高效液相色譜法測(cè)定辣椒中的辣椒堿類成分

袁麗麗，王海翔，洪桑桑，王歲樓

（中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇南京 211198）

高效液相色譜法測(cè)定辣椒中的辣椒堿類成分

袁麗麗，王海翔，洪桑桑，*王歲樓

（中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇南京 211198）

建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定辣椒中辣椒堿和二氫辣椒堿含量的方法。采用Ultimate AQ-C18型色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm），流動(dòng)相為水-甲醇（40∶60，V/V），流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。辣椒堿和二氫辣椒堿在0.001~0.150 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.999 9）；加樣回收率均值分別為99.35%和98.26%，RSD分別為0.82%和0.73%（n=9）；穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD為0.27%；中間精密度RSD低于3.79%（n=18）。該法準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，能快速測(cè)定辣椒中辣椒堿和二氫辣椒堿的含量。

高效液相色譜法；辣椒堿；二氫辣椒堿；辣椒

辣椒，又名番椒、辣子等，是一種藥食同源的茄科植物。除了作為蔬菜和調(diào)味品外，其果實(shí)和根莖可入藥，具有溫中散熱、健胃消食之功效[1]。辣椒中含有脂肪、維生素、蛋白質(zhì)、生物堿等多種成分[2]，VC含量居蔬菜之首，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。辣椒堿類化合物是辣椒果實(shí)中產(chǎn)生辛辣味道的主要成分，是一類同源的香草酰胺類生物堿，主要有辣椒堿（CA）、二氫辣椒堿（DC）、降二氫辣椒堿（NDC）、高辣椒堿（HC）和高二氫辣椒堿（HDC）等。其中，辣椒堿占46%~77%，二氫辣椒堿占21%~ 40%，二者占90%以上[3]，是辣椒品質(zhì)的重要指標(biāo)。辣椒堿亦是辣椒中主要活性成分，因具有鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、保護(hù)心血管、減肥等藥理作用[4-7]，使其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用得到廣泛關(guān)注。美國(guó)醫(yī)學(xué)會(huì)將其作為臨床上治療皰疹后神經(jīng)痛、糖尿病性神經(jīng)痛的首選藥物。除此之外，辣椒堿還可用來(lái)制作生化農(nóng)藥、軍事上的催淚彈等，具有廣泛用途。

試驗(yàn)采用超聲輔助提取法對(duì)辣椒粉樣品進(jìn)行處理，以辣椒堿和二氫辣椒堿為對(duì)照品，建立了高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)兩者的含量，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明，該法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、精密度良好，能很好地檢測(cè)辣椒粉中辣椒堿和二氫辣椒堿的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Dionex Ultimate 3000型高效液相色譜儀（包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器和Chromeleon 7工作站），美國(guó)Dionex公司產(chǎn)品；DV215CD型電子天平，美國(guó)OHAUS公司產(chǎn)品。

1.2 試劑

辣椒堿對(duì)照品（批號(hào)10L046，含量94.1%）、二氫辣椒堿對(duì)照品（批號(hào)X1800010，含量98.98%），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司產(chǎn)品；辣椒粉，興化市盛華食品有限公司產(chǎn)品；甲醇（色譜純），上海星可高純化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate AQ-C18型色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm），流動(dòng)相：水-甲醇（40∶60，V/V），流速1.0 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

2.2 溶液配制

（1）對(duì)照品溶液。精密稱取辣椒堿和二氫辣椒堿對(duì)照品約10 mg，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解定容，搖勻，作為對(duì)照品母液；精密量取對(duì)照品母液各1.0 mL，置于10 mL量瓶中，用90%甲醇水溶解定容，搖勻，制成每1 mL約含0.1 mg CA和DC的對(duì)照品溶液。

（2）樣品溶液。稱取辣椒粉約2.0 g，置于250 mL燒杯中，加入甲醇30 mL，于室溫下超聲提取2次，每次20 min；合并提取液，濃縮至干，用90%甲醇水溶解定容至10.0 mL；精密量取該溶液2.0 mL，置于10 mL量瓶中，用90%甲醇水稀釋定容，作為樣品溶液。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 專屬性試驗(yàn)

精密量取空白溶劑、對(duì)照品溶液、樣品溶液各20 μL，按照2.1項(xiàng)中色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖?？瞻兹軇┖蜆悠啡芤褐械碾s質(zhì)對(duì)CA峰和DC峰無(wú)干擾。

空白溶劑（a）、對(duì)照品溶液（b） 和樣品溶液（c）色譜見(jiàn)圖1。

2.3.2 線性關(guān)系考察

取CA和DC對(duì)照品約10 mg，精密稱量，置于10 mL量瓶中，用90%甲醇水溶解定容，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品母液；精密量取該溶液10，50，100，300，600，900，1 200，1 500 μL，分別置于10 mL量瓶中，用90%甲醇水稀釋定容，制成系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液各20 μL，按照2.1項(xiàng)中色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為YCA=198.76X-0.063 1（R2= 0.999 9），YDC=204.22X-0.099 5（R2=0.999 9），結(jié)果表明，CA和DC在0.001~0.150 mg/mL范圍內(nèi)峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。

圖1 空白溶劑（a）、對(duì)照品溶液（b）和樣品溶液（c）色譜

2.3.3 定量限和檢測(cè)限

取2.3.2項(xiàng)下的對(duì)照品母液適量，用90%甲醇水逐步稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照2.1項(xiàng)中色譜條件進(jìn)行測(cè)定。得該方法的最低檢測(cè)限質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL，最低檢測(cè)限0.01 μg（S/NCA=5.1，S/NDC=3.8）；最低定量限質(zhì)量濃度為1 μg/mL，最低定量限0.02 μg（S/NCA=12.4，S/NDC=9.7）。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取CA和DC對(duì)照品適量，精密稱量，用90%甲醇水制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的對(duì)照品溶液，于室溫下放置0，2，4，6，8，10，12，24 h后進(jìn)樣，按照2.1項(xiàng)中色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，CA和DC的色譜峰面積無(wú)明顯變化，RSD值分別為0.25%和0.27%。

2.3.5 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按照2.1項(xiàng)中色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，CA色譜峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD值分別為0.12%和0.28%；DC色譜峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD值分別為0.16%和0.46%，精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取辣椒粉6份，按照2.2項(xiàng)中的方法配制樣品溶液，按照2.1項(xiàng)中色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以外標(biāo)法計(jì)算CA和DC的含量，結(jié)果得CA和DC的含量均值分別為0.305 mg/g和0.228 mg/g，RSD值分別為0.42%和1.75%，表明此法重復(fù)性良好。

2.3.7 中間精密度試驗(yàn)

取辣椒粉，按照2.2項(xiàng)中的方法配制樣品溶液，由不同工作人員在不同時(shí)間使用不同儀器對(duì)樣品溶液進(jìn)行測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算CA和DC的含量，結(jié)果得CA和DC的含量均值分別為0.296 mg/g和0.222 mg/g，RSD值分別為3.24%和3.79%（n=18），表明此法具有良好的中間精密度。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn)

取辣椒粉9份，分別加入不同體積的對(duì)照品母液（相當(dāng)于對(duì)照品溶液濃度的80%，100%和120%），按照2.2項(xiàng)中的方法配制樣品溶液，按照 2.1項(xiàng)中色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算CA和DC的含量并計(jì)算回收率。

加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

由表1可知，表明該法的回收率良好。

2.3.9 耐用性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液和樣品溶液，分別考察柱溫、流速、有機(jī)相比例對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。

耐用性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，上述色譜條件的微小變化對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較小。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取CA和DC對(duì)照品，制成一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的甲醇溶液進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果顯示在波長(zhǎng)227 nm和280 nm處有吸收峰，考慮到280 nm處波長(zhǎng)較長(zhǎng)，不易受其他物質(zhì)的干擾，因此選擇280 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

CA（a）和DC（b）紫外掃描光譜見(jiàn)圖2。

圖2 CA（a）和DC（b）紫外掃描光譜

3.2 流動(dòng)相的選擇

辣椒堿類物質(zhì)極性很弱，在C18柱上保留很強(qiáng)，試驗(yàn)選擇水和甲醇為流動(dòng)相體系，隨著甲醇比例的增大，主峰保留時(shí)間縮短。由于CA色譜峰前、DC色譜峰后各有一雜質(zhì)峰，當(dāng)甲醇比例低于60%時(shí)，分離度無(wú)法滿足要求。而且從樣品溶液色譜圖1（c）中可以看出，提取液中的雜質(zhì)較多，主要集中在15 min之前出峰，因而使主峰保留時(shí)間在20 min之后。試驗(yàn)也參考美國(guó)藥典中辣椒堿原料藥的檢測(cè)方法，在流動(dòng)相中加入0.1%的磷酸，發(fā)現(xiàn)色譜峰形并沒(méi)有得到明顯改善。因此，最終確定流動(dòng)相為水-甲醇（40∶60，V/V）。根據(jù)文獻(xiàn)[8]推測(cè)，對(duì)照品溶液色譜圖1（b）中的雜質(zhì)峰1可能是降二氫辣椒堿（NDC），雜質(zhì)峰2可能是高辣椒堿（HC），這有待于進(jìn)一步確證。

3.3 溶劑的選擇

試驗(yàn)考察了不同比例的甲醇水溶液作溶劑時(shí)，主峰的峰形變化。

不同溶劑下CA和DC色譜峰的拖尾因子見(jiàn)表3。

表3 不同溶劑下CA和DC色譜峰的拖尾因子

由表3可知，當(dāng)甲醇比例為90%時(shí)，兩主峰的峰形最好。除此之外，還考察了辣椒粉甲醇提取物在不同溶劑中的穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)溶劑中甲醇比例低于90%時(shí)，放置一段時(shí)間后，溶液底部會(huì)有顏色較深的油狀物沉淀。因此，選擇90%甲醇水為溶劑。

4 結(jié)論

辣椒堿類成分是一系列同源的香草酰胺類生物堿，是辣椒中辛辣成分的主要來(lái)源，其中辣椒堿和二氫辣椒堿約占90%以上，是辣椒品質(zhì)和生理活性的代表性物質(zhì)。研究建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定辣椒粉中辣椒堿和二氫辣椒堿含量的方法。該法的樣品提取工藝簡(jiǎn)單，避免了繁瑣過(guò)程和劇烈條件導(dǎo)致的辣椒堿成分的損失及破壞；且在樣品色譜圖中主峰位置沒(méi)有雜質(zhì)干擾，專屬性強(qiáng)；方法精密度良好、準(zhǔn)確度高，具有較強(qiáng)的抗干擾能力，為辣椒的品質(zhì)評(píng)價(jià)和生理活性檢測(cè)提供了手段。

[1]王國(guó)強(qiáng).全國(guó)中草藥匯編 [M].北京：人民衛(wèi)生出版社出版，2014：668-669.

[2]中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編委會(huì).中國(guó)植物志 [M].北京：科學(xué)出版社出版，1978：61-63.

[3]Govindarajan V S.Capsicum production，technology，chemistry，and quality-Part II.Processed products，standards，world production and trade[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition，1986，23（3）：207-288.

[4]郭軍華，黃烽，吳東海，等.辣椒堿治療關(guān)節(jié)痛的Ⅱ期臨床研究 [J].中國(guó)新藥雜志，2002，11（12）：949-951.

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[6]Haanpaa M，Treede R D.Capsaicin for neuropathic pain：linking traditional medicine and molecular biology[J]. European Neurology，2012，68（5）：264-275.

[7]Zhang R，Humphreys I，Sahu R P，et al.In vitro and in vivo induction of apoptosis by capsaicin in pancreatic cancer cells is mediated through ROS generation and mitochondrial death pathway[J].Apoptosis，2008，13（12）：1 465-1 478.

[8]韓玉珠，石磊嶺，金莎，等.反相高效液相色譜法測(cè)定辣椒中4種辣椒堿類成分的含量 [J].食品科學(xué)，2012，33（16）：257-260.

Determination of Capsaicinoids in Chili Peppers by HPLC

YUAN Lili，WANG Haixiang，HONG Sangsang，*WANG Suilou
（China Pharmaceutical University，Nanjing，Jiangsu 211198，China）

A high performance liquid chromatography（HPLC） method is established to simultaneously determine capsaicin and dihydrocapsaicin in chili peppers.The HPLC method are performed on a Ultimate AQ-C18column（4.6 mm×250 mm，5 μm） using a mobile phase of methyl alcohol and water（40∶60，V/V） at a flow rate of 1.0 mL/min.The colum temperature is matained at 30℃and the detection wavelength is set at 280 nm.An excellent linear relationship between peak areas and concentrations of capsaicin and dihydrocapsaicin in the range of 0.001~0.150 mg/mL（R2=0.999 9）is observed.The average recovery rates is 99.35%and 98.26%of capsaicin and dihydrocapsaicin respectively with an RSD of 0.82%and 0.73%（n=9）.The stability RSD is 0.27%.The intermediate precision RSD is lower than 3.79%（n=18）.This method can be used to determine capsaicin and dihydrocapsaicin in chili pepper rapidly with high accuracy and good repeatability.

HPLC；capsaicin；dihydrocapsaicin；chili peppers

TS255.7

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.02.040

1671-9646（2017）02b-0045-03

2017-01-04

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)（3010010152）。

袁麗麗（1991— ），女，在讀碩士，研究方向?yàn)槭称放c藥品質(zhì)量。

*通訊作者：王歲樓（1961— ），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槭称放c藥品質(zhì)量。