檸條花中總生物堿提取工藝研究

王菲 張艷珍 毛海峰

摘 要：以檸條花為原料，采用溶劑法提取檸條花中的總生物堿。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過L9（34）正交試驗(yàn)確定出最佳提取工藝條件。結(jié)果表明：最佳工藝為提取時(shí)間1h、料液比1∶15、乙醇濃度90%、提取溫度70℃。在此條件下，檸條花中總生物堿的得率為4.039%。

關(guān)鍵詞：檸條花;提取工藝;生物堿;得率

檸條（錦雞兒）主要分布于內(nèi)蒙古、甘肅、寧夏、青海等地。檸條花富含粗脂肪、粗纖維、碳水化合物、總黃酮、生物堿、多酚等。其中，生物堿具有抗菌、降血糖、抗腫瘤、抗心律失常、抗血小板聚集等活性，是許多藥用植物的有效成分[1-4]。目前從斷腸草、苦豆子等植物中提取出總生物堿[5-19]，湯俊等[20-21]從蛽殼花椒中提取和分離出9種化合物，有5種為已知生物堿。大部分游離的生物堿及其鹽類都能溶于甲醇和乙醇，雖然甲醇在沸點(diǎn)、溶解性等方面較乙醇有優(yōu)勢，但其對視神經(jīng)的毒性很大，所以實(shí)驗(yàn)室多用乙醇作為生物堿的提取溶劑[22]。目前生物堿的含量測定方法較多，如高效液相色譜法、紫外分光光度法、紫外薄層層析法、滴定法、重量法和酸性染料比色法等，但是重量法和滴定法均需多次萃取易造成誤差而導(dǎo)致重現(xiàn)性差[23]，高效液相色譜法則有操作繁瑣、耗費(fèi)大等不足，而本試驗(yàn)建立的酸性染料比色法測定檸條花中生物堿含量的方法，靈敏度高，操作簡單，重現(xiàn)性好，更適用于總生物堿的含量測定[24-25]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檸條花，購于青海省西寧市;鹽酸小檗堿對照品，中國藥品生物制品檢定所;溴甲酚綠，天津市白世化工有限公司;枸櫞酸，分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;磷酸氫二鈉，分析純，天津市紅巖化學(xué)試劑廠;甲醇，色譜純，天津市白世化工有限公司;鹽酸，分析純;氫氧化鈉，分析純;水為蒸餾水;氯仿，分析純;乙醇為90%。

1.2 設(shè)備

DK-8D型電數(shù)顯水浴鍋，金壇市盛威實(shí)驗(yàn)儀器廠;TU-1800spc型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;BS224S型電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;PH211型pH計(jì)，北京哈納科儀科技公司。

1.3 方法

1.3.1 生物堿的提取和測定方法

（1）生物堿的提?。孩贅悠非疤幚恚簷帡l花在60℃條件下烘干，粉碎過40目篩，備用。②供試品溶液的配制：準(zhǔn)確稱取檸條花樣品2.0g于250mL圓底燒瓶中，采用1∶15料液比加入90%乙醇（含0.1%HCL）回流提取1h，同法提取2次，合并濾液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，過濾收集濾液定容至50mL容量瓶中，備用。

（2）生物堿的測定：①對照品溶液的配制：精密稱取鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇溶解定容，得到濃度為0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。② 測定波長的選擇[22]：精密吸取鹽酸小檗堿對照品1mL及樣品溶液0.5mL，各加入pH 4.0枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液2mL，加入溴甲酚綠溶液1.5mL、氯仿10mL，振搖3min，靜置0.5h后分取氯仿液，另取枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液2mL同法操作所得氯仿液作為空白。分別在300～700nm進(jìn)行掃描。結(jié)果表明，對照品溶液和供試品溶液均在416nm處有穩(wěn)定的最大吸收，空白液則無吸收，故選擇416nm為測定波長。

（3）比色條件的選擇[22]：①緩沖液pH的選擇：精密吸取供試品溶液0.5mL和對照品1mL各5份，分別加入pH 3.6、4.0、4.4、4.8、5.2的枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液2mL，再加入pH 3.6、4.0、4.4、4.8、5.2的枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液配制的溴甲酚綠溶液1.5mL，其余按照2.3.2項(xiàng)下同法操作，在416nm處測定吸光度，結(jié)果表明，供試品和對照品在pH 4.0的緩沖液中吸光值最大，故選用pH 4.0緩沖液。②酸性染料用量的選擇：精密吸取對照品溶液2mL，揮干甲醇，分別加入pH 4.0枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制的溴甲酚綠溶液1、1.5、2、2.5、3mL，其余按照2.3.2項(xiàng)下同法操作，結(jié)果表明，當(dāng)溴甲酚綠溶液加入量為1.5mL時(shí)吸收度最大，故選用溴甲酚綠溶液的加入量為1.5mL。

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[22-24]：精密吸取鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL于具塞試管中，揮干甲醇，各加入pH 4.0的枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液2mL，溴甲酚綠溶液1.5mL，10mL氯仿溶液萃取，取氯仿層。氯仿溶液作為空白，在波長416nm處測定吸光度，將所得吸光度（A）和鹽酸小檗堿含量（m）作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=4.909 1X-0.001 6（r=0.999 2）。

（5）生物堿得率的測定：將待測樣品按情況準(zhǔn)確稀釋一定的倍數(shù)，使溶液濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，同標(biāo)準(zhǔn)曲線操作，測定吸光度，根據(jù)回歸方程算出檸條花中生物堿的濃度及得率。

1.3.2 單因素試驗(yàn) 分別以乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比、提取溫度及提取次數(shù)為考察因素，以生物堿得率為指標(biāo)，選擇單一因素下生物堿的最佳提取條件。

（1）乙醇濃度對生物堿得率的影響：稱取2.0g檸條花樣品，在提取時(shí)間1h、提取溫度50℃、料液比1∶15、提取次數(shù)2次，乙醇濃度分別為60%、70%、80%、90%、100%的條件下進(jìn)行水浴提取，過濾合并提取液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，收集濾液定容于100mL容量瓶中。按照生物堿得率的測定方法測定吸光度A，計(jì)算生物堿得率。

（2）提取時(shí)間對生物堿得率的影響：稱取2.0g檸條花樣品，在乙醇濃度60%、提取溫度50℃、料液比1∶15、提取次數(shù)2次，提取時(shí)間分別為0.5、1、1.5、2、2.5h的條件下進(jìn)行水浴提取，過濾合并提取液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，收集濾液定容于100mL容量瓶中。按照生物堿得率的測定方法測定吸光度A，計(jì)算生物堿得率。

（3）料液比對生物堿得率的影響：稱取2.0g檸條花樣品，在乙醇濃度60%、提取溫度50℃、提取時(shí)間1h、提取次數(shù)2次，料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25的條件下進(jìn)行水浴提取，過濾合并提取液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，收集濾液定容于100mL容量瓶中。按照生物堿得率的測定方法測定吸光度A，計(jì)算生物堿得率。

（4）提取溫度對生物堿得率的影響：稱取2.0g檸條花樣品，在乙醇濃度60%、料液比1∶15、提取時(shí)間1h、提取次數(shù)2次，提取溫度分別為30、40、50、60、70℃的條件下進(jìn)行水浴提取，過濾合并提取液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，收集濾液定容于100mL容量瓶中。按照生物堿得率的測定方法測定吸光度A，計(jì)算生物堿得率。

（5）提取次數(shù)對生物堿得率的影響：稱取2.0g檸條花樣品，在乙醇濃度60%、料液比1∶15、提取時(shí)間1h、提取溫度50℃，提取次數(shù)分別為1、2、3、4次的條件下進(jìn)行水浴提取，過濾合并提取液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，收集濾液定容于100mL容量瓶中。按照生物堿得率的測定方法測定吸光度A，計(jì)算生物堿得率。

1.3.3 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別以乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）、提取溫度（D）為考察因素，根據(jù)正交設(shè)計(jì)原理，以生物堿得率為指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對生物堿得率的影響 由圖1可知，檸條花中生物堿的得率隨乙醇濃度的增大，呈現(xiàn)先上升后逐漸下降的趨勢。當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí)，檸條花中生物堿得率最高。當(dāng)乙醇濃度高于80%時(shí)，檸條花中生物堿的得率逐漸下降，故選擇提取生物堿的最佳提取溶劑濃度為80%。

2.1.2 提取時(shí)間對生物堿得率的影響 由圖2可知，檸條花中生物堿的得率隨提取時(shí)間的增大，呈現(xiàn)先上升后逐漸下降的趨勢。當(dāng)提取時(shí)間為2h時(shí)，檸條花中生物堿得率最高。當(dāng)提取時(shí)間大于2h時(shí)，檸條花中生物堿的得率逐漸下降，故選擇提取生物堿的最佳提取時(shí)間為2h。

2.1.3 料液比對生物堿得率的影響 由圖3可知，檸條花中生物堿的得率隨料液比的增大，呈現(xiàn)先上升后逐漸下降的趨勢。當(dāng)料液比為1∶15時(shí)，檸條花中生物堿得率最高。當(dāng)料液比大于1∶15時(shí)，檸條花中生物堿的得率逐漸下降，故選擇提取生物堿的最佳料液比為1∶15。

2.1.4 提取溫度對生物堿得率的影響 由圖4可知，檸條花中生物堿的得率隨提取溫度的升高，呈現(xiàn)先上升后逐漸下降的趨勢。當(dāng)提取溫度為60℃時(shí)，檸條花中生物堿得率最高。當(dāng)提取溫度高于60℃時(shí)，檸條花中生物堿的得率逐漸下降，原因可能是由于溫度過高，破壞了生物堿的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致生物堿得率下降，故選擇提取生物堿的最佳提取溫度為60℃。

2.1.5 提取次數(shù)對生物堿得率的影響 由圖5可知，檸條花中生物堿的得率隨提取次數(shù)的增加，呈現(xiàn)先上升后逐漸下降的趨勢。當(dāng)提取次數(shù)為2次時(shí)，檸條花中生物堿得率最高。當(dāng)提取次數(shù)大于2次時(shí)，檸條花中生物堿的得率逐漸下降，故選擇提取生物堿的最佳提取次數(shù)為2次。

2.2 正交試驗(yàn)

由表1～2可知，極差大小變化為C>B>A>D，說明提取時(shí)間的改變對生物堿的提取影響最大，其次是料液比，各因素最佳水平組合為C1B2A3D3，確定最佳提取工藝為提取時(shí)間1h、料液比1∶15、乙醇濃度90%、提取溫度70℃。

3 結(jié)論

根據(jù)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果得知，提取時(shí)間對生物堿的提取影響最大，提取溫度對生物堿的提取影響最小。檸條花中總生物堿的提取工藝最佳條件為提取時(shí)間1h、料液比1∶15、乙醇濃度90%、提取溫度70℃，生物堿的得率可以達(dá)到4.039%。

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Abstract：The total alkaloids in caragana were extracted by solvent method.On the basis of single factor，the best extraction technology conditions were determined through L9（34）orthogonal test.The study suggested that the best process was after being extracted time 1 h，and solid-liquid ratio 1∶15，90% ethanol concentration，extraction temperature 70 ℃.Under these conditions，the percentage of total alkaloids in caragana was 4.039%.

Keywords：Caragana korshinskii flower;extracting process;alkaloid;yield

（責(zé)任編輯 唐建敏）