超濾納濾聯(lián)用優(yōu)化益母草生物堿的濃縮工藝

李存玉+馬赟+劉奕洲+李紅陽+顧佳美+彭國平

[摘要]采用超濾納濾聯(lián)用技術(shù)濃縮益母草中生物堿，通過響應(yīng)面法建立二次回歸模型，優(yōu)化濃縮工藝。實驗表明通過超濾預(yù)處理，益母草水提液中總蛋白去除率9438%，納濾技術(shù)相較于傳統(tǒng)熱濃縮優(yōu)勢明顯，益母草生物堿的最佳濃縮工藝為截留相對分子質(zhì)量450，pH 307，鹽酸水蘇堿質(zhì)量濃度8015 mg·L-1，總生物堿質(zhì)量濃度28573 mg·L-1，在此條件下，鹽酸水蘇堿和總生物堿的截留率分別為9337%，9585%，相對誤差為079%，116%，BoxBehnken試驗設(shè)計方法可以用于益母草生物堿的濃縮工藝優(yōu)化，納濾濃縮為熱敏性中藥成分的分離精制提供技術(shù)支撐。

[關(guān)鍵詞]生物堿； 益母草； 鹽酸水蘇堿； 納濾； 濃縮； 超濾

益母草為唇形科植物益母草Leonurus japonicus Houtt的新鮮或干燥地上部分，具有活血調(diào)經(jīng)，利尿消腫，清熱解毒的功效[1]，通過處方調(diào)劑廣泛用于臨床，如益母草顆粒、新生化顆粒等[23]。生物堿是益母草的主要藥效成分，其中指標(biāo)性成分水蘇堿和益母草堿在光照和長時間加熱條件下均會降解，影響制劑質(zhì)量的同時也是藥用資源的浪費，同時此技術(shù)難題在制藥行業(yè)中也難以避免[4]。膜分離技術(shù)在制藥行業(yè)中應(yīng)用日趨廣泛，其中納濾具有分離過程無熱效應(yīng)，能耗低等優(yōu)點[56]，超濾可以去除大分子雜質(zhì)而對小分子目標(biāo)成分影響較小，由于膜組件串聯(lián)應(yīng)用在中藥行業(yè)尚處于摸索階段[7]，本文探索超濾納濾聯(lián)用優(yōu)化益母草中生物堿的納濾濃縮參數(shù)。響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）是采用多元二次回歸方程擬合各因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，對回歸方程的分析而尋找最佳工藝參數(shù)，從而解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法[89]。本文旨在單因素考察的基礎(chǔ)上[10]，以益母草中鹽酸水蘇堿和總生物堿為指標(biāo)，開展益母草水提液濃縮工藝研究，為含有熱敏性成分的中藥濃縮提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1材料

益母草藥材購自安徽亳州，批號20151005，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為唇形科植物益母草L japonicus的干燥地上部分。

復(fù)合聚酰胺納濾膜，截留相對分子質(zhì)量100，450，800，購自南京拓鉒醫(yī)藥科技有限公司；聚醚砜超濾膜，截留相對分子質(zhì)量1萬，5萬，10萬，購自南京拓鉒醫(yī)藥科技有限公司；鹽酸水蘇堿對照品（批號110773201313，純度≥98%），購自中國食品藥品檢定研究院；BCA蛋白含量檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

Waters e2695 高效液相色譜儀，蒸發(fā)光散射檢測器，購自美國Waters公司；TNZ1納濾分離設(shè)備（南京拓鉒醫(yī)藥科技有限公司）；T6紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；KH250B型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；PB10型pH計（德國Sartorius公司）；蘇泊爾電磁爐（型號SDHC8E15210，浙江蘇泊爾股份有限公司）。

2方法

21益母草水提液制備

稱取益母草藥材10 kg，按照體積質(zhì)量比，分別加入10，8倍純化水提取2次，每次1 h，提取液使用045 μm微孔濾膜過濾，合并濾液，即得。

22超濾去除大分子

為提高納濾分離效率、減輕膜組件污染，采用超濾去除益母草提取液中的蛋白等大分子物質(zhì)。取益母草水提液，分別采用截留相對分子質(zhì)量1萬，5萬，10萬超濾膜過濾，以鹽酸水蘇堿、總生物堿和總蛋白質(zhì)含量的動態(tài)變化為指標(biāo)，篩選超濾參數(shù)。

23納濾分離單因素考察

按照實驗參數(shù)要求選擇納濾膜，組裝納濾濃縮裝置，取益母草超濾液（2 L）置于納濾系統(tǒng)中進(jìn)行循環(huán)平衡，待鹽酸水蘇堿在納濾膜中的吸附解吸附達(dá)到平衡時，取樣平衡液，進(jìn)而將溶液進(jìn)行納濾，待納濾完成后，取樣納濾液。

為了排除納濾分離過程中膜吸附對益母草中鹽酸水蘇堿等生物堿類成分的影響，同時確定納濾分離環(huán)境參數(shù)，以鹽酸水蘇堿和生物堿含量變化為指標(biāo)，選擇藥液平衡體積、溶液溫度、操作壓力對益母草超濾液的納濾濃縮效果進(jìn)行單因素試驗，具體參數(shù)。

3結(jié)果與分析

31超濾去除大分子去除效果比較

3種截留相對分子質(zhì)量的超濾膜對益母草提取液中成分的分離情況對比見表3。

鹽酸水蘇堿相對分子質(zhì)量為1795，在3種孔徑的超濾膜中的透過率均高于98%，損失不明顯。益母草總生物堿隨著超濾膜孔徑增大，透過率明顯升高，其中在1萬時損失超過10%，說明益母草表3不同截留相對分子質(zhì)量超濾膜對益母草中生物堿和蛋白的分離效果

截留相對

分子質(zhì)量透過率鹽酸水蘇堿總生物堿總蛋白1萬987488611765萬9937972656210萬992699041445

中含有部分大分子或者多分子締合態(tài)形式存在的生物堿類成分。超濾技術(shù)在益母草水提液中的蛋白的去除方面優(yōu)勢明顯，1萬的超濾膜的蛋白的去除率高達(dá)98%以上，但隨著超濾膜截留相對分子質(zhì)量的增大，其透過率逐步升高，去除效果下降。在去除益母草水提液中大分子物質(zhì)的同時，保證生物堿類成分有效保留，選擇截留相對分子質(zhì)量為5萬的超濾膜對益母草水提液進(jìn)行預(yù)處理。

32單因素考察結(jié)果

321藥液循環(huán)平衡體積對納濾截留率的影響

在納濾平衡過程中，隨著益母草超濾液中生物堿類成分與納濾膜接觸，藥液中鹽酸水蘇堿和總生物堿的濃度均隨著膜吸附而逐步降低，見表4，當(dāng)平衡體積達(dá)到8 L時，溶液中生物堿濃度逐步穩(wěn)定，說明此時生物堿類成分與納濾膜之間的“吸附解吸附”達(dá)到平衡狀態(tài)[12]，與此同時鹽酸水蘇堿和總生物堿在450納濾膜中的截留率也趨于穩(wěn)定，因此選擇藥液平衡體積需大于8 L，可以保障納濾分離結(jié)果的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。

4小結(jié)與結(jié)論

中藥制藥過程中通過加熱濃縮制劑中間體是常用技術(shù)手段，因此在加熱過程中出現(xiàn)的氧化反應(yīng)、聚合反應(yīng)和美拉德反應(yīng)等是難以避免的，生產(chǎn)能耗增加的同時直接導(dǎo)致中藥資源浪費。此外，加熱濃縮過程中成分存在狀態(tài)、濃度以及成分間相互作用的差異性均與其穩(wěn)定性相關(guān)[15]，因此僅選擇加熱溫度、指標(biāo)性成分濃度等作為濃縮控制參數(shù)難以保障制劑中間體的質(zhì)量的均一性。因此在中藥制藥過程中尋找可以替代或者部分替代熱濃縮技術(shù)已迫在眉睫，在以益母草提取液的納濾濃縮工藝摸索中，以總生物堿和鹽酸水蘇堿為指標(biāo)，在保障生物堿得到充分截留的同時，益母草黃酮、萜類、糖類等成分仍然保留在提取液溶液中，因此納濾技術(shù)可以用于中藥制劑生產(chǎn)的濃縮環(huán)節(jié)，而針對中藥中某一類成分富集的選擇性較差，需要和樹脂等分離技術(shù)聯(lián)用才能達(dá)到預(yù)期精制目的。

膜分離技術(shù)具有分離參數(shù)易控、分離行為重現(xiàn)性、參數(shù)可線性放大等技術(shù)優(yōu)勢，基于此本論文選擇臨床常用中藥制劑中的益母草，結(jié)合膜分離技術(shù)優(yōu)勢，以鹽酸水蘇堿，總生物堿、蛋白含量為指標(biāo)，考察超濾預(yù)處理參數(shù)，以及納濾濃縮時藥液循環(huán)體積、溶液溫度、操作壓力、膜截留相對分子質(zhì)量、藥液濃度和pH對益母草中生物堿類成分的截留率，益母草生物堿在堿性至中性溶液環(huán)境中，多以游離態(tài)或部分離子態(tài)的形式存在，因此在進(jìn)行納濾濃縮時，多依靠膜分子篩分效應(yīng)進(jìn)行分離，隨著溶液pH降低，生物堿以解離態(tài)形式存在比例增加，且復(fù)合聚酰胺材質(zhì)納濾膜表面荷負(fù)電，成分與膜表面的電荷效應(yīng)增強而難以通過納濾膜，從而截留率升高，提升了納濾效果。

采用響應(yīng)面分析法中的BoxBehnken模式，對納濾濃縮參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化篩選，數(shù)學(xué)模型擬合程度高，實驗誤差小，可用于實際預(yù)測。得到優(yōu)化工藝條件為：截留相對分子質(zhì)量450，pH 307，鹽酸水蘇堿質(zhì)量濃度8015 mg·L-1，總生物堿質(zhì)量濃度28573 mg·L-1，在此條件下鹽酸水蘇堿和總生物堿的截留率分別為9337%，9585%。在實驗開展的同時，對比了常壓熱濃縮，發(fā)現(xiàn)在相同溶液環(huán)境下，采用85 ℃減壓熱濃縮至相同比重，鹽酸水蘇堿和總生物堿的保留率分別為7284%，8742%，說明采用納濾濃縮益母草提取液相較于傳統(tǒng)工藝優(yōu)勢明顯。但是納濾對分離對象的黏度具有一定要求，富含多糖等成分的高黏度中藥水提液納濾濃縮效率偏低，而傳統(tǒng)熱濃縮不受此項限制，也導(dǎo)致目前納濾技術(shù)在中藥濃縮應(yīng)用中尚有一定的局限性。

[參考文獻(xiàn)]

[1]中國藥典一部[S]2015：290

[2]王濤 新生化顆粒預(yù)防藥物流產(chǎn)后陰道出血的療效觀察[J]. 臨床合理用藥雜志， 2015（14）：63

[3]康明 益母草顆粒治療藥物流產(chǎn)后陰道出血的臨床觀察[J]. 吉林醫(yī)學(xué)， 2014（12）：2553

[4]黃鳴清，陳瑞云，謝友良，等 鹽酸水蘇堿在中藥生產(chǎn)過程中的含量變化及影響因素研究[J] 時珍國醫(yī)國藥， 2009， 20（10）：2587

[5]普文英，張衛(wèi)東 納濾新型的分離小分子有機物的膜技術(shù)[J] 中國藥房， 2000， 11（5）：234

[6]李存玉，錢祥，楊澤秋，等 基于納濾技術(shù)的消癌平注射液中的鉀離子去除工藝優(yōu)化[J] 中成藥， 2015， 37（2）：294

[7]韓偉，蔣一帥，魏雨恬 超濾納濾技術(shù)在金毛狗脊黃酮分離純化中的應(yīng)用[J] 南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版， 2015， 37（1）：1

[8]耿天華，汪濤，郭巧生，等 響應(yīng)面法優(yōu)化大孔樹脂純化昆侖雪菊色素的工藝[J] 中國中藥雜志， 2016， 41（2）：220

[9]金林，趙萬順，郭巧生，等 響應(yīng)面法優(yōu)化白芍提取工藝的研究[J] 中國中藥雜志， 2015， 40（15）：2988

[10]Andriy Y， Merlin L B， Edxon E L B SolutionDiffusionElectroMigration model and its uses for analysis of nanofiltration， pressureretarded osmosis and forward osmosis in multiionic solutions [J] J Membr Sci， 2013， 447：463

[11]曹玉華 BCA法測神奇靈顆粒劑中蛋白含量[J] 中國實用醫(yī)藥， 2009， 4（7）：43

[12]林立剛，葉卉，趙莉芝，等 膜吸附和膜吸收研究進(jìn)展[J] 中國工程科學(xué)， 2014（12）：59

[13]趙彥彥，袁其朋 有機相納濾分離過程中濃度、電荷、溶劑對溶質(zhì)截留行為的影響[J] 膜科學(xué)與技術(shù)， 2006， 26（5）：31

[14]Fang J， Deng B L Rejection and modeling of arsenate by nanofiltration：contributions of convection， diffusion and electromigration to arsenic transport [J] Membr Sci Technol， 2014， 453（453）：42.

[15]彭國平，蕭偉，倪健 中藥制藥化學(xué)[M] 北京：中國中醫(yī)藥出版社， 2016：203[責(zé)任編輯孔晶晶]

2017年1月 第42卷第1期Vol42， No 1January， 2017

[收稿日期]20160907

[基金項目]國家自然科學(xué)基金面上項目（81274094）；國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項 （2012ZX09103201041）

[通信作者]*朱春燕，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向為新型給藥系統(tǒng)，Tel：（010）57833263， Email：cyzhu@impladaccn

[作者簡介]何亞麗，碩士研究生，Email：heyalisky@126com菠蘿葉提取物黏附漂浮微丸的

制備及評價