苯丙酮尿癥新生兒血斑中輔酶及葡萄糖等物質(zhì)的分析

閆靜??王春艷 張雯艷 皮子鳳 劉志強(qiáng)++宋鳳瑞

摘要苯丙酮尿癥（PKU）是新生兒先天性苯丙氨酸羥化酶缺陷所引起的苯丙氨酸代謝障礙疾病。本研究采用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，測定了5例PKU新生兒出生3天和出生30天后的血斑與20例年齡相仿的正常新生兒血斑中輔酶Q10的絕對(duì)含量和輔酶Q9的相對(duì)含量，其中，健康新生兒血斑中輔酶Q10的含量為（122.1±24.9）ng/mL，PKU新生兒組的含量為（59.0±12.0）ng/mL。采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定了膽固醇和葡萄糖的相對(duì)含量。研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，PKU新生兒血斑中輔酶Q10、Q9、膽固醇和葡萄糖的含量均顯著降低，輔酶Q10的降低與血斑中苯丙氨酸含量升高呈現(xiàn)顯著反向相關(guān)。本研究結(jié)果為PKU患兒的飲食治療方案提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞苯丙酮尿癥；輔酶Q10；膽固醇；葡萄糖

1引言

苯丙酮尿癥（Phenylketonuria，PKU）是一種由于肝臟苯丙氨酸羥化酶（PAH）缺乏或活性減低而導(dǎo)致苯丙氨酸代謝障礙的常染色體隱性遺傳性疾病。輔酶Q10（CoQ10）是一種小分子醌類化合物，主要參與線粒體氧化磷酸化過程，在營養(yǎng)物質(zhì)在線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)化為能量的過程中起重要作用，且有明顯的抗脂質(zhì)過氧化作用[1，2]。人體的所有細(xì)胞中都存在CoQ10[3]，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在有輔酶Q9（CoQ9）[4]。CoQ10在個(gè)體中含量差異主要受飲食和疾病的影響[5]，人體的血液和生物組織中，90%以上CoQ10是還原型[1，6，7]。Artuch等[8]在1999年首次報(bào)道了PKU患者體內(nèi)CoQ10含量降低，通過飲食治療的PKU患兒與相應(yīng)年齡的正常對(duì)照組相比，血清中的CoQ10含量顯著降低。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，PKU患者血清中CoQ10降低主要是由于苯丙氨酸（Phe）含量升高[9]。

苯丙氨酸有抑制膽固醇合成的作用[10，11]。Hughes等[12]發(fā)現(xiàn)，血清中CoQ10的降低與血清中的膽固醇水平有關(guān)。在PKU患兒病癥與CoQ10和膽固醇等含量關(guān)系的研究中，目前的研究對(duì)象均為飲食治療或控制的PKU患兒與相應(yīng)年齡的正常兒童，然而由于血漿/血清中的CoQ10受飲食影響較大，所以無法確定其差異變化源于疾病本身，還是由于飲食差異。

人血清CoQ10的分析方法有色譜分析法、分光光度法、比色法[13]、電化學(xué)分析法[14]和電泳法[15]，其中反向液相色譜分析應(yīng)用最為廣泛，所使用的檢測器主要有紫外檢測器[16]、電化學(xué)檢測器[17，18]和質(zhì)譜檢測器[19～25]，其中質(zhì)譜檢測的選擇性和高靈敏度高。本研究采用超高效液相色譜與三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，進(jìn)行新生兒血斑中CoQ10的定量分析和CoQ9的半定量分析，采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GCMS）測定膽固醇和葡萄糖，研究了PKU新生患兒與正常新生兒之間的CoQ10、膽固醇以及葡萄糖含量差異。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象

PKU新生兒與正常新生兒血斑均來自吉林省婦幼保健院（已簽署知情同意書，并經(jīng)倫理委員會(huì)同意），實(shí)驗(yàn)中使用S&S903濾紙進(jìn)行新生兒血斑采集，正常新生兒組包括20例出生3天后的新生兒血斑，PKU新生兒組包括5例出生3天與出生30天未經(jīng)飲食治療的PKU新生兒血斑。使用1296071Delfia血斑打孔器（PerkinElmer公司）在濾紙片上采集直徑為3.2mm的圓形血斑（相當(dāng)于3.4μL血液，可以保證每片血斑中的血液含量是一致的[27]）。血斑在檢測輔酶含量前，需在室溫晾干處理至少24h；或?qū)悠酚?℃保存待測。

2.2儀器與試劑

WatersXevoTQ質(zhì)譜儀（英國Micromass公司），電噴霧離子源，數(shù)據(jù)采集使用MassLynx4.1采集軟件和處理軟件（Waters公司，Manchester公司，英國）；AcquityUltraPerformanceLC超高效液相色譜系統(tǒng)（美國Waters公司），配有自動(dòng)進(jìn)樣器。6890Nnetworld氣相色譜系統(tǒng)（美國AgilentTechnologies公司），配5975inertXLMassselectivedetector質(zhì)譜檢測器，7683seriesG2614AN279自動(dòng)進(jìn)樣器。

CoQ10、CoQ9、CoQ4，色譜級(jí)氨水和氟化銨（美國SigmaAldrich公司）；甲醇（色譜純，美國Tedia公司）；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（D（+）Glucose，minimum99%GC，美國Sigma公司）；其余試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水（MilliQ，比利時(shí)Millipore公司）。

2.3質(zhì)譜條件和色譜條件

質(zhì)譜條件：采用正離子模式，多反應(yīng)離子監(jiān)測模式進(jìn)行檢測，錐孔電壓和碰撞電壓通過Intellistart功能進(jìn)行優(yōu)化。離子源電壓為3.0kV，離子源溫度為120℃，去溶劑溫度為500℃，去溶劑氣體流速為800L/h，錐孔氣流速為50L/h。碰撞氣氬氣壓力為0.43Pa。使用QuanLynx軟件（Micromass，UK）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及進(jìn)行定量分析。

超高效液相色譜分離條件：ACQUITYUPLCBEHC18色譜柱（50mm×2.1mm，1.7μm，Waters公司），流動(dòng)相A為含0.005%（V/V）氨水和0.2mmol/LNH4F的甲醇溶液，流動(dòng)相B為純水，以A〖KG-3∶〖KG-5B=99.9〖KG-3∶〖KG-50.1（V/V）等度洗脫，流速為0.45mL/min，色譜柱平衡時(shí)間為10min。流動(dòng)相中的銨離子可以增強(qiáng)輔酶在質(zhì)譜中的信號(hào)。由于輔酶的極性較小，在反相色譜柱中很難被洗脫，最終確定采用純水（流動(dòng)相B）與添加NH+4的甲醇有機(jī)相（流動(dòng)相A）為流動(dòng)相進(jìn)行分析。

2.4血斑樣品中輔酶的提取

取兩片直徑3.2mm的血斑，置于1.5mL離心管中，加入102μL含0.1%甲酸（V/V）的甲醇，超聲提取20min，11000r/min離心15min，取上清液進(jìn)行液相色譜質(zhì)譜分析[23]。

2.5膽固醇和葡萄糖的GCMS分析

取一片直徑3.2mm的血斑，加入100μL雙（三甲基甲硅烷基）三氟乙酰胺（Bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide，BSTFA）和50μL吡啶，振蕩混勻后，70℃反應(yīng)2h，11000r/min離心5min，取上清液進(jìn)行GCMS分析。GCMS儀器設(shè)置條件：初始柱溫70℃，保持1.5min；以20℃/min升溫至220℃，保持5min；以10℃/min程序升溫至230℃，保持5min；以10℃/min程序升溫至280℃，保持5min，每個(gè)樣品的運(yùn)行時(shí)間為30min。無分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積1μL。載氣為氦氣，總流速為7.8mL/min。HP5MS毛細(xì)管柱（0.25mm×30m×0.25μm，Agilent19091S433）。電子轟擊離子源，正離子模式檢測，電子能量70eV，離子源溫度280℃。

3結(jié)果與討論

3.1串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)的確定

通過直接進(jìn)樣分析模式優(yōu)化質(zhì)譜條件，輔酶標(biāo)準(zhǔn)品用實(shí)驗(yàn)中的流動(dòng)相溶解，進(jìn)行質(zhì)譜檢測。優(yōu)化后3種輔酶的準(zhǔn)分子離子＼[M+NH4＼]+與特征分子離子組成的定量離子對(duì)及其它質(zhì)譜參數(shù)見表1。在正離子質(zhì)譜條件下，CoQ10，CoQ9和CoQ4的準(zhǔn)分子離子＼[M+NH4＼]+分別為m/z880.7，m/z812.4和m/z472.6，特征子離子m/z197.0代表的是輔酶碎片離子苯醌環(huán)結(jié)構(gòu)。

3.2方法的分析性能

以不同濃度CoQ9和CoQ10的峰面積與一定濃度內(nèi)標(biāo)CoQ4的峰面積比值作為縱坐標(biāo)，CoQ9和〖CM（44CoQ10的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定CoQ10線性方程為y=4.180x-4.835，相關(guān)系數(shù)R2=〖CM）

0.997，線性范圍為1.5～89.0ng/mL，檢出限（LOD，S/N>3）為0.8ng/mL，定量限（LOQ，S/N>10）為1.5ng/mL。測定CoQ9線性方程為y=15.238x-0.798，R2=0.999，線性范圍為0.3～20.0ng/mL，LOD為0.2ng/mL，LOQ為0.3ng/mL。測定CoQ9和CoQ10的日內(nèi)和日間精密度，以及添加不同濃度輔酶標(biāo)準(zhǔn)品后的回收率，日內(nèi)和日間精密度（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差）均小于15%，回收率在85.0%～115.0%之間，說明本方法準(zhǔn)確、可靠。

3.3血斑樣品的分析

采用UPLCMS/MS方法分析新生兒血斑樣品（健康新生兒20例，經(jīng)典型PKU新生兒5例）中CoQ9和CoQ10的含量，其中5例PKU新生兒血斑樣品分別為出生3天和30天后采集。PKU是一種以智力低下為特征的先天性代謝缺陷疾病，分為經(jīng)典型和非經(jīng)典型兩類。2其中經(jīng)典型是由于苯丙氨酸缺乏或活性降低所致。圖1為健康新生兒與經(jīng)典型PKU新生兒血斑樣品中CoQ9和CoQ10的MRM離子流圖。與健康正常新生兒（圖1A）相比，PKU新生兒血斑中（圖1B）CoQ9和CoQ10的含量均顯著降低。CoQ10的信噪比（S/N）均大于10，可以進(jìn)行定量分析，而CoQ9的3

正常新生兒組CoQ10的含量為（122.1±24.9）ng/mL（20例新生兒出生3天后采集的血斑），PKU新生兒組的含量為（59.0±12.0）ng/mL（分別為5例出生3天和30天后采集的血斑）。與正常新生兒相比，PKU新生兒血斑中CoQ10的含量顯著降低。如表2所示，兩組的t檢驗(yàn)結(jié)果為p<0.001（4.1×10

0）。此外，以峰面積大小進(jìn)行相對(duì)含量分析，在正常新生兒血斑中（圖1A）中可以定量檢測到CoQ9，而在PKU新生兒血斑中（圖1B）CoQ9含量低于方法定量限，表明PKU新生兒血斑中CoQ9的含量與健康對(duì)照組相比顯著降低。

PKU新生兒血斑中苯丙氨酸（Phe）的含量采用本研究組已建立的分析方法[24，25]進(jìn)行測定。PKU新生兒血斑中苯丙氨酸的含量與CoQ10之間的含量如表2和圖2所示，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次，樣品1～5號(hào)為PKU新生兒出生3天后采集的血斑，樣品6～10號(hào)為PKU新生兒出生30天后采集的血斑，可見血液中Phe的含量越高，CoQ10的含量越低。經(jīng)典型PKU患兒由于苯丙氨酸羥化酶缺乏或活性降低會(huì)導(dǎo)致Phe代謝障礙，使血液中的Phe含量顯著升高，其血液中CoQ10的降低可能是由于其自身的抗氧化作用所導(dǎo)致。

3.4膽固醇和葡萄糖的GCMS的結(jié)果分析

采用GCMS分析經(jīng)衍生化處理后的血斑提取樣品[25]，根據(jù)譜庫檢索對(duì)α和β型D葡萄糖以及膽〖CM（44固醇進(jìn)行歸屬，并測定其相對(duì)含量，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次。由表3可知，與正常新生兒相比，PKU新〖CM）

生兒血液中的膽固醇、α和β型D吡〖ZH（喃型葡萄糖的含量均顯著降低，與CoQ10和CoQ9降低的結(jié)果一致，均與血液中苯丙氨酸的含量呈反向相關(guān)。

4結(jié)論

測定了新生兒血斑中CoQ10、CoQ9、膽固醇和葡萄糖的含量，結(jié)果〖ZH）表明，與健康的新生兒相比，PKU新生兒出生3天后采集的血斑和出生30天后（正常哺乳的情況下）采集的血斑中上述化合物的含量均顯著降低，與血液中苯丙氨酸的含量升高呈現(xiàn)反向相關(guān)。由于CoQ10在抗脂質(zhì)過氧化作用中起著重要作用，推薦在確診為經(jīng)典型PKU患兒的飲食治療中適當(dāng)提高CoQ10的攝入量。此外，針對(duì)PKU患兒血液中葡萄糖含量降低的情況，建議在經(jīng)典型PKU患兒的飲食治療中適當(dāng)增加葡萄糖的攝入。

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AbstractPhenylketonuria（PKU）isanewborninheritedmetabolicdisordercausedbythegeneticdeficiencyofhepaticenzymephenylalaninehydroxylase（PAH）whichthusinmetabolicdisorderofphenylalanine.Inthisstudy，ultraperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometry（UPLCMS/MS）methodwasusedtoanalyzetheaccurateamountofcoenzymeQ10（CoQ10）andtherelativeamountofCoQ9innewborndriedbloodspot（DBS）collectedfrom5PKUnewborns（3and30daysafterbirth，respectively）and20healthynewborns.ThecontentofCoQ10was（122.1±24.9ng/mL）and（59.0±12.0ng/mL）inDBSfromhealthynewbornsandPKUnewborns，respectively.TherelativecontentsofcholesterolandglucoseintheDBSweredeterminedbygaschromatographymassspectrometry（GCMS）.Incomparisonwithhealthynewborngroup，thelevelsofCoQ10，CoQ9，cholesterolandglucosewereallsignificantlydecreasedinPKUnewborns.TheincreasedcontentofPheandthedecreasedcontentofCoQ10showedsignificantinversecorrelationintheDBSfromPKU.ThisstudyprovidesreferencesfordiettherapyofPKUnewborns.

KeywordsPhenylketonuria；CoenzymeQ10；Cholesterol；Glucose

（Received20September2016；accepted26December2016）

ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina（No.21673219）.