基于銀/鉑納米模擬酶表面修飾的銅離子比色檢測(cè)方法研究

吳亮亮 錢志娟 謝正軍 張瑩瑩 彭池方

摘要 通過(guò)對(duì)銀/鉑納米簇（Ag/Pt NCs）的表面修飾調(diào)控其催化活性，建立了一種高靈敏的比色法檢測(cè)Cu2+。巰基丙酸能夠抑制Ag/Pt NCs的催化活性，而巰基丙酸與Cu2+作用后，將導(dǎo)致上述抑制作用減弱。2基于上述原理，通過(guò)測(cè)量Ag/Pt NCs 催化TMBH2O2反應(yīng)產(chǎn)生的顯色信號(hào)，可以實(shí)現(xiàn)Cu2+的比色檢測(cè)。本方法檢測(cè)Cu2+的線性范圍為10～100 nmol/L，檢出限（3σ）為5.0 nmol/L。將本方法應(yīng)用于實(shí)際水樣中Cu2+的檢測(cè)，結(jié)果表明，本方法具有操作簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)鍵詞 銀鉑納米簇； 比色檢測(cè)； 巰基丙酸； 銅離子

1引 言

銅作為人體必須的微量元素，在人體生命活動(dòng)及器官運(yùn)行中發(fā)揮重要作用[1]。但是過(guò)量的銅會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生潛在的毒性，也會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染[2]。Cu2+在人體內(nèi)過(guò)度累積可能會(huì)參與活性氧物質(zhì)的生成，從而導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生； 同時(shí)，癌癥、糖尿病、心血管疾病及動(dòng)脈硬化、肝硬化肝腹水等也與Cu2+有關(guān)[3]。目前，常用的Cu2+檢測(cè)方法包括原子發(fā)射光譜法（AES）[4]、原子吸收光譜法（AAS）[5]、電感耦合等離子質(zhì)譜法（ICPMS）[6]及電化學(xué)分析法[7]。這些方法雖然靈敏度高，特異性好，但都存在不同的缺點(diǎn)，如耗時(shí)較長(zhǎng)、儀器昂貴、需要專業(yè)操作人員、不便攜帶等，不利于實(shí)際應(yīng)用。 因此，開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單方便、成本低、靈敏度高、特異性好的Cu2+檢測(cè)方法具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

近年來(lái)，基于納米材料的比色傳感方法的發(fā)展為研究者開(kāi)發(fā)重金屬離子的檢測(cè)方法提供了新思路。相對(duì)于電化學(xué)方法[8]及熒光技術(shù)[9，10]而言，基于紫外光譜檢測(cè)及裸眼可見(jiàn)的比色方法更加簡(jiǎn)單易行，受到研究者青睞。 Deng等 ＼[11]利用經(jīng)過(guò)熱處理的裸金納米顆粒， 建立了一種快速檢測(cè)Cu2+的比色檢測(cè)方法； Hua等[12]利用化學(xué)反應(yīng)誘導(dǎo)金納米粒子聚集， 建立了一種比色檢測(cè)水中Cu2+的方法。上述方法主要是通過(guò)調(diào)控納米顆粒表面電荷， 誘導(dǎo)納米粒子表面等離子共振吸收峰的變化實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，具有簡(jiǎn)單易行的優(yōu)點(diǎn)，但由于許多樣品基質(zhì)中含有高濃度的離子，可能帶來(lái)應(yīng)用上的干擾。

研究表明，一些金屬納米粒子，如Fe3O4NPs＼， PtNCs＼， Co3O4NPs等，具有類似天然酶的活性，被稱為“納米模擬酶”[13]。通過(guò)修飾這些納米模擬酶的表面組分，可調(diào)控其催化活性[14]。利用這一特性，研究者構(gòu)建了一些靈敏的比色方法，檢測(cè)物包括重金屬[15，16]、三聚氰胺[17]及L半胱氨酸[18]。在這些模擬酶中，鉑雜化納米材料憑借其較高的催化活性， 已被廣泛應(yīng)用于生物傳感器。如Lin等[18]通過(guò)將鉑納米材料與氧化石墨烯結(jié)合， 實(shí)現(xiàn)了對(duì)半胱氨酸的快速檢測(cè)； Gao等[19]利用Au@PtNHs實(shí)現(xiàn)了擴(kuò)增比色免疫分析。Zheng等[20]發(fā)現(xiàn)銀鉑雜合納米簇（Ag/Pt NCs）相對(duì)于單一組份納米簇而言，具有更高的催化活性。本課題組也利用Ag/Pt NCs的高催化活性，基于半胱氨酸和Hg2+對(duì)其催化活性的抑制作用，構(gòu)建了高靈敏的比色檢測(cè)方法[21，22]。

有文獻(xiàn)報(bào)道，含巰基化合物如L半胱氨酸，能夠通過(guò)巰基與鉑納米顆粒表面結(jié)合，形成〖JG（Pt〖ZJYS〖JG）鍵，抑制鉑納米模擬酶的催化活性[23，24]。另外，Cu2+可以催化巰基化合物的氧化形成二硫鍵[25]。基于上述兩種作用，本研究利用巰基丙酸（MPA）抑制DNA銀鉑納米簇（Ag/Pt NCs）的催化活性； 同時(shí)利用Cu2+與MPA反應(yīng)，調(diào)控MPA對(duì)Ag/Pt NCs催化活性的抑制作用，實(shí)現(xiàn)了Cu2+的比色檢測(cè)。本方法具有操作簡(jiǎn)單、成本低、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

〖HS1*5/62實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

Multiskan MK3 酶標(biāo)儀（美國(guó) Thermo 公司）； QL901 漩渦混勻器（江蘇海門其林醫(yī)用儀器廠）； VS100C恒溫混勻儀（無(wú)錫沃信儀器有限公司）； UV2802pcs紫外分光光度計(jì)（優(yōu)尼柯公司）； JEOL2100透射電鏡（日本電子株式會(huì)式）； EMXplus10/12電子自旋共振波譜儀（德國(guó)布魯克科技有限公司）。

AgNO3（美國(guó)Sigma公司，純度99%）； 四氯鉑酸鉀（瑪雅試劑）； 巰基丙酸（MPA）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、NaBH4（阿拉丁試劑）； ssDNA（生工生物工程上海股份有限公司）； 金屬離子溶液（Hg2+， Mn2+， Sr2+， Zn2+， Fe3+， Co2+， Cr2+， Ag+， Ni2+， Cd2+， Al3+， Ba2+和Pb2+均為1 μg/mL，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心）； 實(shí)驗(yàn)用水為Millipore超純水（18.2 MΩ cm）； 其余試劑均為分析純。

2.2Ag/Pt NCs的合成

參照文獻(xiàn)＼[21＼]的方法合成Ag/Pt NCs，利用氧化還原法合成平均粒徑為4 nm的Ag/Pt NCs：將50 μL 150 μmol/L AgNO3溶液及120 μL 125 μmol/L K2PtCL4溶液與300 μL 2 μmol/L ssDNA溶液（以10 mmol/L， pH 7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋）振蕩混勻，4℃避光反應(yīng)30 min后，加40 μL 5 mmol/L NaBH4 溶液（冰水稀釋），快速混勻，然后置于恒溫振蕩器上， 37℃，1500 r/min孵育3 h， 得到平均粒徑為4 nm的2 μmol/L Ag/Pt NCs溶液，于4℃ 避光保存，一個(gè)月內(nèi)活性不會(huì)發(fā)生明顯變化。

2.3Cu2+ 的檢測(cè)

用10 mmol/L Tris緩沖鹽（pH 6.0）， 稀釋巰基丙酸溶液至20 μmol/L。將10 μL MPA溶液和90 μL系列濃度的Cu2+溶液（0～200 nmol/L） 依次加入到微孔板中，充分混合，于室溫孵育20 min； 將制備的Ag/Pt NCs溶液稀釋4倍，取10 μL 加入上述混合溶液中，充分混合，于室溫孵育15 min； 最終向孵育好的混合溶液中依次加入30 μL檸檬酸緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 4.0）、40 μL TMB溶液（3 mmol/L）、20 μL H2O2溶液（1 mol/L），振蕩混合均勻，反應(yīng)15 min， 測(cè)定652 nm處的吸光值，以吸光值對(duì)Cu2+的濃度繪制校正曲線。

2.4樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

采集本實(shí)驗(yàn)室的自來(lái)水、湖水及河水作為樣品， 樣品分別經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾。參照2.3節(jié)的方法測(cè)量， 并與石墨爐原子吸收光度法（GFAAS）測(cè)定結(jié)果比較。

3結(jié)果與討論

3.1Ag/Pt NCs的表征

3.1.1透射電鏡（TEM）和X射線電子能譜（EDX）表征透射電鏡圖如圖1所示， Ag/Pt NCs的粒徑約為5 nm（圖1A）； 向Ag/Pt NCs溶液中加入MPA后，Ag/Pt NCs呈現(xiàn)一定程度的聚集（圖1B）； 加入Cu2+和MPA的混合液時(shí)， Ag/Pt NCs并沒(méi)有明顯變化（圖1C）。以上結(jié)果表明，Cu2+與MPA發(fā)生了反應(yīng)，導(dǎo)致MPA對(duì)Ag/Pt NCs的結(jié)合作用減弱。由EDX譜圖（圖2）也可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)向Ag/Pt NCs溶液中加入MPA后，Ag/Pt NCs表面出現(xiàn)S元素，說(shuō)明MPA結(jié)合在Ag/Pt NCs表面。

3.1.2吸收光譜分析由吸收光譜（圖3）可見(jiàn)，Ag/Pt NCs能催化TMBH2O2氧化還原反應(yīng)，在652 nm處產(chǎn)生較強(qiáng)的吸收峰（曲線a），這說(shuō)明Ag/Pt NCs具有過(guò)氧化物酶活性。然而，當(dāng)與MPA孵育后，Ag/Pt NCs催化TMBH2O2時(shí)的吸收峰強(qiáng)度顯著下降（曲線c）。當(dāng)與MPA和Cu2+的混合液孵育后，上述催化反應(yīng)的吸收峰的強(qiáng)度顯著回升（曲線b）。上述結(jié)果說(shuō)明，MPA作用于Ag/Pt NCs， 使其酶活性降低，而Cu2+與MPA發(fā)生了反應(yīng)，降低了MPA對(duì)Ag/Pt NCs的模擬酶活性的抑制。

3.1.3電子順磁共振（EPR）表征電子順磁共振分析表明（圖4），DMPO能夠捕獲H2O2經(jīng)紫外燈照射產(chǎn)生的·〖KG-3OH，形成DMPO·〖KG-3OH，產(chǎn)生較強(qiáng)的EPR信號(hào)（曲線b）。Ag/Pt NCs與DMPO競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合·〖KG-3OH[16]，導(dǎo)致DMPO·〖KG-3OH的信號(hào)變?nèi)酰ㄇ€c）。當(dāng)Ag/Pt NCs與MPA作用后，再與DMPO競(jìng)爭(zhēng)·〖KG-3OH時(shí)， EPR信

而MPA與Cu2+反應(yīng)后，再與Ag/Pt NCs孵育，將使得結(jié)合在Ag/Pt NCs表面的MPA減少，從而減弱了上述抑制作用，因此， EPR圖譜上顯現(xiàn)出較弱的DMPO·〖KG-3OH信號(hào)（曲線e）。

3.2Ag/Pt NCs比色檢測(cè)Cu2+反應(yīng)條件的影響

3.2.1緩沖溶液的pH值和鹽濃度的影響考察緩沖液pH值分別為3.0， 4.0， 5.0， 6.0， 7.0， 8.0和9.0時(shí)對(duì)Cu2+的分析響應(yīng)的影響。 結(jié)果表明（圖5），當(dāng)緩沖溶液的pH=6.0時(shí)，100 nmol/L Cu2+產(chǎn)生的吸光度差比值（（A0-A）/A0）最大，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用pH=6.0的緩沖溶液。

將濃度分別為1.0， 5.0， 10， 50和100 mmol/L的Tris緩沖溶液用于上述反應(yīng)對(duì)Cu2+的響應(yīng)分析。 結(jié)果表明，當(dāng)緩沖溶液濃度低于10 mmol/L時(shí)， Cu2+產(chǎn)生的吸光度差比值變化較大，高于10 mmol/L時(shí)， 吸光度差比值明顯下降。故選擇10 mmol/L Tris緩沖溶液用于Cu2+檢測(cè)。

3.2.2MPA濃度的影響考察濃度分別為1.0， 5.0， 10， 20和50 μmol/L的MPA溶液對(duì)Cu2+的響應(yīng)2的影響。結(jié)果表明，當(dāng)MPA溶液的濃度為20 μmol/L時(shí)，100 nmol/L Cu2+產(chǎn)生吸光度差比值明顯高于其它濃度。故選用20 μmol/L MPA用于Cu2+檢測(cè)。

3.2.3孵育時(shí)間的影響將100 nmol/L Cu2+與MPA分別孵育10， 20， 30， 40， 50和60 min。結(jié)果表明，當(dāng)100 nmol/L Cu2+與MPA孵育10 min時(shí)，即可產(chǎn)生較高的吸光度差比值。孵育時(shí)間延長(zhǎng)到20 min時(shí)，

所得吸光度差比值僅略有升高。孵育30～60 min，所得吸光度差比值緩慢下降。故選擇將Cu2+與MPA孵育10 min用于Cu2+檢測(cè)。

3.3Cu2+檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

在上述優(yōu)化反應(yīng)條件下，應(yīng)用Ag/Pt NCs檢測(cè)Cu2+，以Cu2+

濃度作為橫坐標(biāo)，以吸光值作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖6所示，Cu2+濃度在10～100 nmol/L范圍內(nèi)與吸光值呈良好的線性關(guān)系（R2=0.997）， 方法的檢出限為5.0 nmol/L （3σ）。 與其它納米比色檢測(cè)方法相比，本方法在靈敏度和特異性方面具有優(yōu)勢(shì)（及表1）。

3.4特異性分析

選擇常見(jiàn)金屬離子Hg2+， Mn2+， Sr2+， Zn2+， Fe3+， Co2+， Cr2+， Ag+， Ni2+， Cd2+， Al3+， Ba2+和Pb2+， 考察本方法檢測(cè)Cu2+的特異性。

上述金屬離子的濃度均為10 μmol/L時(shí)，對(duì)本方法檢測(cè)Cu2+（100 nmol/L）的影響如圖7所示，高濃度的其它金屬離子（10 μmol/L）與低濃度的Cu2+（100 nmol/L）相比，響應(yīng)顯著更低。因此，將Ag/Pt NCs模擬酶應(yīng)用于Cu2+比色檢測(cè)具有良好的特異性。

3.5樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

取實(shí)驗(yàn)室自來(lái)水、蠡湖湖水（無(wú)錫）及河水（校內(nèi)），分別經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，采用上述比色方法檢測(cè)（平行3次），結(jié)果表明，上述樣品中Cu2+濃度分別為（29.6±1.1） nmol/L，（48.5±1.6） nmol/L和（76.4±3.7） nmol/L。同時(shí)，采用石墨爐原子吸收光度法（GFAAS）檢測(cè)上述樣品（n=3），其中Cu2+的濃度分別為（30.6±0.5） nmol/L，（47.0±0.6） nmol/L和（78.5 ±2.2） nmol/L。本方法與GFAAS測(cè)試結(jié)果的偏差小于5%。

上述結(jié)果表明，本方法檢測(cè)Cu2+具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性好、成本低等優(yōu)點(diǎn)，有望應(yīng)用于環(huán)境和食品等領(lǐng)域中的Cu2+的檢測(cè)。

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AbstractA sensitive colorimetric method for the detection of copper ions （Cu2+） was developed based on the surface modification of silver/platinum nanoclusters （Ag/Pt NCs） and regulation of peroxidaselike activity. It was found that 3mercaptopropionic acid （MPA） could inhibit the catalytic ability of Ag/Pt NCs； however， it lost the inhibition toward catalytic ability of Ag/Pt NCs after oxidized by oxygen through the catalysis of Cu2+. On the basis of this， a colorimetric method was developed for the detection of Cu2+ through measuring the colorimetric signal variation of the TMBH2O2 reaction. This method exhibited high sensitivity and selectivity toward Cu2+ over a panel of other metal ions. The linear range was 10-100 nmol/L and the detection limit was 5.0 nmol/L （3σ）. The above method was also applied to detect real water samples and spiked samples， and the results demonstrated that this method was simple with low cost.

KeywordsSilver/platinum nanoclusters； Colorimetric detection； 3Mercaptopropionic acid； Copper ions

（Received 21 September 2016； accepted 21 November 2016）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.31371767） and the Key Projects in the National Science & Technology Pillar Program during the Twelfth Fiveyear Plan Period （No.2015BAD17B02）.