梔子對(duì)大鼠腸道菌群及血清細(xì)胞因子的影響

俞琦++梁建東++王平+田維毅

【摘要】目的：觀察梔子對(duì)大鼠腸道菌群和血清細(xì)胞因子的影響。方法：將40只大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、抗生素對(duì)照組和梔子高/中/低劑量組，抗生素對(duì)照組和梔子高、中、低劑量組分別給予鹽酸林可霉素和不同劑量梔子水提物灌胃，正常對(duì)照組代以生理鹽水，連續(xù) 14d。觀察各組大鼠一般情況，檢測(cè)大鼠腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌和腸桿菌菌群數(shù)量，及血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、γ-干擾素（IFN-γ）表達(dá)水平。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，抗生素對(duì)照組和梔子中、高劑量組大鼠出現(xiàn)腹瀉，體質(zhì)量明顯下降（P<001）；抗生素對(duì)照組大鼠腸道內(nèi)4種菌群數(shù)量均發(fā)生明顯改變（P<005或P<001）；梔子中、高劑量組大鼠腸桿菌菌群數(shù)明顯降低（P<005或P<001），雙歧桿菌、乳酸桿菌和腸球菌菌群無(wú)明顯變化；梔子中劑量組大鼠血清TNF-α水平明顯下降（P<005）；梔子高劑量組大鼠血清TNF-α和IL-6水平明顯降低（P<005或P<001）。結(jié)論：梔子對(duì)腸道菌群有一定影響，但不引起腸道菌群失調(diào)，梔子可下調(diào)血清TNF-α和IL-6水平，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

【關(guān)鍵詞】梔子；大鼠；腸道菌群；細(xì)胞因子

【中圖分類號(hào)】R2855【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2017）07-0029-03

中藥梔子（Gardenia jasminoides Ellis）是茜草科植物梔子的干燥成熟果實(shí)，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒的功效，臨床主要用于急性黃疸型肝炎、膀胱炎、目赤腫痛、上消化道出血等癥[1]。梔子性味苦、寒，歸心、肺、三焦經(jīng)，為常見的苦寒藥物。歷代醫(yī)藥學(xué)家認(rèn)為其苦寒礙胃，有耗氣傷陰之弊?，F(xiàn)代研究表明[2]，苦寒中藥可通過干預(yù)腸道菌群的種類、數(shù)量、比例、定位等生態(tài)因素，影響腸道代謝和免疫防御等功能。本研究擬建立不同劑量的梔子水提物灌胃模型，觀察梔子對(duì)大鼠腸道中4種優(yōu)勢(shì)菌群和血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、γ-干擾素（IFN-γ）表達(dá)的影響，探討苦寒藥梔子對(duì)腸道生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)作用，為其臨床的合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

1儀器與材料

11動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠40只，雌雄各半，體重（200±20）g，購(gòu)于重慶滕鑫生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK-（軍）2012-0011。

12材料梔子購(gòu)于北京同仁堂貴陽(yáng)藥店，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院生藥教研室鑒定為正品。鹽酸林可霉素注射液（河南天方藥業(yè)有限公司，批號(hào)070120049），雙歧桿菌BS培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂（青島海博生物技術(shù)有限公司），伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB培養(yǎng)基，杭州微生物試劑有限公司），大鼠TNF-α、IL-6和IFN-γ ELISA檢測(cè)試劑盒（武漢博士德生物有限公司）。

13[JP2]儀器SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)（蘇州凈化）；厭氧培養(yǎng)袋（日本三菱）；371型培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；高速低溫離心機(jī) 5804D（德國(guó)Eppendorf公司）。[JP]

2方法

21中藥水提物的制備按照規(guī)范制劑要求，常規(guī)制備梔子水提液，調(diào)整濃度相當(dāng)于生藥2g/mL冷藏備用。

22動(dòng)物分組及處理取40只大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、抗生素對(duì)照組及梔子高、中、低劑量組，每組8只。梔子水提液以成年人（按60kg計(jì)算）常規(guī)用藥劑量的等效劑量為中劑量，大劑量為中劑量 5倍，小劑量為中劑量的 1/5。即梔子高、中、低劑量組分別以75、15、03g/kg灌胃給藥，抗生素對(duì)照組給予鹽酸林可霉素灌胃[3]，各組給藥體積為2mL/只，正常對(duì)照組給予等體積生理鹽水，每日1 次，連續(xù) 14d。

23一般情況觀察觀察和記錄各組大鼠活動(dòng)、飲食、排便情況，用藥第1天、第7天、第14天稱量各組大鼠體質(zhì)量，記錄大鼠體質(zhì)量變化。

24主要菌群分析末次給藥24h后，大鼠股靜脈取血，4℃靜置過夜，離心取上清，置于-20℃冰箱待測(cè)。參照文獻(xiàn)[4]，處死各組大鼠，剪開腹腔，無(wú)菌操作取盲腸內(nèi)容物01g，[JP2]放入無(wú)菌試管內(nèi)，加09mL生理鹽水，均勻震蕩15min，將震蕩好的溶液進(jìn)行10倍系列稀釋至10-9，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用合適的稀釋度，分別接種于各種培養(yǎng)基中，雙歧桿菌：BS培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)72 h；乳桿菌：MRS培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)48h；腸桿菌：EMB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48h；腸球菌：膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂，37℃培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后計(jì)數(shù)菌落，根據(jù)稀釋度換算每g糞便中的細(xì)菌數(shù)，結(jié)果以菌落形成單位/克（CFU/g）的對(duì)數(shù)表示，即lg CFU/g。[JP]

25血清細(xì)胞因子水平檢測(cè)取凍存血清，采用ELISA法，測(cè)定TNF-α、IL-6和IFN-γ水平，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

26統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS 190軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x[TX-*3]±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P<005表示差異有統(tǒng)計(jì)意義。

3結(jié)果

31梔子對(duì)大鼠一般情況的影響正常對(duì)照組和梔子低劑量組大鼠進(jìn)食和飲水量正常，被毛光滑致密，無(wú)腹瀉；梔子中劑量組大鼠進(jìn)食量逐漸下降，活動(dòng)減少，毛色光澤度降低，出現(xiàn)腹瀉，排稀便?？股貙?duì)照組和梔子高劑量組大鼠進(jìn)食飲水明顯減少，腹瀉較重，畏寒倦怠，被毛凌亂無(wú)光澤。灌胃后，隨時(shí)間延長(zhǎng)各組大鼠體質(zhì)量逐漸上升，但抗生素對(duì)照組、梔子高劑量組上升緩慢，且在用藥后期呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。與正常對(duì)照組比較，用藥第7 天，抗生素對(duì)照組和梔子高劑量組大鼠體質(zhì)量顯著降低（P<005）；用藥第14 天，抗生素對(duì)照組和梔子中、高劑量組大鼠體質(zhì)量均明顯下降（P<001）。

4討論

苦寒藥物是最常用的中藥類別之一，在臨床各科有著廣泛應(yīng)用。苦寒藥大多有瀉下之功，長(zhǎng)期或大量使用容易導(dǎo)致腹部隱痛、腹脹、腹瀉等癥狀。人和動(dòng)物胃腸道定居著種類復(fù)雜和數(shù)量龐大的正常微生物群，它們與機(jī)體間形成了互利共生的關(guān)系，保持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，并對(duì)機(jī)體的物質(zhì)代謝和免疫防御起著重要作用。包括藥物在內(nèi)的某些因素導(dǎo)致正常菌群的數(shù)量和比例發(fā)生大幅度改變時(shí)即為菌群失調(diào)，常引起急慢性腹瀉和免疫功能紊亂等表現(xiàn)[5]。梔子是臨床常用的苦寒中藥，為了探討梔子對(duì)腸道微生態(tài)和機(jī)體免疫的影響，本研究觀察了口服梔子水提物對(duì)大鼠4種優(yōu)勢(shì)腸道菌群和血清細(xì)胞因子表達(dá)的影響。

結(jié)果顯示，梔子中、高劑量可引起大鼠腹瀉、體質(zhì)量減輕，提示連續(xù)服用較大劑量梔子具有明顯的瀉下作用。梔子低劑量對(duì)4種腸道優(yōu)勢(shì)菌群無(wú)影響，中、高劑量對(duì)大鼠腸道內(nèi)腸桿菌有一定抑制作用，但不影響雙歧桿菌、乳酸桿菌和腸球菌的數(shù)量，提示梔子的應(yīng)用沒有導(dǎo)致大鼠菌群失調(diào)，而是起到調(diào)節(jié)腸道菌群的作用。雙歧桿菌和乳桿菌被認(rèn)為是腸道的益生菌，可維持腸道的健康環(huán)境，并通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制阻礙致病菌的黏附與定植，其產(chǎn)生的有機(jī)酸等代謝產(chǎn)物還能抑制或殺死有害生物[6]。梔子保持雙歧桿菌、乳桿菌菌群的相對(duì)穩(wěn)定，提示該藥對(duì)腸粘膜可能有重要的保護(hù)效應(yīng)。

TNF-α、IL-6和IFN-γ是由多種免疫細(xì)胞分泌的炎性細(xì)胞因子，介導(dǎo)機(jī)體組織細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和功能調(diào)控，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫并引起炎癥反應(yīng)。羅霞等[7]、孫必強(qiáng)等[8]認(rèn)為菌群失調(diào)與炎癥因子的釋放水平相關(guān)。研究顯示，抗生素對(duì)照組大鼠血清TNF-α、IL-6和IFN-γ水平均顯著升高，提示菌群失調(diào)可能與炎癥反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)，與文獻(xiàn)研究一致[7-8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，梔子未導(dǎo)致明顯菌群失調(diào)，但不同程度地抑制了大鼠血清中TNF-α和IL-6的釋放，提示該藥對(duì)機(jī)體細(xì)胞因子的釋放具有不同程度的調(diào)節(jié)作用，其調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1][JP3]傅春升，婁紅祥，張學(xué)順，等.梔子的化學(xué)成分與藥理作用[J].國(guó)外醫(yī)藥·植物藥分冊(cè)，2004，19（4）：152.[JP]

[2][JP3] 吳云，陳瑞，田維毅.苦寒中藥對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)影響的研究進(jìn)展[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2015，27（2）：235-239.[JP]

[3] 于蓮，張靈芝，馬淑霞，等.納米山藥多糖合生元結(jié)腸靶向微生態(tài)調(diào)節(jié)劑對(duì)菌群失調(diào)大鼠細(xì)胞因子和凋亡蛋白表達(dá)影響[J].中國(guó)新藥雜志，2016，25（24）：2871-2875.

[4] 林曦，謝曉煌，吳仕嬌，等.甲嘎松湯對(duì)急性肝損傷小鼠腸道菌群及細(xì)胞因子的影響[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016，22（10）：10-17.

[5] 祝司霞.腸道菌群失調(diào)與疾病[J].科技信息，2012（25）：446.

[6] 王福穎.德氏乳桿菌微膠囊性能評(píng)價(jià)及對(duì)腸道菌群調(diào)節(jié)作用研究[D].哈爾濱： 黑龍江大學(xué)，2014.

[7] 羅霞，羅爽，鄭彥懿，等.腸道菌群失調(diào)增加小鼠腸上皮內(nèi)T淋巴細(xì)胞活化和促炎細(xì)胞因子分泌[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2016，32（8）：1031-1035.

[8]孫必強(qiáng)，周英，劉衛(wèi)東，等.不同劑型七味白術(shù)散對(duì)腸道菌群失調(diào)小鼠腸黏膜和血清 TNF-α，IL-6的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2016，22（4）：95-100.