在SLE的發(fā)病過(guò)程當(dāng)中有不容忽視的影響。SLE患者的β細(xì)胞功能活化同時(shí)大量產(chǎn)生自身抗體，似乎SLE是β細(xì)胞異常誘發(fā)的疾病，不過(guò)β細(xì)胞的活化受T細(xì)胞異常的誘導(dǎo)與影響，因此SLE更像是T細(xì)胞介導(dǎo)的一種疾病[8]。FOXP3是foxhead的家族成員，在人體的CD4+以及CD25+T細(xì)胞當(dāng)中都有表達(dá)，并且可以介導(dǎo)二者在胸腺當(dāng)中的發(fā)育、功能維持以及外周表達(dá)[9]。相關(guān)研究的結(jié)果顯示，F(xiàn)OXP3基因的突變或者是小鼠體內(nèi)兩種T細(xì)胞數(shù)量的減少，能夠誘發(fā)比較嚴(yán)重的免疫性疾病[10]。當(dāng)前FOXP3在SLE發(fā)病過(guò)程當(dāng)中具體影響的研究還比較少見(jiàn)。有研究人員在小鼠的狼瘡模型當(dāng)中檢測(cè)CD4+以及CD25+T細(xì)胞以及FOXP3表達(dá)，結(jié)果顯示狼瘡小鼠當(dāng)中的CD4+以及CD25+T細(xì)胞表達(dá)要明顯少于正常的小鼠[11]。還有研究人員發(fā)現(xiàn)在SLE患者的外周血細(xì)胞當(dāng)中，F(xiàn)OXP3RNA水平明顯下降。因此可以認(rèn)為FOXP3在SLE發(fā)病過(guò)程當(dāng)中可能會(huì)發(fā)生重要影響[12]。FOXP3的基因在X染色體的短臂，包括10個(gè)內(nèi)含子以及11個(gè)外顯子。研究顯示FOXP3基因有著遺傳多態(tài)性，這一特點(diǎn)給FOXP3基因表達(dá)以及轉(zhuǎn)錄帶來(lái)直接的影響，從而在一定程度上決定著生物學(xué)功能，同部分自身免疫疾病存在密切聯(lián)系[13]。因此有研究人員推測(cè)FOXP3的基因多態(tài)性同SLE的易患性存在聯(lián)系[14]。在FOXP3基因的多態(tài)性以及SLE之間的關(guān)系方面，還缺乏系統(tǒng)深入的研究。為進(jìn)一步分析FOXP3的基因多態(tài)性同該病發(fā)生發(fā)展的聯(lián)系，本研究對(duì)比健康人群以及SLE患者，分析FOXP3的基因多態(tài)性，結(jié)果表明SLE患者的-2383C/T在多態(tài)性分布方面同健康人員比較而言有明顯差異，T等位基因的攜帶頻率在SLE患者當(dāng)中要明顯多于健康人群（P<0.05）。聯(lián)合基因型分析結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)，-2383T/-3281A的等位基因明顯加大了SLE的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。這意味著FOXP3基因的-2383C/T多態(tài)性同該病的發(fā)作有明顯關(guān)聯(lián)性，并且-2383T等位基因推測(cè)是SLE患者的遺傳易感基因。FOXP3基因當(dāng)中的-3281C/A多態(tài)性同SLE的發(fā)生發(fā)展無(wú)明顯相關(guān)性。

PTPN22在1號(hào)染色體當(dāng)中，共有15個(gè)內(nèi)含子以及16個(gè)外顯子，編碼酪氨酸磷酸酶（LYP）[15]。LYP集中分布在人體的淋巴細(xì)胞當(dāng)中，由含有脯氨酸基序（C端）以及磷酸酶區(qū)域（N端）組成。在T細(xì)胞的活化步驟當(dāng)中，借助于C端名為P1的氨酸基序同Csk結(jié)構(gòu)相連接而發(fā)揮調(diào)節(jié)功能，使得磷酸化的酪氨酸激酶能夠脫磷酸化從而喪失活性，抑制T細(xì)胞信號(hào)通路的激活，通過(guò)這樣的途徑調(diào)節(jié)T細(xì)胞信號(hào)[16]。單核苷酸的變異會(huì)導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)出現(xiàn)障礙，從而誘發(fā)免疫性疾病的出現(xiàn)以及惡化。相關(guān)研究的結(jié)果表明，截止到目前為止，亞洲地區(qū)還滅有出現(xiàn)基因位點(diǎn)出現(xiàn)變異的狀況[17]。雖然該位點(diǎn)的研究數(shù)量比較多，不過(guò)主要為國(guó)外研究結(jié)果，同時(shí)實(shí)驗(yàn)的對(duì)象也主要是歐美白種人。當(dāng)前國(guó)內(nèi)研究人員在這一位點(diǎn)的研究大部分都同免疫甲狀腺炎先關(guān)，同SLE有聯(lián)系的研究比較少[18]。為進(jìn)一步分析這一位點(diǎn)同SLE發(fā)病之間的聯(lián)系，本研究選取SLE患者行了研究，結(jié)果并未檢測(cè)患者當(dāng)中存在T等位基因的變異。除此之外，我國(guó)其他研究人員的相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CT基因型僅僅存在于錫伯族、蒙古族、赫哲族、回族、哈薩克族以及維族等少數(shù)民族當(dāng)中[19]。本研究當(dāng)中，我們研究基因啟動(dòng)子區(qū)域的-1123G/C位點(diǎn)同SLE發(fā)病之間的聯(lián)系，結(jié)果表明該位點(diǎn)的3種基因型具體分布方面，研究組SLE患者以及對(duì)照組健康人群之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），兩組患者當(dāng)中C等位基因頻率也沒(méi)有顯著差異（P>0.05）。因此可以認(rèn)為該位點(diǎn)多態(tài)性同SLE發(fā)病之間不存在相關(guān)性。

在PTPN22的基因多態(tài)性同狼瘡性腎炎之間的關(guān)系方面，狼瘡性腎炎可以說(shuō)是SLE的常見(jiàn)并發(fā)癥之一，發(fā)病同多種基因存在聯(lián)系[20]。研究人員根據(jù)是否存在狼瘡性腎炎分組研究例西班牙的SLE患者，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)PTPN22在不同患者之間的明顯區(qū)別，因此認(rèn)為PTPN22的多態(tài)性對(duì)狼瘡性腎炎并無(wú)直接的影響，推測(cè)是因?yàn)樽陨砻庖呒膊“l(fā)生的基因基礎(chǔ)比較復(fù)雜，PTPN22出現(xiàn)只是基因變異比較微弱的組成部分[21]。PTPN22的基因多態(tài)性同自身抗體之間的關(guān)系方面，有研究人員認(rèn)為在多發(fā)性硬化以及其他自身免疫疾病當(dāng)中缺乏明確的證據(jù)，推測(cè)該基因在抗體產(chǎn)生過(guò)程當(dāng)中有重要的影響[22]。當(dāng)前已知存在三種不同的自身免疫疾病抗體同PTPN22有明確的聯(lián)系，例如I型糖尿病患者的抗谷氨酸抗體、RA患者的抗心磷脂抗體以及RF患者的自身抗體，推測(cè)PTPN22的變異借助于易化疾病抗體而導(dǎo)致患者出現(xiàn)自身免疫疾病。

國(guó)內(nèi)研究人員采取同本研究類(lèi)似的方法，研究自身免疫性的甲狀腺患者，分析患者的位點(diǎn)情況，結(jié)果顯示該位點(diǎn)在等位基因以及基因型的分布頻率方面，同健康人對(duì)比存在明顯差異，因此認(rèn)為PTPN22啟動(dòng)子-1123G/C位點(diǎn)的多態(tài)性同免疫性甲狀腺的發(fā)生發(fā)展存在重要的聯(lián)系，并且同CTLA-4基因G等位基因存在互相協(xié)同的效果[23]。當(dāng)前情況下，人們還不確定-1123G/C對(duì)于功能異常的影響，有人分析該位點(diǎn)附近的DNA序列，結(jié)果顯示-1123G同轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白4的結(jié)合位點(diǎn)較為匹配。其中后者屬于螺旋-環(huán)-拉鏈家族。-1123G/C在激活蛋白4序列當(dāng)中的中心位置，-1123C基因無(wú)法同已知的各種轉(zhuǎn)錄因子實(shí)現(xiàn)結(jié)合[24]。所以PTPN22當(dāng)中的-1123C會(huì)影響到轉(zhuǎn)錄的效率，使得患者發(fā)生自身免疫性的疾病，PTPN22的雜合優(yōu)勢(shì)同表達(dá)調(diào)節(jié)存在一定的聯(lián)系[25]。本研究并未發(fā)現(xiàn)其SLE患者的發(fā)病同GC基因型的優(yōu)勢(shì)相關(guān)，推測(cè)可能同樣本數(shù)量多少、不同疾病類(lèi)型以及位點(diǎn)易感基因不同的影響因素相關(guān)，還需要后續(xù)的研究加以證實(shí)。

綜上所述，F(xiàn)OXP3基因-2383C/T的多態(tài)性同SLE發(fā)生發(fā)展之間存在顯著的關(guān)聯(lián)性，并且-2383T基因可能是該病重要的遺傳易感基因，同時(shí)PTPN22基因位點(diǎn)1858C/T以及-1123G/C同SLE發(fā)病無(wú)明顯關(guān)聯(lián)性。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 高輝，彭傳梅，付曉野，等. 云南漢族人群Tim-3啟動(dòng)子區(qū)-1516G〉T位點(diǎn)多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡關(guān)聯(lián)性研究[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2015，1（8）：1034-1036.

[2] 彭傳梅，高輝，付曉野，等. 云南漢族人群Tim-1基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡關(guān)聯(lián)性研究[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2014，2（12）：1961-1965.

[3] Wakeland EK，Liu K，Graham RR，et al. Delineating the genetic basis of systemic lupus erythematosus[J]. Immunity，2015，2（15）：397-408.

[4] 衛(wèi)斐然，張育. 系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）與TNIP1基因相關(guān)性的Meta分析[J]. 中華疾病控制雜志，2015，19（11）：1152-1157.

[5] 唐雪梅. 系統(tǒng)性紅斑狼瘡遺傳學(xué)研究進(jìn)展[J]. 中華實(shí)用兒科臨床雜志，2016，31（21）：1601-1604.

[6] Cantor RM，Yuan J，Napier S，et al. Systemic lupus erythematosus genome scan：Support for linkage at 1q23， 2q33，16q12-13，and 17q21-23 and novel evidence at 3p24，10q23-24，13q32，and 18q22-23[J]. Arthritis Rheum，2014，1（50）：3203-3210.

[7] 李媛，李萍，陳華，等. HLA-DQB1基因多態(tài)性與中國(guó)漢族人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡的相關(guān)性[J]. 標(biāo)記免疫分析與臨床，2015，22（1）：37-40.

[8] Tucci M，Barnes EV，Sobel ES，et al. Strong association of a functional polymorphism in the monocyte chemoattractant protein 1 promoter gene with lupus nephritis[J]. Arthritis Rheum 2014，2（50）：1842-1849.

[9] 溫鵬飛，王曉松，張敏，等. IL-6基因單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的相關(guān)性研究[J]. 中華疾病控制雜志，2014，18（4）：277-280.

[10] 章俊，馬亞瓊，邱敏姿，等. 中國(guó)漢族TMEM39A基因單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的相關(guān)性[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，（4）：556-559.

[11] 葉莉霞，付朝偉，江峰，等. 鋅指蛋白基因IKZF3多態(tài)性與中國(guó)長(zhǎng)江以南漢族人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡的病例對(duì)照研究[J]. 中華流行病學(xué)雜志，2016，37（7）：996-1002.

[12] Prokunina L，Alarcon-Riquelme M. The genetic basis of systemic lupus erythematosus-knowledge of today and thoughts for tomorrow[J]. Hum Mol Genet，2014，13（1）：143-148.

[13] 吳成將，袁秋然，莫益姣，等. CD40基因多態(tài)性及血清水平與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究[J]. 中華皮膚科雜志，2016，49（1）：12-16.

[14] 崔曉麗，李紅梅，劉水和，等. IRF2基因rs13146124位點(diǎn)多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的關(guān)聯(lián)性研究[J]. 重慶醫(yī)學(xué)，2016，45（30）：4230-4232.

[15] Siminovitch KA. PTPN22 and autoimmune disease[J]. Nat Genet，2014，3（6）：1248-1249.

[16] 湯珣，束雙雙，王悅，等. 跨膜蛋白39A基因單核苷酸多態(tài)性與中國(guó)南方漢族人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)性研究[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2015，25（30）：33-36.

[17] 溫琦，吳美容，何穎芝，等. IKZF1基因與惡性腫瘤及系統(tǒng)性紅斑狼瘡的相關(guān)性研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2015，23（2）：591-595.

[18] 谷園園，鄒延峰，徐建華，等. 中國(guó)人群中Hsp90AB1基因多態(tài)性和SLE發(fā)病的關(guān)聯(lián)研究[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，51（8）：1151-1155.

[19] Criswell LA，Pfeiffer KA，Lum RF，et al. Analysis of families in the multiple autoimmune disease genetics consortium（MADGC）collection：The PTPN22 620W allele associates with multiple autoimmune phenotypes[J]. Am J Hum Genet，2015，7（6）：561-571.

[20] 李媛，李萍，王立，等. IkB激酶β和DNA聚合酶β易感基因位點(diǎn)與中國(guó)漢族人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡的相關(guān)性研究[J]. 中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2015，19（5）：297-301.

[21] 陳杰，饒亞華，朱建華. 漢族人中MFG-E8基因的多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的關(guān)系[J].免疫學(xué)雜志，2015，1（11）：1009-1012.

[22] 鄭朝暉，榮玉璽，吳振彪. 系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2015，31（8）：1128-1132.

[23] Kyogoku C，Langefeld CD，Ortmann WA，et al. Genetic association of the R620W polymorphism of protein tyrosine phosphatase PTPN22 with human SLE[J]. Am J Hum Genet， 2014，7（5）：504-507

[24] 姚承佼，鐘曉武，黃翠平，等. DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因多態(tài)性與自身免疫性疾病關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 山東醫(yī)藥，2016，1（4）：91-93.

[25] 劉春麗，蔡輝. 系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的感染[J]. 中國(guó)免疫學(xué)雜志，2015，2（6）：852-854.

（收稿日期：2016-11-11）