江西人群CCL3L1基因拷貝數(shù)與HIV感染相關(guān)性研究

靳廷麗，劉麗萍，易志強，張娜，唐翼龍，丁晨，廖清華

(1、江西省疾病預防控制中心，江西南昌330029；2、深圳市疾病預防控制中心，廣東深圳518055)

江西人群CCL3L1基因拷貝數(shù)與HIV感染相關(guān)性研究

靳廷麗1，劉麗萍1，易志強1，張娜1，唐翼龍1，丁晨1，廖清華2

(1、江西省疾病預防控制中心，江西南昌330029；2、深圳市疾病預防控制中心，廣東深圳518055)

目的研究江西省HIV/AIDS（艾滋病感染者/艾滋病病人）人群趨化性細胞因子配體蛋白CCL3L1（CC chemokine ligand 3－like－1）的拷貝數(shù)及其與HIV病毒（艾滋病病毒）易感性及艾滋病進展的關(guān)系。方法收集192例HIV/AIDS和131例陽性者配偶陰性血樣標本，提取基因組DNA，應(yīng)用PRT（the Paralogue Ratio Test）法檢測其CCL3L1基因拷貝數(shù)，計算江西省人群CCL3L1基因拷貝數(shù)中位數(shù)，用SPPS統(tǒng)計軟件分析CCL3L1拷貝數(shù)與HIV感染的關(guān)系。結(jié)果江西人群CCL3L1基因拷貝數(shù)中位數(shù)為2；HIV慢性感染者與健康人無顯著性差異（P＞0．05）；第一次CD4淋巴細胞數(shù)與基因拷貝數(shù)的變化有顯著相關(guān)(P＜0．05)。結(jié)論江西人群的CCL3L1基因拷貝數(shù)與HIV易感性無相關(guān)性，與感染進程有一定相關(guān)性。

江西；CCL3L1基因；艾滋病病毒；感染；相關(guān)性

CCL3L1蛋白是由CCL3L1基因編碼，它是一種強效化學趨化細胞因子，可以調(diào)節(jié)免疫、參與免疫細胞分化發(fā)育并介導炎癥反應(yīng)，也是CCR5（HIV感染時主要輔助受體）的天然配體之一，據(jù)報道CCL3L1基因拷貝數(shù)量與HIV易感性和疾病進程有著重要的關(guān)系[1，2]，CCL3L1基因拷貝數(shù)在不同個體之間、不同地域的人種之間是有差異的，在同一區(qū)域的同一人種的CCL3L1基因拷貝數(shù)均圍繞其平均值呈分散分布。例如，HIV陰性的非裔美洲人CCL3L1基因拷貝數(shù)平均為4個，而歐裔美洲人該值為2個[3，4]，對中國漢族人群的報道數(shù)值有1～4不等[5－7]，本研究針對江西省人群的CCL3L1基因拷貝數(shù)與HIV病毒感染相關(guān)性進行研究。

1 材料與方法

1．1研究對象收集2011年及之前確診的HIV/ AIDS患者血樣192份，男性110例，女性82例，平均年齡40歲，均已抗病毒治療并排除合并肺結(jié)核感染。同時收集131份健康人群血樣，該人群為陽性者配偶，男性39例，女性92例，平均年齡為42歲。

1．2實驗方法

1．2．1基因組DNA提取按照QIAGEN試劑盒說明書提取DNA，提取的DNA濃度的測定利用NanoDrop－5000微量分光光度計，根據(jù)實際測量濃度值稀釋或濃縮至5ng/μl。CCL3L1基因擴增的引物選擇參考Gonzalez E等[3]CCL3AF－FAM：TCATA GTGGGTTCTCTGTTTC，CCL3AR：ATCCAGGGCTGCTTACTT，擴增條件37℃2min，95℃3min，預變性，94℃15s變性，60℃20s延伸，72℃20s，35個循環(huán)72℃10min 25℃1min反應(yīng)結(jié)束后，制備瓊脂糖凝膠進行PCR產(chǎn)物鑒定，CCL3L1基因長度為220bp，內(nèi)參CCL3為226bp。

1．2．2 PCR產(chǎn)物的處理及毛細管電泳分析將鑒定完成的PCR產(chǎn)物稀釋20倍，再分別將1μl稀釋后的PCR產(chǎn)物、1μl LIZ500分子量內(nèi)標和8μl Hi－Di Formamide置于0．2ml單管中渦旋振蕩10s，2000 r/min分離心15s。將處理好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到96孔自動進樣托盤上進行毛細管電泳（原理如圖1）。見圖2。

圖1 來源Walker e tal./Genomics 93(2009)98-103

圖2 CCL3A基因毛細電泳圖譜

1．3數(shù)據(jù)分析根據(jù)樣本DNA與內(nèi)對照DNA擴增產(chǎn)物長度及熒光標記信息，利用GeneMarker V2．2．0對ABI3130測序儀生成的數(shù)據(jù)文件進行分析，輸出每個產(chǎn)物峰的峰面積值，輸出數(shù)據(jù)采用Excel進行處理分析。利用參照基因峰面積值（I）對目標基因峰面積值（S）進行校準后獲取目標基因的準確拷貝數(shù)。計算：CCL3L1基因拷貝數(shù)=目標基因拷貝數(shù)/參考基因拷貝數(shù)×2。計算出各樣本的CCL3L1基因拷貝數(shù)，用統(tǒng)計軟件分別計算HIV陽性者和陽性者配偶的基因拷貝數(shù)的中位數(shù)；從艾滋病綜合防治信息系統(tǒng)中查找出隨訪后第一次CD4淋巴細胞數(shù)和最近一次CD4淋巴細胞數(shù)，并計算CD4淋巴細胞數(shù)平均每月下降個數(shù)；采用SPSS21統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，根據(jù)概率P＜0．05，判斷差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 HIV陽性者和陽性者配偶的基因拷貝數(shù)的中位數(shù)均為2。

表1 HIV陽性者和陽性者配偶的基因拷貝數(shù)情況

2．2 CCL3L1基因拷貝數(shù)與HIV易感性分析結(jié)果192名HIV/AIDS患者和131名健康的陽性配偶的CCL3L1基因拷貝數(shù)用中位數(shù)進行統(tǒng)計描述，用卡方檢驗CCL3L1基因拷貝數(shù)變異與HIV易感性的相關(guān)關(guān)系，差異無統(tǒng)計學意義。

表2 CCL3L1基因拷貝數(shù)與HIV易感性進行卡方檢驗分兩種情況

2．3 CCL3L1基因拷貝數(shù)與CD4淋巴細胞數(shù)每月CD4淋巴平均變化數(shù)與CCL3L1基因拷貝數(shù)做相關(guān)統(tǒng)計。分別將前后兩次的CD4淋巴細胞數(shù)均分為三組，分別為大于350個/μl，200～350個/μl和小于200個/μl，與CCL3L1拷貝數(shù)中位數(shù)進行統(tǒng)計描述，用Spearman相關(guān)分析CCL3L1基因拷貝數(shù)變異與CD4淋巴細胞數(shù)變化關(guān)系。結(jié)果是與第一次CD4淋巴細胞數(shù)有顯著相關(guān)性，與最近一次CD4細胞數(shù)結(jié)果及CD4細胞平均月下降數(shù)均無相關(guān)性。

表3 與第一次CD4淋巴細胞數(shù)的關(guān)系

表4 與第二次CD4淋巴細胞數(shù)的關(guān)系

表5 與平均每月CD4淋巴細胞數(shù)變化的關(guān)系

3 討論

CCL3L1基因位于17q的一個重復區(qū)域，該區(qū)域包括CCL3L1和CCL4基因，它們在不同個體間存在拷貝數(shù)的差異。其編碼的CCL3L1蛋白是CCR5的高親和性配體，可最有效地抑制HIV-1與CCR5結(jié)合進入細胞。早在2002年就有人提出CCL3L1基因拷貝數(shù)的變異可能會影響某些疾病的易感性和進程，但CCL3L1基因拷貝數(shù)與HIV-1感染的關(guān)系尚無定論。2004年Bugeja MJ等[8]首先對CCL3L1基因與HIV易感性、感染進程的影響進行了人群研究。發(fā)現(xiàn)CCL3L1基因拷貝數(shù)與HIV易感性、感染進程無關(guān)。

2005年Gonzalez E等[3]對不同地區(qū)和不同種族人群的CCL3L1基因拷貝數(shù)的分布進行了全面研究，以相應(yīng)陰性人群的CCL3L1基因拷貝數(shù)的中位數(shù)為分界值，分析拷貝數(shù)與HIV感染易感性反應(yīng)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其中高于中位數(shù)者，隨拷貝數(shù)的增加獲得HIV感染的危險性降低，而低于中位數(shù)者，隨拷貝數(shù)減少獲得HIV感染的危險性增高。這些結(jié)果顯示，CCL3L1基因的相對拷貝數(shù)與HIV易感性之間存在劑量反應(yīng)關(guān)系，個體對HIV易感性的差異決定于其CCL3L1基因拷貝數(shù)在相應(yīng)種族人群的相對水平，即相對拷貝數(shù)，此外，CCL3L1拷貝數(shù)低于人群拷貝數(shù)中位數(shù)者的HIV感染者發(fā)展為艾滋病或死亡病程更短，提示CCL3L1基因相對拷貝數(shù)可影響艾滋病的發(fā)展進程。

本研究針對江西人群CCL3L1基因拷貝數(shù)對HIV影響的關(guān)系，采用的方法是Armour JA等[9，10]建立的一種精確測量基因拷貝數(shù)的新方法-the Paralogue Ratio Test(PRT)，采用一對引物擴增出兩種產(chǎn)物，一種是目的基因產(chǎn)物，另外一種是參考基因產(chǎn)物，基因拷貝數(shù)通過他們的比值獲得，這種方法已經(jīng)成功用于DEFB4基因拷貝數(shù)與牛皮癬的關(guān)系研究中[11，12]，并與Gonzalez E等[3]的檢測方法原理一致。本研究中陰性人群和陽性人群的CCL3L1基因拷貝數(shù)中位數(shù)均為2，采用人群的CCL3L1基因相對拷貝數(shù)中位數(shù)2為分界點進行統(tǒng)計分析，研究的結(jié)果得出HIV易感性與基因相對拷貝數(shù)無相關(guān)性。由于CD4淋巴細胞是艾滋病病毒侵犯的主要免疫細胞，本研究通過參照我省艾滋病感染人群的CD4淋巴細胞數(shù)的相關(guān)研究[13-15]來分析CCL3L1基因拷貝數(shù)對艾滋病進程影響，由于艾滋病常合并結(jié)核感染，為排除結(jié)核病對CD4淋巴細胞數(shù)的影響，我們收集血樣時已經(jīng)排除了合并結(jié)核病的樣本。研究結(jié)果顯示相對拷貝數(shù)與第一次CD4淋巴細胞數(shù)呈正相關(guān)性，而與第二次CD4淋巴細胞數(shù)及平均月CD4淋巴細胞數(shù)變化均無相關(guān)性，考慮原因可能為第一次CD4淋巴細胞數(shù)檢測時均未開展抗病毒治療，而第二次是經(jīng)過了抗病毒治療，而且治療時間長短不一，治療效果不一致，導致可比性降低，相比第一次CD4更有參考意義，由此提示CCL3L1基因相對拷貝數(shù)影響艾滋病進程。由于本研究樣本量較小，陽性者配偶者相對一般人群接觸艾滋病病毒的幾率更高，作為實驗陰性對照更有意義，但是不能排除部分陽性者配偶一直使用避孕套或者沒有性生活，因此和艾滋病病毒接觸機會就少，降低了陰性對照的可比性。我們得出的CCL3L1基因相對拷貝數(shù)與HIV易感性無相關(guān)性需進一步數(shù)據(jù)支持，進一步的研究需加大樣本量，并選定更具有參照意義的人群，收集更多的病程進展的指標如病毒載量作為參數(shù)等。本研究的成果為我們進一步研究奠定了重要基礎(chǔ)。

[1]deSilva E，Stumpf MP.HIV and the CCR5-Delta32 resistance allele[J].FEMS Microbiol Lett，2004，241(1)：1-12.

[2]Edward J.Hollox，Boon-Peng Hoh.Human gene copy number variation and infectious disease[J].Human Genetics，2014，133（10）：1217-1233.

[3]Gonzalez E，KμLkarni H，Bolivar H，et al.The influence of CCL3L1 gene-containing segmental duplications on HIV-1/AIDS susceptibility[J].Science，2005，307(5714)：1434-1440.

[4]Aklillu E，Odenthal-Hesse L，Bowdrey J，et al.CCL3L1 copy number，HIV load，and immune reconstitution in sub-Saharan Africans [J].BMC Infect Dis，2013，(13)：536-539.

[5]柳雅立，石英，徐斌，等.中國健康人趨化性細胞因子CCL3L1的基因拷貝數(shù)及其與HIV-1易感性關(guān)系的初步研究[J].北京醫(yī)學，2010，32（6）：428-430.

[6]徐斌，石英，惠威，等.趨化性細胞因子CCL3L1基因拷貝數(shù)與HIV-1易感性研究[J].中國實驗與診斷，2012，16(12)：2212-2215.

[7]鄭靈燕，裴元元，李淼新，等.CCL3L1基因拷貝數(shù)目變異與慢性乙肝的易感性相關(guān)[J].中國病理生理雜志，2011，27(10)：1951-1955.

[8]Bugeja MJ，Booth DR，Bennetts BH，et al.Analysis of the CCL3-L1 gene for association with HIV-1 susceptibility and disease progression[J].AIDS，2004，18(7)：1069-1071.

[9]Armour JA，Palla R，Zeeuwen PL，et al.Accurate，high-throughput typing of copy number variation using paralogue ratios from dispersed repeats[J].Nucleic Acids Research，2007，35(3)：19-23.

[10]Colobran R，Comas D，F(xiàn)aner R，et al.Population structure in copy number variation and SNPs inthe CCL4L chemokine gene[J]. Genes Immun，2008，9(4)：279-288.

[11]Shao W1，Tang J，Song W，et al.CCL3L1 and CCL4L1：variable gene copy number in adolescents with and without humanimmunodeficiency virus type 1(HIV-1)infection[J].Genes Immun，2007，8(3)：224-231.

[12]Hollox EJ，Huffmeier U，Zeeuwen PL，et al.Psoriasis is associated with increased beta-defensin genomic copy number[J].Nat Genet，2008，40(1)：23-25.

[13]楊健平，朱豐秀，黃棋.贛州市2007年至2012年新發(fā)現(xiàn)HIV感染者CD4檢測結(jié)果分析[J].實驗與檢驗醫(yī)學，2013，(4)：381-383.

[14]胡芹，吳建英，張敏，等.125例HIV感染者首次CD4~+T淋巴細胞檢測分析[J].實驗與檢驗醫(yī)學，2014，(4)：446-447.

[15]靳廷麗，廖清華，劉麗萍，等.江西省HIV感染者/AIDS人群首次CD4/CD8淋巴細胞數(shù)分析研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2014，6(24)：805-807.

Study of chemokine CCL3L1 gene copy number of people in Jiangxi province and its relationship with HIV-1 infection

JIN Tingli，LIAO Qinghua，LIU Liping，YI Zhiqiang ZHANG Na，TANG Yilong，DING Chen.Jiangxi Provincial Center for Disease Prevention and Control，Nanchang 330029，China.

Objective To study the chemokine CCL3L1 gene copy number of people in Jiangxi province and its relationship with HIV－1 infection．Methods Blood samples collected from the 192 cases of HIV/AIDS and 131 cases of HIV positive spouse who are HIV negative were used for the extraction of genomic DNA．The method of PRT(the Paralogue Ratio Test)was used to detect gene copy number of its CCL3L1，with that we calculated the median of CCL3L1 copy number in Jiangxi province．We investigated the relationship of CCL3L1 gene copy number with HIV by SPPS statistical software．Results The median of CCL3L1 copy number in Jiangxi province is two，and there is no statistical significant differences(P＞0．05)between the CCL3L1 copy number of HIV infected patients and that of healthy people．The first CD4 lymphocytes count after diagnosed is significantly correlated (P＜0．05)with CCL3L1 gene copy number．Conclusion The CCL3L1 gene copy numbers of people might not associate with the susceptibility to HIV but correlate with the progress of HIV/AIDS in Jiangxi．

Jiangxi；CCL3L1 HIV；Infection；Correlation

R512．91，R446．62

A

1674－1129(2017)02－0163－04

10．3969/j.issn.1674－1129．2017．02．008

2016-11-22；

2017-03-15)

江西省科技廳社會發(fā)展領(lǐng)域(20132BBG70098)

靳廷麗，1978年生，女，碩士，主管技師，主要從事艾滋病檢測與防制工作。Email:150225439@qq.com

廖清華，1972年生，主要從事艾滋病檢測與防制工作，Email：190898720@qq.com