軟骨細(xì)胞在機械力刺激下細(xì)胞骨架及細(xì)胞形態(tài)改變的體外研究

王雪冰　宋玉娟　鄧雪峰　宋錦旗

[摘要]目的探討周期性的機械應(yīng)力對大鼠的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的形態(tài)與骨架的刺激作用，為軟骨細(xì)胞的內(nèi)力學(xué)信號傳導(dǎo)機制的臨床研究提供參考。方法將體外培養(yǎng)傳代至第三代的大鼠軟骨細(xì)胞置于四點彎曲加力裝置周期性機械應(yīng)力體系中（4000u strain）培養(yǎng)30min，連續(xù)3d。對照組靜態(tài)培養(yǎng)。3d后檢測細(xì)胞基質(zhì)合成情況以及微管、微絲、中間纖維的免疫熒光染色，用Western Blot及RT-PCR方法測量cofilin蛋白基因含量。結(jié)果加載應(yīng)力組軟骨細(xì)胞氨基多聚糖和蛋白多糖的合成與對照組無明顯差異（P>0.05）；但細(xì)胞微管、微絲及中間纖維發(fā)生重排，細(xì)胞形態(tài)和取向趨于一致。實驗組cofilin蛋白含量明顯高于對照組（P<0.05）。結(jié)論周期性機械應(yīng)力改變軟骨細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞骨架，cofilin蛋白在軟骨細(xì)胞內(nèi)力學(xué)一生物學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。

[關(guān)鍵詞]軟骨細(xì)胞；細(xì)胞骨架；細(xì)胞形態(tài)

關(guān)節(jié)軟骨處在一個具有壓應(yīng)力、張應(yīng)力、流體剪切力等機械應(yīng)力作用的復(fù)雜力學(xué)環(huán)境中，而機械應(yīng)力在調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生物學(xué)行為中具有十分重要的作用，能夠?qū)浌羌?xì)胞新陳代謝進(jìn)行調(diào)控，是保證軟骨基質(zhì)正常狀態(tài)的必要條件?？烧{(diào)控軟骨細(xì)胞的新陳代謝，是維持正常軟骨基質(zhì)必不可少的條件。關(guān)節(jié)軟骨組織缺乏血液供應(yīng)、細(xì)胞代謝緩慢、自我修復(fù)能力較差，即使較小的軟骨損傷也會引起嚴(yán)重的后果。我們的前期動物實驗表明，中等強度的炮臺運動能促進(jìn)大鼠軟骨缺損的修復(fù)重塑，但其作用機制尚不清楚。

本研究擬通過體外實驗對大鼠關(guān)節(jié)軟骨加載周期性壓應(yīng)力，觀察應(yīng)力下的軟骨細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞骨架的變化，為軟骨細(xì)胞內(nèi)力一生物信號轉(zhuǎn)化研究提供基礎(chǔ)，為適度應(yīng)力促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)重塑的機制研究提供依據(jù)。

1.資料與方法

1.1一般資料

主要包括大鼠來源及所用試劑的來源。本研究中所用大鼠為7d齡，且身體健康，均由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。主要試劑：鼠抗人Tubulin B單克隆抗體（北京中杉金橋生物進(jìn)口分裝）；Dulbecco改良DMEM/Ham F12混合培養(yǎng)基（HyClone公司）；0.01mol/L磷酸緩沖液PBS（博士德公司）；碘化丙啶（Salarbio公司）；鏈菌蛋白酶（Gibco公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）；番紅（Salarbio公司）；胰蛋白酶（Gibco公司）；雙乙酸熒光素（Salarbio公司）；甲苯胺藍(lán)（Salarbio公司）；4%多聚甲醛（Salarbio公司）；II型膠原酶（Gibco公司）；山羊抗小鼠IgG/FITC標(biāo)記（北京中杉金橋生物進(jìn)口分裝）；I型膠原蛋白裱襯的6孔培養(yǎng)板（Flexercell公司）。

1.2儀器設(shè)備

主要包括四點彎曲加力裝置（四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院研制）；流式細(xì)胞儀（Coulter，美國）；CO2培養(yǎng)箱（ShelLab，美國）；倒置熒光顯微鏡（Olympus，日本）；數(shù)碼相機（Olympus，日本）。

1.3實驗方法

主要包括細(xì)胞培養(yǎng)、染色以及檢測。

1.3.1軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)及應(yīng)力加載 體外分離大鼠四肢的關(guān)節(jié)軟骨并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)傳至第3代，隨機分為對照組（A組）和周期性機械應(yīng)力組（B組）。A組：在正常條件下培養(yǎng)軟骨細(xì)胞；B組：軟骨細(xì)胞置于周期性機械應(yīng)力體系中（4000u strain）培養(yǎng)30min，連續(xù)3d。加載應(yīng)力組細(xì)胞卸載后與對照組細(xì)胞同時進(jìn)行以下檢測。

1.3.2番紅及甲苯胺藍(lán)染色 軟骨細(xì)胞生長于柔性的硅膠膜上，選擇PBS進(jìn)行沖洗，并加入0.25%番紅以及1%甲苯胺藍(lán)染液，在室溫條件下，進(jìn)行孵育2h。隨后利用顯微鏡進(jìn)行觀察拍照。番紅染色可以明確氨基葡聚糖合成情況；甲苯胺藍(lán)染色可以明確蛋白多糖合成情況。

1.3.3免疫熒光檢測 當(dāng)細(xì)胞的80%貼合于蓋玻片后，在超凈的工作臺上放置一24孔的培養(yǎng)板，并取出貼有細(xì)胞的蓋玻片，使用PBS液進(jìn)行2次清洗，后加入2%的甲醛溶液，進(jìn)行固定。固定后，使用0.5%的Triton液清洗細(xì)胞3次，每次10min。加一抗（sigma公司），在37℃條件下，靜置1h。將蓋玻片置于24孔板上，使用0.5%Triton液進(jìn)行3次清洗，每次10min。后加如異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的二抗（sigma公司），37℃條件下，靜置1h。將蓋玻片置于24孔板，0.5%Triton液進(jìn)行3次清洗，每次10min。將所有蓋玻片放置于24孔板中，使用0.5%Triton液進(jìn)行3次清洗，每次10min，后將清洗液棄去，加入4，6-二脒基2-苯基吲哚（4，6diamidino2-phenylindole，DAPI）進(jìn)行染核，在室溫條件下，進(jìn)行5min。后在長方形的載玻片上低落封片劑，蓋上蓋玻片，并在室溫條件下5min封片。用LCSM（LeicaSPS Germany）觀察并記錄圖像。

1.3.4 RT-PCR檢測cofilin基因表達(dá) 以TrizolRNA試劑盒提取細(xì)胞總RNA，依據(jù)GenBank上登陸cofilin基因序列，以B-actin作為內(nèi)參照，設(shè)計引物序列。cofilin正義引物：TGTGGCTGTCTCTGATGGAG，反義引物：3TGTCTGGCAGGATC 3TGAC：B-acfin正義引物：CAC GTA CGT TGC TAT CCAGGC，反義引物：CTC CqT AAT GTC ACG CAC GAT。PCR條件95℃變性4min：95℃變性45s：53℃復(fù)性45s：72℃延伸90s：72℃溫育10min：4℃保存24h。擴增結(jié)束后取最終產(chǎn)物10 u L，進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳（含EBO.5ug/mL）。15mA、90V穩(wěn)壓45min，采用kodak電泳凝膠觀察系統(tǒng)EDASl20掃描，分析結(jié)果。

1.3.5Western印跡檢測cofilin蛋白表達(dá) 選擇實驗組與對照組中貼壁生長的軟骨細(xì)胞懸浮液，并進(jìn)行蛋白樣品提取，以pierce公司生產(chǎn)的BCA蛋白定量檢測試劑盒說明為標(biāo)準(zhǔn)稀釋樣品，進(jìn)行蛋白濃度的檢測，并選擇5mg/mL的BSA液體將蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品完全溶解，置于-20℃的環(huán)境下保存。選擇取標(biāo)準(zhǔn)品用PBS 10mL，并將其稀釋為100uL，保證液體的最終濃度為0.5mol/mL。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，再完成轉(zhuǎn)膜的過程中加入一抗與二抗，并進(jìn)行ECL發(fā)光。通過掃描儀進(jìn)行掃描，將圖像輸入到Image J軟件中進(jìn)行圖像的定量分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)用（x±s）表示，行配對t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1軟骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

體外分離的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)24h后開始貼壁，72h后能夠完全貼壁。并且大部分細(xì)胞表現(xiàn)為多邊形，而細(xì)胞核表現(xiàn)為橢圓形或者圓形，能夠清晰的觀察到1～2個核仁。進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色后，形態(tài)學(xué)觀察可見：大部分聚集于細(xì)胞內(nèi)的呈深藍(lán)色的蛋白多糖。而細(xì)胞核則被染色為深藍(lán)色或者藍(lán)紫色。進(jìn)行番紅染色后，形態(tài)學(xué)觀察可見：大部分呈深紅色的氨基葡聚糖陽性物質(zhì)聚集于細(xì)胞內(nèi)。加載組和對照組無顯著差別，而應(yīng)力組的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變，并且其取向逐漸趨于相同。見圖1A～D。

2.2微絲的形態(tài)學(xué)觀察

實驗組軟骨細(xì)胞微絲為與細(xì)胞長軸平行的線狀均勻纖維，排列整齊，呈線狀拉伸，核深染。對照組軟骨細(xì)胞微絲形態(tài)及分布較散亂，纖維顯稀疏，與對照組比較核淡然。見圖2A～B。

2.3微管的形態(tài)學(xué)觀察

實驗組軟骨細(xì)胞邊緣平整、銳利，細(xì)胞微管呈網(wǎng)絡(luò)狀分布于各個細(xì)胞內(nèi)以維持細(xì)胞形態(tài)，在核周可見明顯的斑點狀微管聚集區(qū)。對照組軟骨細(xì)胞微管熒光強度明顯較弱，邊緣模糊，未見明顯核周聚集區(qū)。見圖2C～D。

2.4中間纖維的形態(tài)學(xué)觀察

實驗組軟骨細(xì)胞中間纖維圍繞細(xì)胞核且從細(xì)胞核到細(xì)胞膜呈遞增的貫穿分布，呈平滑的細(xì)絲狀，成束成網(wǎng)，在細(xì)胞膜周圍分布密集，形成亮帶，中間纖維擴展的細(xì)胞外基質(zhì)的部分呈現(xiàn)為亮帶外周的微弱綠色熒光。對照組軟骨細(xì)胞中間纖維排列紊亂，熒光強度普遍較弱，呈波浪狀圍繞細(xì)胞核分布，個別細(xì)胞中存在中間纖維的斑塊狀聚集，膜周亮帶較弱或無，亮帶以外微弱綠色熒光較寬。見圖2E～F。

2.5RT-PCR檢測cofihn基因表達(dá)

RT-PCR檢測顯示實驗組軟骨細(xì)胞cofilin基因表達(dá)為（1 52±0.12），對照組為（0.99±0.01），兩組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=31.123，P=0.000）。見圖3。

2.6Western蛋白印跡檢測cofifin蛋白表達(dá)

實驗組軟骨細(xì)胞中cofilin蛋白表達(dá)明顯高于對照組軟骨細(xì)胞cofilin蛋白的表達(dá)。見圖4。

3.討論

軟骨在動物全身關(guān)節(jié)活動中發(fā)揮著重要作用，其含有特殊的軟骨基質(zhì)，因而能夠承受一定的機械力而不會發(fā)生永久變形。同樣，在軟骨的生長發(fā)育過程中，其形態(tài)和功能的維持及損傷后的修復(fù)也離不開力學(xué)刺激，缺乏力學(xué)刺激會導(dǎo)致軟骨退行性變。

軟骨細(xì)胞在機械力的傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)化方面起著舉足輕重的作用。細(xì)胞形態(tài)是細(xì)胞功能的體現(xiàn)形式，是細(xì)增殖分化與凋亡等諸多胞內(nèi)事件的參與者，同時，細(xì)胞形態(tài)與細(xì)胞所處的力學(xué)環(huán)境密不可分，是細(xì)胞內(nèi)部力平衡的最直觀外在表現(xiàn)，因此，對軟骨細(xì)胞的形態(tài)研究，是研究機械應(yīng)力影響軟骨修復(fù)機制的基礎(chǔ)。

本實驗中在周期性機械應(yīng)力刺激下，大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞附壁生長良好，能夠合成有軟骨細(xì)胞生物學(xué)特點的粘多糖和氨基葡聚糖，并促進(jìn)軟骨細(xì)胞的規(guī)則排列，說明在軟骨細(xì)胞的生長過程中，周期性的機械應(yīng)力具有較為積極的刺激作用。臨床研究證實，外力施加載荷的頻率、時間與大小等均是影響軟骨細(xì)胞新陳代謝和生長的刺激因素。本實驗中的細(xì)胞特殊染色技術(shù)只能定性分析粘多糖及氨基葡聚糖的含量，而無法從蛋白表達(dá)的基因水平辨別蛋白合成過程中的微小差別。仍然需要更加深刻的定量分析研究，對基因和蛋白層面進(jìn)行探討，進(jìn)一步闡述周期性機械應(yīng)力對軟骨細(xì)胞的刺激作用。

細(xì)胞骨架是維持細(xì)胞形態(tài)的重要部分，同時在維系軟骨細(xì)胞功能方面也具有十分顯著的作用。細(xì)胞骨架包括微絲、中間絲與微管是胞骨架的組成部分，聯(lián)合各種具有不同作用的調(diào)控蛋白共同構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)部蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)體系。細(xì)胞骨架明顯的為力學(xué)信號發(fā)生轉(zhuǎn)導(dǎo)提供了十分理想化和有效化的途徑。在細(xì)胞受到外界力學(xué)的刺激后，會導(dǎo)致細(xì)胞骨架發(fā)生重新排列，導(dǎo)致使細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力隨之發(fā)生相應(yīng)的重新分布。細(xì)胞骨架的改變不僅會造成細(xì)胞形態(tài)的變化，同時也會導(dǎo)致細(xì)胞力學(xué)特征及生物學(xué)特征發(fā)生變化。

微絲是真核細(xì)胞中含量最豐富的一種蛋白復(fù)合體，是細(xì)胞骨架的主要成分之一，是由肌動蛋白分子螺旋狀聚合成的纖絲，又稱肌動蛋白絲，F(xiàn)-actin是細(xì)胞骨架微絲蛋白的主要成分，與細(xì)胞黏附、吞噬、運動、分裂等密切相關(guān)。細(xì)胞伸出的絲狀偽足參與細(xì)胞間的通訊并使細(xì)胞具有趨化性，產(chǎn)生細(xì)胞形態(tài)的變化，而成束的微絲對絲狀偽足起支持作用。壓應(yīng)力作用于軟骨細(xì)胞后，微絲會出現(xiàn)不同方向的變化，增加細(xì)胞頂-底縱向的微絲張力，但橫向微絲張力未發(fā)生變化。外界刺激到達(dá)閾值后，會破壞Actin微絲和Vimentin中間纖維聚集以及解聚的動態(tài)平衡，導(dǎo)致微絲發(fā)生生物學(xué)降解。應(yīng)力信號通過細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)傳遞至細(xì)胞內(nèi)激活相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，反饋調(diào)控，使其與組蛋白、DNA相互作用來調(diào)節(jié)復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程，細(xì)胞骨架發(fā)生重組，使細(xì)胞維持一定的機械強度適應(yīng)機械力。

本研究中免疫熒光染色顯示應(yīng)力組較對照組微絲致密且分布均勻，熒光強度增強，取向趨于一致。實驗組細(xì)胞微管呈網(wǎng)絡(luò)狀分布于各個細(xì)胞內(nèi)以維持細(xì)胞形態(tài)，在核周可見明顯的斑點狀微管聚集區(qū)。而加載周期性機械應(yīng)力后的軟骨細(xì)胞中間纖維圍繞細(xì)胞核且從細(xì)胞核到細(xì)胞膜呈遞增的貫穿分布，呈平滑的細(xì)絲狀，成束成網(wǎng)，在細(xì)胞膜周圍分布密集，形成亮帶。這些現(xiàn)象均表明周期性應(yīng)力可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的骨架重排，提高其力學(xué)適應(yīng)性，而細(xì)胞骨架在軟骨細(xì)胞的力學(xué)一生物學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。

Cofilin蛋白是廣泛存在于真核細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的一種可解聚的蛋白，研究表明其在細(xì)胞骨架動態(tài)改建過程中發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在周期性的應(yīng)力作用下，軟骨細(xì)胞內(nèi)的cofilin通路的相關(guān)基因以及蛋白的表達(dá)均發(fā)生明顯的變化，這表明cofilin通路在軟骨細(xì)胞力學(xué)一生物學(xué)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有十分重要的參與作用。同時進(jìn)一步的研究應(yīng)力傳導(dǎo)中軟骨細(xì)胞cofilin信號通路生物學(xué)相關(guān)的調(diào)控機制，有希望為明確關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)重塑中機械應(yīng)力的作用機制提供可靠的證據(jù)。

目前有關(guān)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞力一化一生物傳導(dǎo)的作用機制未十分明確，但臨床多項研究指出細(xì)胞骨架具有十分重要的作用。在體外施加不同程度的機械應(yīng)力能夠?qū)е玛P(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞骨架重新排列，從而影響細(xì)胞增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)合成。體外施加機械應(yīng)力進(jìn)行培養(yǎng)時，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞會呈現(xiàn)出平行排列且有順序性，同時微絲重排沿細(xì)胞的長軸進(jìn)行，這能夠表明關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞能夠在周期性應(yīng)力條件下進(jìn)行優(yōu)化排列，充分證明關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞能夠適應(yīng)一定力學(xué)參數(shù)刺激下的微環(huán)境，并形成與之相適應(yīng)的功能及結(jié)構(gòu)特征。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞是一種對力學(xué)較為敏感的細(xì)胞，能夠?qū)C械應(yīng)力做出敏感的反應(yīng)，但是其信號通路的相關(guān)性研究仍然需要更深刻的探究。