藏藥材山柳葉糖芥顯微及薄層色譜鑒別

普珍++澤仁拉姆+張勇倉+王聚樂

【摘要】目的：建立藏藥材山柳葉糖芥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系。方法：采用顯微鑒別法與薄層色譜法對樣品進(jìn)行鑒別。結(jié)果：制定了藏藥材山柳葉糖芥的顯微特征標(biāo)準(zhǔn)，建立了其薄層色譜定性檢測方法。結(jié)論：兩種方法簡便、可行、操作性強，為該藥材的質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】山柳葉糖芥；顯微鑒別；薄層色譜鑒別

【中圖分類號】R2841【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2017）07-0008-02

【摘要】目的：完善2015年版《中國藥典》蒲黃項下草蒲黃和蒲黃炭的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：收集整理草蒲黃和蒲黃炭現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，增訂藥典中僅來源處提到的草蒲黃的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，增訂了性狀、顯微鑒別、薄層鑒別、水分、總灰分和含量測定項目，同時增訂蒲黃炭的總灰分、雜質(zhì)項目。結(jié)果：草蒲黃增加的性狀、顯微鑒別、薄層鑒別、水分、總灰分、雜質(zhì)和含量測定項目，蒲黃炭增加的雜質(zhì)、總灰分等項目能有效反映草蒲黃與蒲黃炭的質(zhì)量情況；草蒲黃薄層色譜中斑點清晰，專屬性強；香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷分別在 0048～0951μg（r=09999） 、0046～0920μg（r=09999） 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為 9906% （RSD為125%） 、9823%（ RSD為140%）。結(jié)論：修訂后的標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)確有效，可用于草蒲黃與蒲黃炭的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】草蒲黃；蒲黃炭；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高

【中圖分類號】R2841【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2017）07-0010-05

Study on the Quality Standard of Pollen Typhae with Staminate Flower and Carbo of Typhae Pollen in Chinese Pharmacopoeia （2015 Edition）

LIN Chunyan1，2DONG Yuan2ZHANG Yunhua2LI Zhongqiong2ZHANG Wenjie2ZHOU Zhihong1*

1 Yunnan University of TCM， Kunming 650000， China； 2Yunnan Insitute for Food and Drug Control， Kunming 650000， China

Abstract：Objective To improve the quality standard of Pollen Typhae with staminate flower and Carbonized Typhae Pollen Methods the current standards of Pollen Typhae with staminate flower and Carbonized Typhae Pollen are collectedDescriptive Information，The micro-identification，TLC identification， the water inspection， the total ash inspection and HPLC determination of total contents of Typhaneoside and Isorhamnetin-3-O-neohespeidoside in Pollen Typhae with staminate flower were addedAt the same time， the total ash and impurity inspection in Carbonized Typhae Pollen were added Results These added items of Pollen Typhae with staminate flower and Carbonized Typhae Pollen can effectively reflect their quality situation The sports were fairly clear and visible in TLC of Pollen Typhae with staminate flower，The contents of Typhaneoside and Isorhamnetin-3-O-neohespeidoside showed a good linear relationship in the range of 0048 ～0951μg （r= 0 999 9） and 0046 ～0920μg（r=0 999 9），respectivelyThe average recoveries were 9906% with RSD of 1 25% and 9823% with RSD of 140%，respectively Conclusion The revised standard is accurate，effective and can be usd to control the quality of Pollen Typhae with staminate flower and Carbonized Typhae Pollen

Keywords：Pollen Typhae with Staminate Flower； Carbonized Typhae Pollen； Quality Standard Improvemen

蒲黃為香蒲科植物水燭香蒲Typha angustifolia L、東方香蒲Typha orientalis Presl或同屬植物的干燥花粉。蒲黃性甘，平。歸肝、心包經(jīng)。具有止血，化瘀，通淋的功效[1]。其主要含有甾類成分、黃酮類成分、酸性成分等，其中黃酮類成分香蒲新苷和異鼠李素-3-O新橙皮苷為主要的質(zhì)控指標(biāo)[2]。文獻(xiàn)報道[3]，蒲黃止血化瘀作用明顯，對凝血過程有顯著影響，同時蒲黃提取液能改善心血管系統(tǒng)微循環(huán)，降血脂，對動脈粥樣硬化也有一定的改善作用。在臨床上主要用于治療心血管疾病，眼出血以及婦科疾病。

草蒲黃與蒲黃植物來源一致，同為中藥蒲黃入藥。有效成分基本相同[4]、藥理作用、臨床功效主治也基本一致。二者不同之處在于，蒲黃為純花粉，而草蒲黃則為帶有雄花的花粉，即花藥、花絲和花粉的混合物[1，5]。草蒲黃雖收載于藥典蒲黃項下，但無任何質(zhì)量控制指標(biāo)；收載于寧夏、甘肅等多個地方標(biāo)準(zhǔn) [6-9]，但同樣存在項目設(shè)置不全的問題，見表1。故對藥典中草蒲黃質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行增訂研究，解決草蒲黃標(biāo)準(zhǔn)缺失的問題。

蒲黃炭為“凈蒲黃照炒炭法（附錄Ⅱ D）炒至棕褐色”的炮制品。在功效方面增強了蒲黃的止血作用，偏于涼血止血。蒲黃炭作為飲片收載于藥典蒲黃項下，但與蒲黃藥材相比檢驗項目較少，缺少雜質(zhì)、灰分等質(zhì)量控制關(guān)鍵性指標(biāo)，所以對藥典中蒲黃炭的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究增訂。

1儀器與材料

11儀器Aglient 1260高效液相色譜儀， TB-215D電子分析天平。

12材料香蒲新苷（批號：111573-201405）、異鼠李素-3-O-新橙皮苷對照品（批號：111571-201205）購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。

草蒲黃樣品4批，蒲黃炭樣品11批，均來自2015年藥材及飲片國家評價性抽樣。樣品均由云南省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院中藥所張雯潔所長鑒定，為草蒲黃藥材及蒲黃炭飲片，來源為香蒲科植物水燭香蒲Typha angustifolia L、東方香蒲Typha orientalis Presl或同屬植物的干燥花粉。

2草蒲黃

21性狀本品為花粉、花藥及花絲的混合品，花粉占多數(shù)，呈黃色粉末，細(xì)膩，手捻有光滑感，易附于手指上。花藥短線狀，長02～03cm，棕黃色，具四棱，棱槽明顯，頂端呈褐色至黑褐色，手捻易碎，有的花藥已碎斷?；ńz絲狀，不規(guī)則彎曲或纏繞成團(tuán)，棕黃色，手捻易成團(tuán)。氣微，味淡[1，7]。

2 2顯微鑒別取草蒲黃粉末，置顯微鏡下觀察：本品粉末黃色?；ǚ哿ｎ悎@形或橢圓形，直徑17～29μm，表面有網(wǎng)狀雕紋，周邊輪廓線光滑，呈凸波狀或齒輪狀，具單孔，不甚明顯，花藥、花絲薄壁細(xì)胞中含有草酸鈣針晶?；ǚ勰覂?nèi)壁細(xì)胞具螺旋狀紋理[1， 7]。

2 3薄層色譜鑒別取本品2g，加80%乙醇50mL，冷浸24h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水5mL使溶解，濾過，濾液加水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次5mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加乙醇2mL使溶解作為供試品溶液。另取異鼠李素-3-O-新橙皮苷對照品、香蒲新苷對照品，加乙醇制成每1mL各含1mg的混合溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（2015版藥典四部0502）試驗吸取上述兩種溶液各2μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以丙酮-水（1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點[1，5，10]。見圖2。

231點樣量的考察考察對照品的不同點樣量，點樣量為1～3μL時都能取得較好的效果，4uL時已經(jīng)有過載的現(xiàn)象，故樣品點樣量選擇為2μL。

232檢測限的考察當(dāng)大于或者等于混合對照溶液（香蒲新苷濃度為01017 mg/mL，異鼠李素-3-O-新橙皮苷濃度為01052 mg/mL）濃度時，可見香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷斑點。故定香蒲新苷檢出限為01μg，異鼠李素-3-O-新橙皮苷檢出限為02μg。

24水分據(jù)藥典2015版通則0832第二法測定，結(jié)果見表3。4批草蒲黃水分平均值為80%。草蒲黃與蒲黃植物來源一致，水分限度可參照藥典中蒲黃藥材水分限度（不得過130%）制定，結(jié)果顯示4批草蒲黃水分均在該限度范圍內(nèi)。故草蒲黃水分限度定為：不得過130%。

25總灰分據(jù)藥典2015版通則2302測定，結(jié)果見表3。4批草蒲黃總灰分平均值為79%。草蒲黃與蒲黃植物來源一致，總灰分限度可參照藥典中蒲黃藥材總灰分限度（不得過100%）制定，結(jié)果顯示4批草蒲黃總灰分均在該限度范圍內(nèi)。故草蒲黃總灰分限度定為：不得過100%。

26酸不溶性灰分據(jù)藥典2015版通則2302測定，結(jié)果見表3。4批草蒲黃酸不溶性灰分平均值為14%。草蒲黃與蒲黃植物來源一致，酸不溶性灰分限度可參照藥典中蒲黃藥材酸不溶性灰分限度（不得過40%）制定，結(jié)果顯示4批草蒲黃酸不溶性灰分均在該限度范圍內(nèi)。故草蒲黃酸不溶性灰分限度定為：不得過40%。

27含量測定

271色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗色譜柱為Agilent ZORBAX C18柱（46mm×250mm，5μm）；以乙腈-005%磷酸溶液（15∶85）為流動相，等度洗脫，洗脫時間為35min；檢測波長為254nm。流速為10mL/min，柱溫35℃；進(jìn)樣量5μL。理論板數(shù)按異鼠李素-3-O-新橙皮苷峰計算應(yīng)不低于5000[1，7，10-11]。

272對照品溶液的制備取異鼠李素-3-O-新橙皮苷對照品、香蒲新苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL各含50μg的溶液，即得[8]。

273供試品溶液的制備取本品約05g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定重量，冷浸12h后加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

274專屬性試驗精密吸取對照品溶液、供試品溶液，依法測定，結(jié)果表明香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷對照品分離度良好，空白溶劑無干擾。見圖3。

275線性關(guān)系考察精密稱取香蒲新苷001226g，異鼠李素-3-O-新橙皮苷001234g。分別至50mL容量瓶，加甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻，得儲備液，濃度分別為香蒲新苷23784400μg/mL，異鼠李素-3-O-新橙皮苷23001760μg/mL。分別精密量取5mL至同一25mL容量瓶，加甲醇定容至刻度，搖勻，得混合對照品溶液，濃度為香蒲新苷4756880μg/mL，異鼠李素-3-O-新橙皮苷4600352μg/mL。分別精密吸取各對照品溶液1、4、8、10、20μL注入液相色譜儀，依法測定，以峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的對照品進(jìn)樣量X（μg） 為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。香蒲新苷回歸方程為 y=15758x-25195（r=0 9999），在0048～0951μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；異鼠李素-3-O-新橙皮苷的直線回歸方程為y=20082x-24698 （r=0 999 9），在 0046～0920μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

276精密度試驗精密吸取對照品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣 6 次，依法測定，結(jié)果香蒲新苷的 RSD 為039% 、異鼠李素-3-O-新橙皮苷的 RSD 為 040%，表明本法進(jìn)樣精密度良好。

277穩(wěn)定性試驗精密吸取同一份供試品溶液（樣品2），分別于0、6、12、18、24、30、36、42、48h進(jìn)樣，依法測定峰面積，結(jié)果香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷峰面積的RSD 分別為 056%、016%，表明制備的供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。

278重復(fù)性試驗取同一批號的供試品（樣品2）適量，按“273”項下方法制備 6 份供試液，依法測定并計算香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷的總量，結(jié)果 6 份供試品的平均含量為058%，其RSD為057%，表明本法重復(fù)性良好。

279加樣回收率試驗取同一批已知含量的供試品（樣品2） 6 份，精密稱定，每份約025g，分別精密加入香蒲新苷對照品溶液（ 濃度為23784400μg/mL）27mL和異鼠李素-3-O-新橙皮苷（濃度為23001760μg/mL） 32mL，低溫蒸干，按“273”項下方法制備供試品溶液，依法測定香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷的含量并分別計算回收率，結(jié)果香蒲新苷的平均回收率為9906%，其RSD為 125%；異鼠李素-3-O-新橙皮苷的平均回收率為9825%，其RSD為140%。結(jié)果表明回收率良好。

2710樣品測定取4批樣品，按 “2 7 3”項下方法制備供試品溶液，依法測定，按外標(biāo)法計算。另外，蒲黃花粉粒大小為17～29μm，能夠通過九號篩，而其他植物組織粉碎后也較難通過九號篩。所以測定樣品能通過9號篩的百分比能大概了解花粉在草蒲黃中所占比例。

對11批次蒲黃炭樣品依據(jù)藥典方法進(jìn)行總灰分及雜質(zhì)的測定，結(jié)果顯示總灰分與雜質(zhì)測定結(jié)果高的樣品都為摻雜較多的樣品。如圖4，雜質(zhì)檢測結(jié)果高的樣品多為摻入花絲、花藥或其他未知植物組織的碎片，這些碎片一般較大難以通過七號篩?？偦曳謾z測結(jié)果高的樣品在顯微鏡下常見亮片狀物質(zhì)，疑似為無機物摻假，無機物在高溫下無法炭化，導(dǎo)致總灰分較高?？梢婋s質(zhì)和總灰分是蒲黃炭飲片質(zhì)量控制的兩個關(guān)鍵因素，必須進(jìn)行控制，故增訂了這兩個項目。由于蒲黃炭的炮制過程并不會對灰分，雜質(zhì)等項目產(chǎn)生很大影響，所以參考蒲黃藥材在2015版藥典中的限度，將限度值暫定為“雜質(zhì)不得過100%，總灰分不得過100%”。

4討論

草蒲黃為花粉、花藥、花絲的混合品，故性狀和顯微鑒別項下應(yīng)有對花藥、花絲的描述。參考地方藥材標(biāo)準(zhǔn)，增加了對花藥、花絲的描述，考察樣品情況，與之相符。

鑒于草蒲黃與蒲黃同來源，薄層色譜鑒別和含量測定的方法應(yīng)該同樣適用于草蒲黃，故采用，并對這兩個方法進(jìn)行詳細(xì)的方法學(xué)驗證，證明對于草蒲黃樣品的適用性。

本研究考察了三根不同商品規(guī)格的同類填料色譜柱（Welch C18柱（46mm×250mm）和Agilent C18（46mm×150mm））測定同一批草蒲黃樣品（樣2），結(jié)果兩種色譜柱的理論板數(shù)均大于10000，各主峰間的分離度良好，測得含量分別為0584%、0585%，其RSD為 015%，表明本色譜條件的耐用性良好。

由于草蒲黃為花粉、花絲和花藥的混合物，草蒲黃雜質(zhì)較蒲黃高屬正?，F(xiàn)象，同時4批草蒲黃樣品雜質(zhì)差異較大，抽自河南的樣品雜質(zhì)最高（達(dá)53%），但香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮苷的含量與其他批次草蒲黃相比并不低，表明雜質(zhì)不是草蒲黃質(zhì)量控制的關(guān)鍵因素。故未對草蒲黃的雜質(zhì)項進(jìn)行控制。

[JP+1]藥典中規(guī)定蒲黃含量測定結(jié)果為：“本品按干燥品計算，含異鼠李素-3-O-新橙皮苷（C28H32O16）和香蒲新苷（C34H42O20）的總量不得少于050%。”，表4結(jié)果顯示，除1批次草蒲黃樣品的含量為042%偏低外， 其余樣品含量均高于05%。根據(jù)能通過9號篩的百分比，大略可知草蒲黃中所含花粉質(zhì)量均大于50%，考慮到不同來源的草蒲黃的含量差異及測定誤差，結(jié)合實測值，擬定草蒲黃按干燥品計算，含異鼠李素-3-O-新橙皮苷（C28H32O16）和香蒲新苷（C34H42O20）的總量不得少于025%。[JP]

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藏藥是我國傳統(tǒng)藥學(xué)的一個重要組成部分，在青藏高原地區(qū)有著廣泛的應(yīng)用基礎(chǔ)和悠久的歷史。[JP2]目前，許多藏藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)停留在經(jīng)驗鑒別及簡單的理化鑒別階段，尤其是地方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未能很好控制藏藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。藏藥材山柳葉糖芥（藏文名：岡托巴）是《中華本草》藏藥卷（2002）[1][JP]所收載的藥材之一，為十字花科植物山柳菊葉糖芥Erysimum hieracifolium L的種子，具有清熱、鎮(zhèn)咳、解毒的功效，臨床主要用于熱癥，肺病，肉食中毒、血熱等。目前該藥材質(zhì)量控制方面僅有性狀鑒別，沒有現(xiàn)代分析技術(shù)，不能有效控制其質(zhì)量。本研究采用顯微鑒別法與薄層色譜鑒別法對該藥材進(jìn)行定性鑒別，并建立了藏藥材山柳葉糖芥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系。

1儀器與材料

11儀器FA2004B電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（上?？莆鰧嶒瀮x器廠）；JP2FⅠ-Ⅱ型紫外分析儀（上海嘉明馬科技有限公司）；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 （上海精科實驗有限公司）；OLYMPUS-BX51高級熒光顯微鏡；TSView顯微照相機。

12材料藏藥材山柳葉糖芥的種子，采自西藏林芝魯朗、米林、松多，經(jīng)西藏自治區(qū)食品藥品檢驗所阿萍主任藥師鑒定為十字花科植物山柳菊葉糖芥Erysimum hieraci folium L的種子。洋地黃毒苷對照品（上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司），無水乙醇（批號：20060516，天津市博迪化工有限公司）；甲醇（批號：20060414，天津市博迪化工有限公司）；乙酸乙酯（批號：20061109，天津市德才工貿(mào)有限公司），硅膠G板（青島高能達(dá)化工有限公司）。

2方法

21顯微鑒別參照顯微鑒別法（《中國藥典》2005年版第一部附錄II C）[2]項下的方法制片觀察。

22薄層色譜鑒別

221供試品溶液的制備取本品粉末1g，用90%乙醇15mL，加熱回流提取1h，提取液濾過濾，濃縮，加2mL甲醇溶解，作為供試品溶液。

222對照品溶液的制備精密稱取洋地黃毒苷加甲醇制成03mg/mL的對照品溶液。

223薄層色譜法按照《中國藥典》2005年版第一部附錄Ⅵ B試驗[2]，吸取上述兩種溶液各10μL，分別點于同一以硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（16∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化銻氯仿溶液進(jìn)行顯色，在100℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365nm） 下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。

3結(jié)果

31顯微鑒別

311種子橫切面顯微鑒別本品種皮表皮細(xì)胞細(xì)胞壁多破碎，為一層黏液細(xì)胞，細(xì)胞類圓形或多角形。柵欄細(xì)胞一列，內(nèi)壁及側(cè)壁增厚，細(xì)胞常柱形，排列較整齊，柵欄細(xì)胞內(nèi)側(cè)為1列厚壁細(xì)胞。近內(nèi)胚乳的外側(cè)為2～3列薄壁細(xì)胞，細(xì)胞長圓形或類圓形。內(nèi)胚乳細(xì)胞多角形，內(nèi)含油滴。最內(nèi)層為子葉細(xì)胞，類圓形，含脂肪油滴。見圖1。

312粉末顯微鑒別本品粉末黃棕色，略顯油潤。種皮柵欄細(xì)胞多見，表面觀多角形，側(cè)面觀常長柱形。厚角細(xì)胞可見，細(xì)胞壁不均勻增厚，類圓形或多角形。胚乳細(xì)胞較多，內(nèi)含深棕色物質(zhì)及脂肪油滴。黃色脂肪油滴較多，圓形或類圓形。見圖2。

32薄層色譜鑒別不同產(chǎn)地藏藥材山柳葉糖芥平行條件下進(jìn)行薄層色譜，結(jié)果如圖3所示。

4討論

藏藥材山柳葉糖芥的質(zhì)量控制方面僅有性狀鑒別，沒有現(xiàn)代分析技術(shù)，不能有效控制其質(zhì)量。本文采用顯微鑒別法與薄層色譜鑒別法對該藥材進(jìn)行定性鑒別，并建立了藏藥材山柳葉糖芥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系。

按照《中國藥典》2005年版第一部附錄II C（顯微鑒別法） [2]項下的制片觀察，該方法簡便、可行、操作性強，且由圖1、圖2結(jié)果顯示其顯微鑒別特征明顯。

山柳葉糖芥含強心苷類，實驗以洋地黃毒苷作為標(biāo)準(zhǔn)對照品。以乙酸乙酯-甲醇-水（16∶1∶1）為展開劑，置紫外燈（365nm）下觀察供試品色譜，在與洋地黃毒苷苷對照品相應(yīng)的位置上顯相同的熒光斑點，說明本次建立薄層色譜鑒別方法簡便、可行、操作性強。

參考文獻(xiàn)

[1]中華本草編委會.中華本草（藏藥卷）[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2002：66-67.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

（收稿日期：2017-07-23編輯：程鵬飛）