仙茅多糖對巨噬細胞分泌幾種活性因子的影響

王曉敏 宣錦 盧芳國++田維毅 楊娟??蔡琨

【摘要】目的：觀察仙茅多糖對體外培養(yǎng)的巨噬細胞分泌幾種活性因子的影響，以期探索仙茅多糖活化巨噬細胞的部分機制。方法：將仙茅多糖體外與RAW2647巨噬細胞共同培養(yǎng)36h，ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1的含量，Griess比色法檢測培養(yǎng)上清中NO的含量。結果：與空白對照組比較，仙茅多糖高、中劑量組TNF-α、IL-1和NO等活性因子的水平明顯升高（P<005或P<001），且與陽性對照組的調節(jié)趨勢相似。結論：仙茅多糖刺激巨噬細胞分泌TNF-α、IL-1和NO等活性因子可能是其活化巨噬細胞的重要機制。

【關鍵詞】仙茅多糖（COP）；巨噬細胞；活性因子；腫瘤壞死因子-α；一氧化氮；白介素-1

【中圖分類號】R2855【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2017）07-0032-04

The Effect of Polysaccharide Extracted from Curculigo Orchioides Gaertn on Several Active Factors in RAW2647 Cells

WANG Xiaomin1XUAN Jin1LU Fangguo3TIAN Weiyi1YANG Juan2*CAI Kun1，3*

1.Guiyang college of traditional Chinese medicine，Guiyang 500025，China；2. Natural products chemistry，Chinese academy of sciences key laboratory of guizhou province，Guiyang 550002，China；3.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China

Abstract：Objective To investigate the effect of Polysaccharide extracted from Curculigo Orchioides Gaertn（COP） on several active factors in RAW2647 cells and explore the partial mechanism of how COP activates macrophages.Methods Macrophages co-culture with COP for 36h in vitro. TNF-α and IL-1 production of the cells induced by COP were measured by ELISA.NO production in supernatant was measured by Griess reagent.Results Compared with normal control group，COP significantly increased TNF-α、IL-1和NO production （P<005 or P<001）in 12500 and 6250μg/mL COP groups.And its adjustment trend is similar with the LNT group.Conclusion The effect of COP on these active factors in RAW264.7 cells may be the most important mechanism of how it activates macrophages.

Keywords：COP；Macrophages； Active Factors；TNF-a； NO ；IL-1

研究表明，多數(shù)中藥多糖類成分具有較好的免疫調節(jié)作用，且相對毒性較低，是開發(fā)免疫調節(jié)制劑的較好來源[1-6]。中藥仙茅為石蒜科多年生草本植物仙茅（Curculigo orchioides Gaertn）根莖，具有補腎助陽、益精血、強筋骨、行血消腫等功效，主要用于腎陽不足、虛勞內傷等癥[7]，是貴州苗族人民常用的一種藥物。仙茅多糖（Curculigo orchioides Gaertn polysaccharide，COP）是從仙茅中經(jīng)水提醇沉后得到，前期研究發(fā)現(xiàn)，COP具有調節(jié)免疫、抗氧化作用[8-9]，并觀察到COP可以增強環(huán)磷酰胺所致的免疫低下小鼠模型的免疫功能，且對小鼠腹腔巨噬細胞的作用尤為顯著，但機制尚不清楚。巨噬細胞作為機體重要的抗原提呈細胞，其分泌的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、一氧化氮（NO）等活性因子，是巨噬細胞參與特異性免疫應答的重要物質基礎[10-14]。為了研究COP對巨噬細胞功能的調節(jié)機制，研究主要觀察COP對小鼠RAW2647巨噬細胞釋放TNF-α、IL-1、NO等活性因子的影響。香菇多糖具有免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗衰老作用且具有組分單一、質量穩(wěn)定、療效好、毒副作用小等優(yōu)點[15]，它具有激活巨噬細胞的能力，并且已經(jīng)被廣泛應用于國內外臨床，故研究選取其為陽性對照藥物。

1儀器與材料

[JP+1]11儀器USA3131水套式CO2培養(yǎng)箱（美國熱電）；酶聯(lián)免疫檢測儀（美國熱電）；離心機（德國）。[JP]

12材料Mouse TNF-α ELISA試劑盒（批號：DKW12-2720-096）、Mouse IL-1β ELISA試劑盒（DKW12-2012-096）購自北京達科為生物技術有限公司； NO檢測試劑盒（批號：E03N0041，BLUEGENE）； Dulbeccos Modified Eagle Media（DMEM）培養(yǎng)液（批號，SH3002201HyClone）；胎牛血清FBS（批號：20150914，浙江天杭生物科技有限公司）、胰酶（批號：J140032，HyClone，）以及香菇多糖LNT（批號：C11N6Y5663，上海源葉生物科技有限公司）。

13實驗細胞小鼠單核巨噬細胞細胞（RAW 2647細胞）購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細胞庫，編號為：KCB200603YJ。

14[JP3]實驗藥物仙茅多糖由貴州省中國科學院天然化學產(chǎn)物重點實驗室提供，多糖含量≥50%。多糖溶于DMEM中配制成濃度為50000μg/mL的母液，濾菌后4℃保存，實驗時用DMEM培養(yǎng)液稀釋即得。[JP]

2方法

21細胞分組及處理參考文獻方法[16]，選取對數(shù)生長期的RAW2647細胞并調濃度為106個/mL。接種至無菌96孔板中（100μL/well），總共21孔，隨機分為COP高、中、低劑量實驗組、陽性對照組和空白對照組，每個樣本濃度設3個復孔。[JP3]待細胞貼壁后，吸棄上清，分別加入含COP（終濃度為12500、6250、3125μg/mL）的DMEM[JP]完全培養(yǎng)基；陽性對照組加入含香菇多糖的培養(yǎng)基（終濃度為6250μg/mL）；空白對照組加入等量的培養(yǎng)基，完成后置于37℃、5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育。

22指標檢測細胞孵育36h后，收集細胞培養(yǎng)上清。嚴格按照鼠TNF-α/ IL-1細胞因子ELISA試劑盒操作說明分別檢測培養(yǎng)上清中的TNF-α和IL-1含量；Griess比色法檢測細胞上清中的NO水平，采用酶標儀于450nm處讀數(shù)，最后根據(jù)標準曲線計算出各活性因子的含量。

23統(tǒng)計方法數(shù)據(jù)采用SPSS 190軟件統(tǒng)計分析，用均數(shù)±標準差（x[TX-*3]±s）

表示，組間比較采用單因素方差分析法，P<005表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3結果

在COP對巨噬細胞釋放活性因子水平的影響中，與空白對照組比較：COP高劑量組TNF-α的分泌量明顯升高（P<005）；COP高、中劑量組NO的分泌量明顯升高（P<001）；COP高、中劑量組IL-1的分泌量明顯升高（P<001）。與陽性對照組比較：COP高劑量組TNF-α較陽性對照組高，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）；COP高、中劑量組均能提高巨噬細胞NO的分泌量，較陽性對照組差異有統(tǒng)計學意義（P<001）；COP各劑量組對巨噬細胞分泌IL-1的水平較陽性對照組差異無統(tǒng)計學意義（P<005）。

仙茅是藥用植物，其根莖具有益精血、強筋骨的功效，并與其中的多糖類成分密切相關。前期研究發(fā)現(xiàn)，仙茅多糖具有調節(jié)免疫功能與促進巨噬細胞吞噬能力的作用，但機制不夠清晰。本實驗旨在探索其作用機理并為進一步的機制研究作好鋪墊。

巨噬細胞在正常機體的免疫防御過程中扮演著重要的角色，參與機體抗感染、抗腫瘤、免疫調節(jié)等過程[17]，是機體非特異性免疫防御的關鍵環(huán)節(jié)，同時還是特異性免疫應答過程中的重要參與者[18]。TNF-α、NO和IL-1是巨噬細胞產(chǎn)生的活性因子，是巨噬細胞發(fā)揮吞噬、抗原提呈作用的重要介質。本實驗結果顯示，COP在終濃度3125～12500μg/mL作用于巨噬細胞均可影響TNF-α、NO和IL-1的分泌，且呈現(xiàn)較好的量效關系。

TNF-α主要由激活的單核/巨噬細胞產(chǎn)生，參與免疫應答、促進抗炎反應、促進樹突狀細胞成熟和T細胞的增殖和激活，而且TNF-α是迄今為止抗癌活性最強的因子，不僅能增強宿主免疫力還能誘導腫瘤細胞凋亡[19-23]。本實驗結果顯示，高劑量組COP刺激巨噬細胞產(chǎn)生的TNF-α明顯升高（P<005），初步推測COP能夠活化巨噬細胞分泌TNF-α來增強宿主免疫力，并發(fā)揮抗腫瘤效應。IL-1是活化巨噬細胞分泌的重要細胞因子，能促進B淋巴細胞分泌IL-12和增強NK細胞的殺傷功能，在體內外通過間接或直接的方式產(chǎn)生相關作用[4，12，20，24-25]。實驗結果表明，高、中劑量組COP處理巨噬細胞后，培養(yǎng)上清中的IL-1出現(xiàn)顯著性上升（P<001），所以COP可能是通過激活巨噬細胞釋放IL-1來加強機體免疫應答反應的。巨噬細胞受刺激活化后產(chǎn)生的NO具有細胞毒作用，可殺傷腫瘤細胞同時也是炎癥反應中的重要信使分子，既是炎癥反應與免疫調節(jié)的效應因子，也是關鍵的調節(jié)因子[20，24，26]。高、中劑量組COP處理巨噬細胞后，培養(yǎng)上清中的NO出現(xiàn)顯著性上升（P<001），依據(jù)結果推斷，COP可刺激巨噬細胞產(chǎn)生活性物質NO來參與免疫調節(jié)和炎癥反應。

[JP+1]本實驗中，COP對這三種活性因子的促分泌作用存在不同的敏感性，這種差異性可能為其以后臨床應用于不同適應癥療效提供一定的理論參考基礎，且COP對巨噬細胞的調節(jié)趨勢與香菇多糖組相似。表明COP可能是通過激活巨噬細胞并分泌TNF-α、NO和IL-1這三個活性因子來參與機體免疫調節(jié)過程的。但其具體機制尚不清楚。

[JP+1]綜上，筆者認為COP的這種增強免疫低下小鼠巨噬細胞吞噬能力和促正常巨噬細胞TNF-α、NO和IL-1分泌的作用有助于巨噬細胞吞噬病原微生物或腫瘤凋亡細胞，也有助于機體對抗異物入侵和抗腫瘤。這些作用可能都是現(xiàn)代免疫學研究中機體免疫調節(jié)和防治腫瘤的藥理學基礎。

[JP]

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