超聲波萃取野芭蕉總生物堿含量及其優(yōu)化篩選

凌福正　李近都　梁燁　鄒才華　李天資　何思陸　陸高翔

[摘要]目的探討超聲波萃取野芭蕉總生物堿含量及其優(yōu)化篩選。方法用正交試驗(yàn)方法，選取野生生長(zhǎng)野芭蕉莖打粉過(guò)篩得到20、40、60、80目的野芭蕉粉末，分別在超聲時(shí)間為20、30、40和50min，取樣量為50、100、150和200mg。浸提劑量與取樣量的比值為60、80、100和120倍。共16次實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取3次結(jié)果的平均值為野芭蕉總生物堿含量（%）。比較四種因素四水平提取取得堿含量的差異性。結(jié)果用超聲波提取野芭蕉總生物堿，超聲時(shí)間在20、30、40和50min時(shí)，其堿含量水平分別為（O.021±0.003）%、（0032±0.038）%、（0.047±0.006）%和（0.035±0.003）%，超聲時(shí)間為40min時(shí)，堿含量最高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；野芭蕉取樣量在50、100、150mg和200mg時(shí)，其總堿含量分別為（0.031±0.018）%、（0048±0.029）%、（0.030±0.014）%和（0.027±0.014）%，取樣量為lOOmg時(shí)，堿含量最高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；野芭蕉粉末直徑在20、40、60、80目時(shí)、其堿含量分別為（0.021±0.003）%、（0032±0.038）%）、（0.047±0.006）%和（0.035±0.003）%。粉末直徑為60目時(shí)，堿含量最高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；浸提劑量與取樣量的比值在60、80、100和120倍時(shí)，其堿含量水平分別為（0021±0.003）%、（0.032±0.038）%、（0.047±0.006）%和（0.035±0.003）%，取樣量與浸提劑量比值為100倍時(shí)，堿含量最高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論超聲波萃取野芭蕉總生物堿實(shí)用有效，在超聲時(shí)間為40min、并且在粉末直徑為60目、浸提劑量與取樣量的比值100倍等情況下提取，取得野芭蕉生物總堿含量水平最高。

[關(guān)鍵詞]野芭蕉；生物堿；超聲萃取

生物堿（Alkaloid）是指存在于生物體內(nèi)的含氮的具有堿樣性質(zhì)的有機(jī)化合物，其種類(lèi)繁多，用途廣泛。因其大多來(lái)自植物，所以又稱(chēng)為植物堿（Vegetable base）。生物堿在雙子葉植物廣泛分布，在單子葉和低等植物中也有分布，其大多具有較強(qiáng)的生理活性，是中草藥主要的療效成分，有些藥用價(jià)值很高，享譽(yù)盛名，如用于鎮(zhèn)痛的嗎啡堿是從大麻中提取，用于抑制癌細(xì)胞的三尖杉?jí)A是從三尖杉中提取的；用于緩解哮喘發(fā)作的麻黃堿是從麻黃中提取，用于人工誘變產(chǎn)生多倍體的秋水仙堿是從秋水仙中提取。生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，活性成分多樣，臨床用途廣泛，成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。野芭蕉（Musa Acuminata Colla）為常綠大型多年生草本二倍體植物，其莖高，葉子長(zhǎng)寬約，生長(zhǎng)于亞熱帶地區(qū)，耐寒力較差，其成熟果子有種子，無(wú)可食用的果肉，祖國(guó)醫(yī)藥認(rèn)為野芭蕉有清熱、解毒、解痙、化瘀等功效，近來(lái)研究表明，野芭蕉處方或野芭蕉粗提取液可以有抗炎、抗氧化作用，對(duì)高血壓患者有降血壓作用，并可抑制血管內(nèi)血栓栓塞形成。但其作用成分及其機(jī)制還不太清楚，有關(guān)野芭蕉生物堿提取的研究報(bào)道也不多見(jiàn)，為了解野芭蕉生物堿的含量及其提取優(yōu)化方法，我們用超聲波萃取法進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)現(xiàn)報(bào)道如下。

1.材料與方法

1.1儀器

SWB5200型超聲清洗機(jī)由上海必能信超聲有限公司提供；哈希（HACH）-UV756/756CRT紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)由上海豪麒節(jié)能環(huán)?？萍加邢薰咎峁籎B-1000粉碎過(guò)篩機(jī)由江陰市寶利機(jī)械制造有限公司提供，功率0.75/1.1KW過(guò)篩目數(shù)12～200目；FAl604電子分析天平由上海光學(xué)儀器廠(chǎng)提供）；天津泰斯特XH-2000-I漩渦混合器南京東邁科技儀器有限公司，Agilent（安捷倫，美國(guó)）7890A氣相色譜儀由深圳市仁瑞電子科技有限公司提供。

1.2試劑

鄰苯二甲酸氫鉀由濟(jì)寧百川化工有限公司提供，氫氧化納由滄州源盛化工有限公司提供，溴甲酚綠由上海鼓臣生物技術(shù)有限公司提供，氫氧化鈉和無(wú)水乙醇由濟(jì)南世紀(jì)通達(dá)化工有限公司提供，氯仿由上海博苑生物科技有限公司提供，以上均為國(guó)產(chǎn)分析試劑。

1.3材料

選取野生生長(zhǎng)于陰濕溝谷中果形飽滿(mǎn)的野芭蕉，生于廣西凌云縣鎮(zhèn)洪鎮(zhèn)九洞村九洞屯九燕溝山腳下的黃壤中，經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院韋國(guó)鋒教授和黃鎖義教授確認(rèn)為野生野芭蕉（Musaacuminata Colla AA grup lin yun），將野芭蕉莖放入烘箱內(nèi)經(jīng)105℃殺青30min，再用60℃烘干至恒重。然后打粉過(guò)篩分別得到20、40、60、80目的野芭蕉粉末。

1.4野芭蕉堿對(duì)照品制作

取生長(zhǎng)地相同的成熟野芭蕉的莖、根、葉、花和果重量等份為樣品，放入烘箱內(nèi)經(jīng)105℃殺青30min，再用60℃烘干至恒重。然后打粉過(guò)篩取40目粉2g，加0.5%硫酸的乙醇溶液10mL，于水浴上加熱回流10min，過(guò)濾，濾液，經(jīng)碘化鉍鉀試驗(yàn)、碘化汞鉀試驗(yàn)和硅鎢酸試驗(yàn)規(guī)章為陽(yáng)性，作為野芭蕉堿對(duì)照品。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備：移液槍分別取50、100、150、200、250、300、350uL的對(duì)照品野芭蕉堿溶液于進(jìn)樣瓶中，然后加甲醇至500uL，進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積y為縱坐標(biāo)，以野芭蕉堿濃度（ug/mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，其散點(diǎn)圖在30～160ug/mL區(qū)間有很好的線(xiàn)性關(guān)系。直線(xiàn)擬合得回歸方程Y=1.2178x-6.3894（R2=0.9999，P<0.01）。

1.5野芭蕉總堿含量測(cè)定

用堿性氯仿超聲提取法，在容器中加入水、乙醇或其他有機(jī)溶劑，將野芭蕉粉末放入提取溶媒中；容器的外壁粘接換能器振子或?qū)⒄褡用芊庥诓讳P鋼盒中投入容器中；開(kāi)啟超聲波發(fā)生器。用比色法在波長(zhǎng)為620nm測(cè)定其總堿的含量。每份樣品都分別測(cè)量3次，取其平均值為野芭蕉總堿含量值。

1.6試驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則，選取四個(gè)影響因素，每個(gè)因素取4個(gè)水平，影響因素與水平選取為：超聲時(shí)間（min）分別為20、30、40和50。樣本粒徑（目）分別為20、40、60和80。取樣取量（mg）分別為50、100、150和200。浸提劑量與取樣量的比值（倍）為60、80、100和120。數(shù)據(jù)分析用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較用方差分析，兩兩比較用q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1堿含量水平與超聲時(shí)間的關(guān)系

超聲時(shí)間在20、30、40和50min時(shí)。其堿含.量水平分別為（0021±0.003）%、（0.032±0.038）%、（0.047±0.1306）%和（0.035±0.003）%，超聲時(shí)間為40rain時(shí)，堿含量最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表1。

2.2堿含量水平與取樣量的關(guān)系

野芭蕉取樣量在50、100、150和200mg時(shí)，其總.堿含量分別為（0031±0.018）%、（0.048±0.029）%、（0.030±0.014）%和（0.027±0.014）%，取樣量為lOOmg時(shí)，堿含量最高，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2。

2.3堿含量水平與粉末直徑的關(guān)系

野芭蕉粉末直徑在20、40、60、80目時(shí)、其堿含量分別為（0.021±0.003）%、（0.032±0.038）%、（0.047±0.006）%和（0.035±0.003）%。粉末直徑為60目時(shí)，堿含量最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表3。

2.4堿含量水平與浸提劑量比值的關(guān)系

浸提劑量與取樣量的比值在60、80、100和120倍時(shí)，其堿含量水平分別為（0.021±0.003）%、（0.032±0.03 8）%、（0.047±0.006）%和（0035±0.003）%，取水平與浸提劑量比值為100倍時(shí)，堿含量最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表4。

3.討論

野芭蕉（Musa acuminata Colla）和野蕉（Musa balb&iana Colla）均為分布在亞洲的芭蕉科芭蕉屬雙倍體多年生草本植物，其果實(shí)均不可食用。野芭蕉和野蕉在自然條件下自交或者雜交，產(chǎn)生三倍體或多倍體蕉類(lèi)植物香蕉（Musa nana Lour.）、芭蕉（Musa basioo Siebold）等，經(jīng)熱帶、亞熱帶地區(qū)人工栽培的蕉類(lèi)植物家族，成為日常食用的水果。野芭蕉多用于豬飼料，壯族居民用野芭蕉花、果、根、莖等人藥，用于治療消渴，血淋澀痛，心痹痛和腫痛等疾病。近來(lái)研究表明，野芭蕉對(duì)胰島素抵抗所引起的一系列功能紊亂有治療作用，可以糾正血栓前狀態(tài)，對(duì)預(yù)防血管內(nèi)血栓栓塞形成有效果，但其作用的成分與機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。生物堿類(lèi)是天然產(chǎn)物，多見(jiàn)于植物體內(nèi)，天然生物堿具有含量少，物種來(lái)源多樣性，化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性和生物活性多樣性等特點(diǎn)，其生物活性對(duì)機(jī)體有比較強(qiáng)烈的生理作用是藥用的有效成分，在鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)神經(jīng)精神和心血管疾病中發(fā)揮了重要的作用。生物堿由不同的氨基酸或其直接衍生物合成而來(lái)，種類(lèi)過(guò)千，廣泛存在于植物體的葉、皮、花、莖、種子和果實(shí)之中，其在不同植物和相同植物的不同部位中的分布沒(méi)有規(guī)律性，一種植物中可同時(shí)含有幾種至幾十種不同的生物堿，如從鐵皮石斛中分離出70多種生物堿。一般認(rèn)為在同一物種中提取得到的生物堿系列，其有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在同屬物種中可能含有相同結(jié)構(gòu)類(lèi)型的生物堿。生物堿具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)，呈無(wú)色結(jié)晶狀，少數(shù)為液體，難溶于水，與酸可形成鹽，有旋光性與吸收光譜。不同生物堿的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)不盡相同，生物堿大都能溶于氯仿、甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑，生物堿與酸結(jié)合成鹽后易溶于水和甲醇、乙醇。因此提取分離生物堿一般是在非極性和極性混合溶劑的基礎(chǔ)上，采用冷浸、滲漉、超聲波、索氏和熱回流等方法提取。本項(xiàng)研究表明，超聲波萃取可以提取野芭蕉總生物堿，提取野芭蕉總生物堿的含量與超聲時(shí)間、粉末直徑和浸提劑量比值的關(guān)聯(lián)，與取樣量無(wú)關(guān)聯(lián)，在超聲時(shí)間為40min、并且在粉末直徑為60目、浸提劑量與取樣量的比值100倍等情況下提取，取得野芭蕉生物總堿含量水平最高。