食品中羅丹明B的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)

葉佳明，汪慶旗，應(yīng)寒松，葉磊海，王慶齡

（1.浙江公正檢驗(yàn)中心有限公司，浙江杭州 310009；2.浙江贊宇科技股份有限公司，浙江杭州 310009）

食品中羅丹明B的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)

葉佳明1，2，汪慶旗1，2，應(yīng)寒松1，2，葉磊海1，2，王慶齡1，2

（1.浙江公正檢驗(yàn)中心有限公司，浙江杭州 310009；2.浙江贊宇科技股份有限公司，浙江杭州 310009）

建立了使用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)食品中羅丹明B含量的分析方法。食用油樣品經(jīng)70%甲醇水溶液提取后，直接可用于進(jìn)樣分析，固體樣品以70%甲醇溶液提取、MCX固相萃取柱凈化，經(jīng)色譜柱分離后，以0.1%甲酸水和乙腈梯度洗脫，經(jīng)ESI+模式、多反應(yīng)模式（MRM）進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，羅丹明B在1.0~100.0 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，空白樣品加標(biāo)的回收率在90.3%~96.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于5%，檢出限為0.5 μg/kg，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于食品中羅丹明B的定性和定量分析。

羅丹明B；固相萃?。灰合嗌V串聯(lián)質(zhì)譜

羅丹明B又稱為堿性玫瑰精，是一種鮮桃紅色的三苯甲烷類堿性人工合成染料，具有持久鮮艷的熒光特性和良好的脂溶性[1]，因其具有高毒、高殘留和致癌、致畸、致突變等特性[2]，我國(guó)和歐盟等都不允許在食品中添加，但仍有部分不法商企使用羅丹明B對(duì)辣椒等調(diào)味料進(jìn)行染色。目前，食品中羅丹明B的檢測(cè)方法主要使用高效液相色譜-熒光法和高效液相色譜-質(zhì)譜法[3-4]。這2種檢測(cè)方法均能滿足對(duì)低殘留羅丹明B的檢測(cè)，主要存在的問題集中在樣品的提取凈化過程，作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)被實(shí)驗(yàn)室廣泛使用的僅有SN/T2430—2010進(jìn)出口食品中羅丹明B的檢測(cè)方法。該方法采用凝膠凈化系統(tǒng)GPC進(jìn)行純化，采用液相色譜熒光檢測(cè)器或質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行分析，使用GPC凈化存在有機(jī)溶劑使用量大、操作繁瑣、難以批量操作等問題。另一種常用的凈化手段是使用中性氧化鋁柱凈化[5]，但中性氧化鋁柱法凈化存在準(zhǔn)備周期長(zhǎng)、樣品回收率不穩(wěn)定等問題。喬勇升等人[6]對(duì)食用油中的羅丹明B采用丙酮提取，經(jīng)MCX陽離子固相萃取柱凈化后采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，但丙酮試劑應(yīng)用范圍小，不適用其他類食品中羅丹明B的檢測(cè)。試驗(yàn)以70%甲醇水為提取液，食用油等常規(guī)樣品簡(jiǎn)單處理即可直接檢測(cè)，復(fù)雜基質(zhì)樣品使用固相萃取柱富集凈化，以高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行定性、定量檢測(cè)分析。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀，Agilent 6460型三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，AR2140型電子分析天平，IKA VORTEX GENIU 3型渦旋混合器，TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī)，KS-300EI型超聲波清洗器，氮吹儀。

甲醇（色譜級(jí)），乙腈（色譜級(jí)），丙酮（色譜級(jí)），正己烷（色譜級(jí)），羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司產(chǎn)品，純度95%），Oasis MCX固相萃取柱（60 mg/3 mL，3 μm），OasisHLB固相萃取柱（60 mg/3 mL，3 μm）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取

（1）丙酮提取。稱取2.0 g食用油樣品于50 mL離心管中，加入10 mL丙酮渦旋溶解后，經(jīng)MCX小柱凈化，使用前依次用3 mL甲醇，3 mL水活化，再依次用3 mL丙酮，3 mL甲醇淋洗，棄去淋洗液，用3 mL 5%氨水甲醇洗脫，收集洗脫液，于40℃下氮?dú)獯蹈?，加? mL流動(dòng)相復(fù)溶，過0.22 μm濾膜后，待測(cè)。

（2）乙腈水提取。稱取2.0 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL 70%乙腈水溶液渦旋3 min，超聲提取20 min。以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5 min，取上清液，過0.22 μm濾膜后，待測(cè)。

（3） 乙腈水-正己烷提取。稱取2.0 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL 70%乙腈水溶液渦旋3 min，再加入5 mL正己烷渦旋振蕩，超聲提取20 min。以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5 min，棄去上層正己烷層，下層液體過0.22 μm濾膜后，待測(cè)。

1.2.2 凈化

取2 mL 70%乙腈水提取液于40℃下氮?dú)獯蹈桑コ袡C(jī)相后過HLB小柱，使用前依次用3 mL甲醇，3 mL水活化，用3 mL水淋洗，用3 mL甲醇洗脫，收集洗脫液于40℃下氮?dú)獯蹈?，加? mL流動(dòng)相復(fù)溶，過0.22 μm濾膜后，待測(cè)。

取2 mL 70%乙腈水提取液過MCX小柱，使用前依次用3 mL甲醇，3 mL水活化，依次用3 mL0.1 mol/L鹽酸水溶液，3 mL甲醇淋洗，用3 mL 5%氨水甲醇洗脫，收集洗脫液，于40℃下氮?dú)獯蹈桑尤? mL流動(dòng)相復(fù)溶，過0.22 μm濾膜后，待測(cè)。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent SB C18，RRHD 1.8 μm，2.1 mm× 100 mm；流動(dòng)相：0.1%甲醇水溶液和乙腈；流速：0.3 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：2 μL。

梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.2.4 質(zhì)譜條件

電噴霧ESI離子源；正離子掃描模式；多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM）。

質(zhì)譜離子源參數(shù)見表2，MRM質(zhì)譜參數(shù)見表3。

表2 質(zhì)譜離子源參數(shù)

表3 MRM質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

羅丹明B具有較強(qiáng)的極性，易溶于水、甲醇和乙腈，微溶于丙酮。對(duì)于水溶性樣品溶解后即為提取完全，但含油脂樣品中需要加入一定比例的甲醇或者乙腈才能提高提取率，通過試驗(yàn)比較，70%甲醇水溶液提取效果理想且回收率穩(wěn)定。試驗(yàn)采用70%甲醇水作為提取溶液，并比較了文獻(xiàn)[6]報(bào)道中丙酮提取效果。正己烷能有效去除脂肪，加入正己烷混合提取后，經(jīng)離心處理，能充分去除提取液中的少量油脂。試驗(yàn)考察了加入正己烷后對(duì)羅丹明B提取效果的影響。

不同溶劑提取回收率見表4。

表4 不同溶劑提取回收率

針對(duì)辣椒油、花椒油等食用油樣品分別用丙酮、70%乙腈水溶液，70%乙腈水-正己烷溶液提取，均有較好的提取效果。由表4可知，3種提取液的平均加標(biāo)回收率在89.2%~98.6%，丙酮提取液與70%乙腈水提取液提取效果基本相似，70%乙腈水-正己烷提取液平均回收率在90%左右，略低于其他2種提取液，這可能是由于少量羅丹明B殘留在正己烷溶劑中。加入正己烷后雖能去除提取液中的油脂，但也降低了羅丹明B的提取率，綜合考慮不使用正己烷凈化處理。為考察實(shí)際樣品的提取效果，選取3個(gè)陽性辣椒油樣品，分別采用丙酮、70%甲醇水、70%甲醇水-正己烷溶液提取，3種提取液中70%甲醇水提取液測(cè)定結(jié)果最高，丙酮其次，70%甲醇水-正己烷溶液提取效果略差，只有70%甲醇水提取率的90%左右，與加標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果一致。針對(duì)食用油樣品以70%甲醇水溶液提取即可直接分析檢測(cè)，使用丙酮提取還需要過柱凈化，綜合分析采用70%甲醇水作為提取溶液。

辣椒油中不同溶劑提取羅丹明B測(cè)定值見圖1。

圖1 辣椒油中不同溶劑提取羅丹明B測(cè)定值

2.2 固相萃取柱凈化

食用油樣品通過70%甲醇水提取，即可進(jìn)行測(cè)定分析，對(duì)于其他復(fù)雜基質(zhì)的樣品，僅采用70%甲醇提取后，提取液雜質(zhì)含量多、基質(zhì)效應(yīng)大，會(huì)影響測(cè)定的準(zhǔn)確性；采用固相萃取柱凈化后，能大幅降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，并能提高儀器的靈敏度。根據(jù)羅丹明B結(jié)構(gòu)中具有氨基、羧基和苯環(huán)，分別選取陽離子交換固相萃取柱（Oasis MCX柱）和反相固相萃取柱（Oasis HLB柱）進(jìn)行凈化效果考察。按試驗(yàn)方法進(jìn)行樣品凈化，結(jié)果顯示，以O(shè)asis MCX柱凈化回收率為95.2%±2.0%，以O(shè)asis HLB柱凈化回收率為89.4%±3.2%，二者均能滿足羅丹明B的分析檢測(cè)要求。二者相比較，Oasis MCX柱回收率更高、操作更簡(jiǎn)單，提取液不需要去除有機(jī)溶劑即可直接過柱凈化，因此選用Oasis MCX柱作為凈化萃取柱。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

分別配置標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度分別為1.0，5.0，10.0，25.0，50.0，100.0 ng/mL進(jìn)行分析，以定量離子色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)、羅丹明B質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

羅丹明B的濃度在1.0~100.0 ng/mL范圍內(nèi)呈線性分布，其線性回歸方程為Y=9 035.1X+855.8，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。采用空白基質(zhì)添加羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品的方法，以3倍信噪比計(jì)算羅丹明B的檢出限為0.5 μg/kg。

羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品的液質(zhì)總離子流圖及MRM圖（質(zhì)量濃度為50 ng/mL）見圖2。

2.4 方法精密度和回收率

選取辣椒油、黃豆醬、花生樣品，添加不同含量的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品，按試驗(yàn)方法進(jìn)行處理，平行測(cè)定6份。

精密度和回收率（n=6）見表5。

由表5可知，樣品的平均加標(biāo)回收率在90.3%~ 96.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于5%。結(jié)果表明，此方法具有良好的準(zhǔn)確性和可靠性。

圖2 羅丹明B液質(zhì)總離子流圖及MRM圖

表5 精密度和回收率（n=6）

3 結(jié)論

試驗(yàn)研究了食品中羅丹明B高效液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，比較了不同溶劑的提取效果，通過MCX固相萃取柱凈化后，降低了樣品的基質(zhì)效應(yīng)，去除了大部分雜質(zhì)，空白樣品加標(biāo)回收和重復(fù)性良好。該法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于食品中羅丹明B的定性和定量分析，也為其他類似工業(yè)染料的檢測(cè)方法提供參考。

[1]咸瑞卿，高文超，王小兵，等.調(diào)味品中羅丹明B的HPLCFLD-DAD測(cè)定方法研究 [J].中國(guó)調(diào)味品，2013（38）：109-111.

[2]王傳現(xiàn)，韓麗，方曉明，等.食品中羅丹明B的高效液相色譜熒光檢測(cè) [J].分析儀器，2008（1）：27-30.

[3]林清荷，陳鑫，吳忠興.辣椒粉中羅丹明B液相色譜檢測(cè)方法的研究 [J].農(nóng)產(chǎn)品加工（學(xué)刊），2012（11）：157-159.

[4]朱曉軍，顏春榮，董璨，等.固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用同時(shí)檢測(cè)豆制品中4種紅黃色系工業(yè)染料 [J].2012（6）：190-194.

[5]薛昆鵬，金小青，余沖，等.固相萃取-高效液相色譜-熒光法測(cè)定辣椒制品中的羅丹明B[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2016，7（6）：2 375-2 380.

[6]喬勇升，韓芷玲，劉媛，等.固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食用調(diào)味油中的羅丹明B[J].理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè)，2013，49（7）：844-847.

Determination of Rhodamine B in Food by High Performance Liquid Chromatographic Tandem Mass Spectromrtry

YE Jiaming1，2，WANG Qingqi1，2，YING Hansong1，2，YE Leihai1，2，WANG Qingling1，2
（1.Zhejiang Gongzheng Testing Center Co.，Ltd.，Hangzhou，Zhejiang 310009，China；2.Zhejiang Zanyu Technology Group Co.，Ltd，Hangzhou，Zhejiang 310009，China）

An analysis method is established for detecting the content of Rhodamine B in food using performance liquid chromatographic tandem mass spectromrtry.Sample of edible flavoring oil is extracted with 70%methanol water solution，which can be directly used for analysis.Solid sample is extracted with 70%methanol，the extracting solution is taken for purification by MCX cation solid phase extraction column，and then separated by C18column，using acetonitrile and 0.1% formic acid solution for gradient elution，detected by positive ESI+and multi-reactions monitoring modes.The result shows that the linearity of Rhodamine B is better in the range of 1.0~100.0 ng/mL.Test for recovery are made at different concentration levels of Rhodamine B standard，giving values of recovery in the range of 90.3%~96.8%，with RSD less than 5%.The detection limit of Rhodamine B is 0.5 μg/kg.The method has the characteristics of low detection limit and high sensitivity，so it is suitable for qualitative and quantitative analysis of Rhodamine B in food.

Rhodamine B；solid phase extraction；performance liquid chromatographic tandem mass spectromrtry

O658

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.02.042

1671-9646（2017）02b-0052-03

2017-01-06

葉佳明（1987— ），男，碩士，助理工程師，研究方向?yàn)槭称窓z測(cè)。