野生與栽培苦參生物堿含量的比較研究

姚麗+易紅+高慧敏+馬蕙文+張繼遠(yuǎn)+田蓮超+劉曉謙+王智民

[摘要]為比較苦參藥材的野生品與栽培品在生物堿成分含量上的質(zhì)量差異，對(duì)收集的22個(gè)栽培樣本和17個(gè)野生樣本，用HPLC同時(shí)測(cè)定了6種生物堿（氧化苦參堿、氧化槐果堿、槐定堿、N-甲基野靛堿、苦參堿、槐果堿）的含量，以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，輔以聚類(lèi)分析（HCA）和主成分分析（PCA）方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)表明：野生品與栽培品在N-甲基野靛堿、苦參堿、槐果堿3種成分含量上有差異（苦參堿及槐果堿P<0.05，N-甲基野靛堿P<0.01），氧化苦參堿、氧化槐果堿、槐定堿野含量無(wú)差異，但組內(nèi)差異均較大；聚類(lèi)分析及主成分分析表明：野生品與栽培品在生物堿含量上無(wú)差異。故認(rèn)為栽培品與野生品在生物堿含量方面無(wú)差異。

[關(guān)鍵詞]苦參； 野生與栽培； 生物堿

[Abstract]To compare the contents of alkaloids in theroots of cultivated and the wildSophora flavsecens， 22 cultivated and 17 wild samples were collected. HPLC method was employed to simultaneously determine the contents of six alkaloids （oxymatrine， oxysophocarpine， sophoridine，N-methylcytisine， matrine， and sophocarpine）. Independentt-test， hierarchical clustering analysis（HCA）and principal components analysis（PCA）were applied to analyze and evaluate the cultivated and the wildS.flavsecens. With a great wide range of the inter-group， thet-test results showed that the contents difference ofN-methylcytisine， matrine， and sophocarpine were statistical significance（matrineandsophocarpineP<0.05，N-methylcytisineP<0.01）.However， it was not statistically significant for oxymatrine， oxysophocarpine， and sophoridine.HCA and PCA showed that there were no significant differences in the contents of alkaloids of cultivated and wildS. flavsecens. The results indicated that there were no differences in the contents of alkaloids of cultivated and wildS. flavsecens.

[Key words]Sophora flavsecens； cultivated and wild； alkaloid

doi：10.4268/cjcmm20162114

苦參為豆科植物苦參Sophora flavsecensAit.的干燥根，主產(chǎn)于山西、河北、河南等地，其性寒、味極苦，具有抗炎、抗菌、抗病毒及抗腫瘤等多種藥理活性^[1-4]，主要用于熱痢、便血、黃疸尿閉、赤白帶下等婦科疾病^[5]。此外，苦參不僅應(yīng)用到醫(yī)藥行業(yè)，也逐步應(yīng)用到農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)及化妝品行業(yè)，有韓國(guó)研究者將其放入空氣過(guò)濾器中用來(lái)改善空氣質(zhì)量，為天然藥物制成空氣殺菌劑提供了理論依據(jù)^[6-7]。隨著苦參需求量的增加，野生資源銳減，栽培品漸漸替代野生品已成趨勢(shì)；但由于廣泛而分散的種植形式，很難形成統(tǒng)一的管理標(biāo)準(zhǔn)，以致各地苦參藥材質(zhì)量不均，品質(zhì)下降，并由此可能引發(fā)相關(guān)的安全性等問(wèn)題。雖有研究表明栽培與野生苦參在清熱、利尿及鎮(zhèn)痛方面的藥理活性相同^[8]，但關(guān)于其主要活性成分——生物堿類(lèi)成分的差異目前尚無(wú)報(bào)道。

為保證研究結(jié)果的數(shù)據(jù)的可比性、減少氣候地理等干擾因素，本研究在苦參樣本的采集區(qū)域方面作了限定：選擇道地產(chǎn)區(qū)種植品和栽培品儲(chǔ)量均豐富的山西地區(qū)作為本研究的樣品采集區(qū)；以期為道地產(chǎn)區(qū)的苦參標(biāo)準(zhǔn)化種植生產(chǎn)和質(zhì)量保障提供參考。

1 材料

Shimadzu LC 20A高效液相色譜儀，包括LC-20AT溶液傳輸單元，SIL-20 A自動(dòng)進(jìn)樣器，SPD-M20 A二極管陣列檢測(cè)器，LC Solution色譜工作站（日本島津公司）。色譜柱Welch Xtimate C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），KQ-250B超聲儀，Mettler Toledo Delta 320 pH計(jì)。

乙腈、甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑為分析純。氧化苦參堿（批號(hào)14102450， 純度≥99.99%）、槐定堿（批號(hào)15062213，純度≥99.22%）、N-甲基野靛堿（批號(hào)15072003，純度≥98%）、苦參堿（批號(hào)14112608，純度≥99.22%）及槐果堿（批號(hào)14082711，純度≥98.52%）均購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。氧化槐果堿（批號(hào)262.351，純度≥98%）購(gòu)自廣州雋沐生物科技有限公司。

所有藥材均采自山西長(zhǎng)治市，經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所王智民研究員鑒定為苦參S. flavsecens的干燥根，留樣樣品儲(chǔ)存于本課題組植物標(biāo)本室。樣品的采集信息，見(jiàn)表1， 2。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Xtimate C18（4.6 mm×260 mm，5 μm），流速1 mL·min^-1，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm，流動(dòng)相乙腈-0.01 mol·L^-1乙酸銨 [3∶2（A）] -0.01 mol·L^-1乙酸銨[（pH 8.1）（B）]，具體色譜方法，見(jiàn)表3，圖1。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取苦參藥材粗粉約（40目）0.5 g，以氯仿25 mL、氨水0.4 mL為提取溶劑進(jìn)行提取，超聲30 min，稱(chēng)重，氯仿補(bǔ)足失重，濾過(guò)，取10 mL 續(xù)濾液水浴蒸干，甲醇定容至10 mL，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)定N-甲基野靛堿，苦參堿，槐果堿，分別2.51，1.27，1.01 mg于25 mL量瓶中，甲醇定容，得到混合對(duì)照品溶液1；取氧化苦參堿，氧化槐果堿，槐定堿3種生物堿，精密稱(chēng)定，分別為2.21， 1.01， 0.69 mg于10 mL量瓶，精密加入1 mL混合對(duì)照品溶液1，甲醇定容，即得混合對(duì)照品溶液2。精密吸取2 mL混合對(duì)照品溶液2置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為測(cè)定用混合對(duì)照品溶液，備用。

2.4 線(xiàn)性關(guān)系的考察 分別精密吸取2.3項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1， 5， 10， 15， 20， 25 μL注入高效液相色譜儀，以進(jìn)樣量對(duì)峰面積進(jìn)行回歸，得到6種生物堿回歸方程及線(xiàn)性范圍，見(jiàn)表4。

2.5 精密度試驗(yàn) 取同一份苦參供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定氧化苦參堿，氧化槐果堿，槐定堿，N-甲基野靛堿，苦參堿及槐果堿6種生物堿的峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果各成分峰面積的RSD分別為 0.62%，0.40%，2.8%，2.1%，2.4%，1.8%。表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份苦參供試品溶液，分別于樣品制備后的0，2，4，6，8，10，12，24 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果溶液中氧化苦參堿，氧化槐果堿，槐定堿，N-甲基野靛堿，苦參堿，槐果堿6種成分峰面積RSD分別為0.43%，0.40%，2.9%，1.8%，2.2%，2.1%。表明24 h內(nèi)，供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 稱(chēng)取苦參（Z-1）藥材粉末（40目）約0.5 g共6份，精密稱(chēng)定，按照2.2項(xiàng)下制備樣品，測(cè)定氧化苦參堿、氧化槐果堿、槐定堿、N-甲基野靛堿、苦參堿及槐果堿的RSD分別為1.8%，0.73%，0.052%，0.058%，0.054%，0.034%。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的苦參藥材粉末約（40目）0.25 g，精密稱(chēng)定，平行6份，分別加入一定量的對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定含量并計(jì)算各成分的加樣回收率。結(jié)果表明氧化苦參堿、氧化槐果堿、槐定堿、N-甲基野靛堿、苦參堿及槐果堿6個(gè)生物堿類(lèi)成分的加樣回收率均值分別為99.60%，98.00%，101.3%，97.60%，101.3%，102.8%，RSD分別為1.2%，1.1%，1.1%，2.1%，1.9%，1.8%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。結(jié)果見(jiàn)表5。

2.9 樣品含量測(cè)定 分別對(duì)22批栽培品和17批野生品按2.2項(xiàng)下制備樣品，并測(cè)定其含量，結(jié)果見(jiàn)表6，7。

3 結(jié)果與分析

3.1 兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn) 采用SPSS20.0軟件對(duì)所有樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析， 見(jiàn)表8，通過(guò)分析得到所有樣品具有方差齊性的特點(diǎn)。對(duì)含量高的氧化苦參堿、氧化槐果堿而言，野生品與栽培品之間差異不顯著；含量較低的槐定堿、槐果堿、N-甲基野靛堿差異顯著，而苦參堿含量雖低，但亦無(wú)顯著差異。

3.2 聚類(lèi)分析 采用SPSS 20.0數(shù)據(jù)處理軟件，對(duì)長(zhǎng)治市不同縣苦參野生品與栽培品生物堿的含量進(jìn)行聚類(lèi)分析，以比較其品質(zhì)的差異。為消除原始數(shù)據(jù)對(duì)分析結(jié)果的影響，在分析過(guò)程中對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化處理。聚類(lèi)方法采用Ward法，距離類(lèi)型采用歐氏距離（Euclidean）法。聚類(lèi)結(jié)果見(jiàn)圖2。

從當(dāng)歐氏距離為1時(shí)，所有樣本可以分為4類(lèi)，每類(lèi)中均包含有野生樣本和栽培樣本。當(dāng)歐氏距離為11時(shí)，全部39批樣品被聚為兩大類(lèi)，第I類(lèi)包含5個(gè)栽培品和6個(gè)野生品，其中栽培品分別分布于潞城市、長(zhǎng)治縣、武鄉(xiāng)縣、沁縣；野生品主要分布在長(zhǎng)治縣、平順縣、武鄉(xiāng)縣及沁縣。第Ⅱ類(lèi)包含17個(gè)栽培品和11個(gè)野生品，其中栽培品分布地區(qū)為長(zhǎng)治縣、潞城市、屯留縣、平順縣、武鄉(xiāng)縣及沁縣。野生品分布于長(zhǎng)治縣、平順縣、武鄉(xiāng)縣及沁縣。綜上，野生品與栽培品混雜聚為不同類(lèi)別，同時(shí)從地理分布方面，亦無(wú)明顯規(guī)律。

3.3 主成分分析 為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)其生物堿含量差異，分別對(duì)該6種生物堿進(jìn)行了主成分分析，提取特征值大于1的前3個(gè)主成分進(jìn)行分析，第一主成分（PC1）、第2主成分（PC2）和第3主成分（PC3）累積方差貢獻(xiàn)率為75.083%。采用方差極大法對(duì)因子載荷矩陣實(shí)行正交旋轉(zhuǎn)，并繪制旋轉(zhuǎn)后的因子載荷圖。PC1主要反映了氧化苦參堿成分的主要信息，PC2，PC3則反映氧化槐果堿和槐果堿的主要信息，旋轉(zhuǎn)后方差貢獻(xiàn)率第1主成分為26.814%，第2主成分為25.152%，第3主成分為23.118%。根據(jù)得分系數(shù)計(jì)算長(zhǎng)治市野生與栽培苦參3個(gè)主成分得分，并繪制散點(diǎn)圖，見(jiàn)圖3。

由圖可知，所有樣品被分為4個(gè)區(qū)域，且4個(gè)區(qū)域與聚類(lèi)分析4類(lèi)成分相對(duì)應(yīng)，每個(gè)區(qū)域中也都包含野生和栽培品。A中氧化苦參堿（PC1）得分較高，其含量也較高，歸為第Ⅰ區(qū)域，其余樣品歸為第Ⅱ區(qū)域。第Ⅱ區(qū)域分為3小組，B組、C組樣品中受氧化苦參堿（PC1）及氧化槐果堿（PC2）含量影響較大，出現(xiàn)交叉現(xiàn)象，D組樣品受槐果堿和氧化槐果堿的影響較大，故聚為一類(lèi)。

在主成分分析中，未能將野生與栽培品分開(kāi)，相同或相近含量的野生與栽培樣品在散點(diǎn)圖中多距離較近。該結(jié)果與聚類(lèi)分析結(jié)構(gòu)基本一致。

4 討論

本文主要對(duì)道地產(chǎn)區(qū)長(zhǎng)治市周邊縣的野生與栽培苦參的主要生物堿成分含量差異進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，所有39批樣品均達(dá)到2015年版《中國(guó)藥典》的標(biāo)準(zhǔn)。從外觀(guān)特征來(lái)看，野生與栽培品苦參外觀(guān)形態(tài)無(wú)明顯差異。盡管獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果表明野生品與栽培品在微量成分上有差異，但由于組內(nèi)差異較大，無(wú)法區(qū)分野生品與栽培品。HCA和PCA結(jié)果也表明二者在生物堿含量方面無(wú)差異。

在野生品與栽培品的質(zhì)量比較中，為了避免因產(chǎn)區(qū)地理、氣候、環(huán)境等因素對(duì)藥材質(zhì)量的影響，對(duì)道地產(chǎn)區(qū)不同縣、鄉(xiāng)、村的樣品進(jìn)行實(shí)地采集，不僅收集了規(guī)范化種植基地、農(nóng)戶(hù)種植的樣本，而且幸運(yùn)的是目前仍有一定量的野生品可采挖，保證了質(zhì)量分析結(jié)果的可比性。為了比較不同產(chǎn)區(qū)的野生品與栽培品間的差異，仍在收集全國(guó)其他主產(chǎn)區(qū)的代表性樣本，以期得到更大范圍、具有可比性的質(zhì)量數(shù)據(jù)，為苦參的規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)化種植提供科學(xué)依據(jù)，為精準(zhǔn)扶貧做出貢獻(xiàn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Liu Y， Xu Y， Ji W， et al. Anti-tumor activities of matrine and oxymatrine： literature review[J].Tumour Biol Nlm， 2014， 35（6）：5111.

[2]郭林豐，童姍姍，余江南. 苦參堿抗腫瘤作用機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2013， 38（20）： 3409.

[3]張鳴杰，黃建. 苦參堿類(lèi)抗腫瘤作用機(jī)制研究的新進(jìn)展[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2004， 29（2）： 117.

[4]楊潔，劉萍，武曉玉. 苦參提取物對(duì)表皮葡萄球菌的體外抗菌活性研究[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志， 2007， 17（11）： 1357.

[5]中國(guó)藥典. 一部[S]. 2015：202.

[6]Gi Byoung H， Jung Eun L， Chu Won Nho， et al. Short-term effect of humid airflow on antimicrobial air filters usingSophora flavescens nanoparticles[J]. Sci Totalenviron， 2013， 444： 273.

[7]Jae Hee J， Jung Eun L， Gwi-Nam B. Use of electrosprayedSophora flavescens natural-product nanoparticles for antimicrobial air filtration[J].J Aerosol Sci， 2012， 45 （12）： 1510.

[8]朱晶晶，夏伯侯，王金華，等. 栽培苦參與野生苦參的藥效學(xué)研究[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2011， 17（1）： 96.

[責(zé)任編輯 丁廣治]