基于光波導微環(huán)諧振器的lgG非標記檢測微流體分析系統(tǒng)

郭盈盈 吳尚犬 ??金里 王皖君 張青川

摘要 設計開發(fā)了與微環(huán)諧振器集成的微流體通道系統(tǒng)，不僅避免了敞開環(huán)境中由于液體揮發(fā)造成的微環(huán)諧振器表面鹽分的聚結，屏蔽空氣中的各種雜質(zhì)，而且只需要30 μL反應溶液，減少了藥品用量，大大節(jié)約了實驗成本。同時，采用絕緣體硅（SOI）材料，利用光刻技術設計和制作了波導寬度為450 nm，半徑為5 μm，品質(zhì)因子（Q值）為20000的光波導微環(huán)諧振器。集成的微環(huán)諧振器傳感系統(tǒng)具有低成本、免標記、能實時監(jiān)測生化反應過程等特點。以不同濃度的酒精溶液為測試對象，研究了微環(huán)諧振器對均質(zhì)溶液的傳感性能，傳感芯片對溶液折射率的探測靈敏度為76.09 nm/RIU，探測極限為5.25×10Symbolm@@ 4 RIU，驗證了此微環(huán)諧振器對均質(zhì)溶液進行濃度檢測的可行性。利用此傳感系統(tǒng)對人免疫球蛋白IgG進行了非標記免疫檢測。在測試中，采用微流體通道系統(tǒng)將相應抗體修飾到微環(huán)諧振器表面，利用光譜儀對修飾過程以及抗原抗體特異性結合過程中的共振譜線漂移情況進行了監(jiān)測。結果表明，光波導微環(huán)諧振器可以對生物分子進行實時監(jiān)測。

關鍵詞 微環(huán)諧振器； 生物傳感器； 微流體通道； 倏逝波； 免疫球蛋白G

1引 言

生化傳感器廣泛應用于食品安全、藥物開發(fā)、臨床診斷、環(huán)境監(jiān)控等領域。根據(jù)輸出的物理信號不同可分為光學生物傳感器、電化學生物傳感器[1]、機械生物傳感器（微懸臂梁[2～4]等）及熱生物傳感器等。與其它類型的生物傳感器相比，基于平面光波導的光學生物傳感器具有無需標記、成本低、可實時監(jiān)測、易集成、快速、穩(wěn)定[5]等優(yōu)點，在藥物篩選、生物制藥、環(huán)境監(jiān)測和臨床診斷領域得到廣泛應用[6]，不僅可與微流體通道系統(tǒng)進行集成，實時監(jiān)測波導微環(huán)表面的物質(zhì)變化，而且日漸成熟的微電子工藝進一步降低了微環(huán)諧振器芯片的加工成本，可實現(xiàn)大批量生產(chǎn)。光波導微環(huán)諧振器傳感技術在生化測試領域顯示出廣闊的應用前景[7～9]。

光波導微環(huán)諧振器利用光波的倏逝波進行探測。光在介質(zhì)中傳播時，會在兩種不同介質(zhì)的分界面上產(chǎn)生一種稱為倏逝波[10]的電磁波，其幅值會隨著與分界面相垂直的深度的增大而呈指數(shù)形式衰減，而且這種衰減可以通過輸出光的共振譜線漂移反映出來。當在微環(huán)中傳輸?shù)墓鉂M足公式（1）時，光會發(fā)生共振?；诳乖贵w特異性結合的光波導微環(huán)免疫生物傳感器，是在微環(huán)的表面固定一層抗體。當含有目標分子（特異性抗原）的溶液流過微環(huán)表面時，固定抗體分子與目標分子發(fā)生特異性免疫反應，形成抗原抗體復合物，引起倏逝波變化，波導有效折射率改變，最終在輸出端共振波長發(fā)生漂移。共振波長由公式（1）給出，通過檢測這些性質(zhì)的改變，就可以獲得待測物的變化信息，實現(xiàn)系統(tǒng)傳感。所以，可以通過觀察芯片輸出譜線的變化得到待測物的變化。

λ=2πRneff/m〖FH（1）

其中， R為微環(huán)的半徑，neff為波導微環(huán)的有效折射率， m為共振階數(shù)（m=1， 2， 3…），λ為微環(huán)的共振波長。人免疫球蛋白G（IgG）是血清中含量最高的免疫球蛋白，在機體免疫應答中起著重要作用[11]。人表皮生長因子受體2 （Her2）是重要的乳腺癌預后判斷因子[12]。目前，廣泛應于免疫檢測抗原或抗體的方法有酶聯(lián)免疫法、蛋白質(zhì)芯片法和熒光素標記法等。 酶聯(lián)免疫法檢出限較低，但需要對底物進行標記，且底物存在污染，所需樣品量大，成本高；蛋白質(zhì)芯片法與酶聯(lián)免疫法的檢出限相當，但需要利用多個熒光標記物進行標記，而且檢測儀器昂貴，成本較高。本研究設計開發(fā)了與微環(huán)諧振器集成的微流體通道系統(tǒng)，以SiO2為襯底，采用光刻技術，設計和制作了基于Si波導結構的微環(huán)諧振器。以不同濃度的酒精溶液為測試對象，研究了微環(huán)諧振器對均質(zhì)溶液的傳感性能，并且利用此微環(huán)諧振器對人IgG和Her2進行實時非標記免疫檢測。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

M5000 CCD光譜儀（北京聚光盈安科技有限公司）；MAC50DMCFENN溫控器（日本Shimax公司）；調(diào)諧光源（瀚宇科技（香港）有限公司）；BT3002J/YZII1蠕動泵（保定蘭格公司）。

人IgG、羊抗人IgG（antiIgG）（上海生工生物工程有限公司）；人Her2蛋白、Her2兔源單克隆抗體（北京義翹神州生物技術有限公司）；牛血清白蛋白（BSA）、3氨丙基三乙氧基硅烷 （（3Aminopropyl）triethoxysilane，APTES，美國Sigma公司）；磷酸鹽緩沖溶液 （PBS，4.0 g NaCl+0.1 g Na2HPO4+1.48 g KH2PO4·H2O+500 mL去離子水，pH 7.5）；98% H2SO4，30% H2O2，25%戊二醛等其它均為分析純。實驗用水為去離子水。

2.2光波導的制備

制作的光波導微環(huán)諧振器如圖1A所示，圓形部分為微環(huán)波導，微環(huán)下方為直波導結構，插圖為直波導和微環(huán)波導耦合部分的放大圖。光波導的基本結構是絕緣體硅結構（SOI），其橫截面示意圖如圖1B所示，由兩層原料組成，芯層材料為Si，包層材料為SiO2，折射率分別為3.45和1.44，由于Si和SiO2之間的折射率差（Δn=2.01）較大，Si波導對光場有很大的限制作用。芯層波導厚度為220 nm，寬度為450 nm，包層厚度為2 μm，微環(huán)半徑為5 μm，微環(huán)與直波導之間的間距為160 nm。

工藝流程如圖1C所示，采用光刻技術加工制作[13]，首先在芯片表面旋涂一層280～320 nm的光刻膠，90℃烘干90 s。電子束曝光之后，顯影2.5 min， 100℃烘干5 min，然后在光刻膠的保護下進行等離子干法刻蝕?？涛g后，將芯片浸在H2SO4H2O2（1〖KG-3∶〖KG-51， V/V）溶液中10 min，得到實驗所需的光波導芯片。

實驗裝置包括微流體通道系統(tǒng)和光學控制系統(tǒng)兩部分[14]。待測液體由蠕動泵控制，經(jīng)輸入導管進入反應腔，再經(jīng)輸出導管流入廢液瓶。光由可調(diào)諧光源發(fā)出后，經(jīng)由輸入光纖進入微環(huán)諧振腔，經(jīng)過一系列的耦合振蕩，由輸出光纖進入光譜儀。實驗過程中，將微流體通道系統(tǒng)置于加載有溫控臺的三維可調(diào)節(jié)高精度光學測試平臺上，可以精確調(diào)節(jié)芯片所在位置，使得輸入和輸出光纖精確的與微環(huán)諧振腔對應，提高實驗結果的準確度和真實度。

由于微環(huán)諧振器具有很高的靈敏度，其輸出譜線很容易受到外界因素如振動、溫度、灰塵和雜質(zhì)的影響。實驗設計了如圖2所示的微流體通道系統(tǒng)。此系統(tǒng)避免了敞開環(huán)境中由于液體揮發(fā)造成的微環(huán)諧振器芯片表面鹽分的聚結，屏蔽空氣中的各種雜質(zhì)，而且只需要30 μL反應溶液，大大節(jié)約了實驗成本。經(jīng)實驗考察，選擇了容易加工的亞克力材料和具有生物相容性的聚二甲基硅氧烷（PDMS）[15，16]。首先將芯片置于作為襯底的模塊上，并將精確加工配合的PDMS置于其上，用另一個模塊進行密封，同時，在蓋子中留有適合待測物進出的小孔，形成待測物通道。如圖2所示，模具只封裝了芯片的表面，不僅保護了微環(huán)表面，露出了與光纖耦合的輸入輸出波導，而且形成了供待測物進出的通道，使待測物能夠浸潤并吸附在微環(huán)表面，從而影響芯片的輸出譜線。

2.3IgG抗體修飾及檢測

將刻有微環(huán)諧振器的芯片置于“Piranha dip”（H2O2H2SO4，1〖KG-3∶〖KG-53， V/V）溶液中超聲20 min，在芯片表面修飾一層羥基組（

Symbolm@@ OH）。取出后用大量去離子水沖洗，N2吹干，備用。將芯片置于2.5%（V/V）APTES（H2OEthanol， 1〖KG-3∶〖KG-5100，V/V）中孵化2 h，用大量去離子水沖洗，N2吹干；然后將其浸泡5% （w/V）戊二醛溶液1 h，用大量去離子水沖洗，N2吹干。將芯片固定到微流體通道中，反應池的溫度控制在（25±0.01）℃，室溫控制在（27±0.2）℃，流動泵以恒定速率4.2 mL/h通入200 μg/mL AntiIgG中10 min，靜置1.5 h，得到修飾有antiIgG的芯片；以PBS流動清洗芯片10 min；通入5%（w/V）BSA溶液，靜置30 min，以PBS流動清洗芯片10 min。最后通入一定濃度的IgG溶液，利用微環(huán)生物傳感系統(tǒng)進行實時監(jiān)測共振譜線的漂移。圖3為微環(huán)諧振器表面活化和抗體固定的示意圖。

3結果與討論

3.1微流體通道系統(tǒng)和測試溫度對微環(huán)諧振器性能的影響

在測試器件的生物傳感特性之前，首先使用同一個芯片分別在敞開的液體環(huán)境和微流體通道系統(tǒng)中對共振譜線漂移進行了實時檢測，如圖4A所示，所用緩沖液為PBS溶液，在未加微流體通道系統(tǒng)敞開環(huán)境中，共振譜線在10 min后，約向短波長方向漂移了110 pm。檢測結束后，芯片表面析出大量鹽分，可能是水分揮發(fā)導致，鹽分析出的過程導致微環(huán)表面的有效折射率不斷變化，從而導致共振波長的持續(xù)漂移；同時，液滴表面張力使得光纖無法精確地對準輸入輸出光波導，導致無法獲得有效的輸入輸出信號。在微流體通道系統(tǒng)中，不斷流動的液體環(huán)境和小尺寸的揮發(fā)面積使微環(huán)一直處于穩(wěn)定的PBS液體環(huán)境中，譜線基本處于平穩(wěn)狀態(tài)，偏移量為±4 pm。圖4B為微流體通道系統(tǒng)在無水乙醇環(huán)境中，芯片在未加溫控裝置的輸出譜線漂移與恒溫25 ℃的漂移比較。未加溫控裝置時，微環(huán)的外界環(huán)境隨著室溫不斷改變，譜線在30 min后，向長波長方向偏移約30 pm；恒溫25℃時，譜線基本處于平穩(wěn)狀態(tài)，偏移量為±4 pm。上述結果表明， 所構建的微流體通道系統(tǒng)的穩(wěn)定性良好。

3.2乙醇濃度對微環(huán)諧振器性能的影響

如圖5所示，隨著乙醇溶液濃度提高，波長均向長波方向漂移。由圖5B可知，相鄰濃度乙醇溶液的諧振波長差約為0.4 nm，而且不同濃度乙醇溶液的折射率與芯片的輸出諧振波長漂移量有較好的線性對應關系，與微環(huán)的一維有效折射率算法理論模型相符[17]。由斜率可知，折射率靈敏度為76.09 nm/RIU。實驗所用的光譜儀的波長分辨為4 pm，可得微環(huán)的探測極限為5.25×10Symbolm@@ 4 RIU。因此，此微環(huán)諧振器可以對均質(zhì)溶液進行濃度表征。

3.3微環(huán)諧振器對生物分子的定量檢測

對實驗過程進行實時監(jiān)測的曲線如圖6A，每隔30 s取一個點，首先通入PBS，共振波長基本不變；通入antiIgG，共振譜線發(fā)生漂移，在1.5 h后達到穩(wěn)定，漂移了408 pm， 說明抗體已經(jīng)穩(wěn)定地修飾在微環(huán)上，并在該抗體濃度下達到飽和狀態(tài)。通入PBS，沖洗掉未結合在微環(huán)上的抗體，曲線漂移量并沒有發(fā)生明顯改變。而按照圖3中的修飾步驟在完全相同條件下采用孔板修飾的芯片，共振譜線只漂移128 pm，可能是由于孔板修飾完成后使用PBS進行手動沖洗，可能導致一些已經(jīng)修飾在微環(huán)上的antiIgG被沖洗掉。

通入BSA進行封閉，并用PBS沖洗，曲線漂移132 pm；依次通入1和5 μg/mL IgG，在波導表面形成抗原抗體復合物，引起波導表面倏逝波變化，波導有效折射率也發(fā)生改變，導致輸出端共振波長發(fā)生漂移。當微環(huán)表面抗原抗體的結合與微流體通道中抗原達到動態(tài)平衡時，

微環(huán)的譜線漂移也達到平衡，曲線分別漂移了44和90 pm，而分別通入PBS，曲線未發(fā)生明顯漂移，說明IgG與固定抗體間發(fā)生特異性結合。圖6B為0.5， 2.5， 5.0和10.0 μg/mL IgG分別與固定的antiIgG作用時微環(huán)的共振譜線漂移曲線。不同濃度的IgG導致微環(huán)產(chǎn)生的共振譜線漂移量不同，漂移量隨著IgG濃度的增加而增大，最終漂移量分別為12，52，64和88 pm。上述實驗驗證了波導微環(huán)諧振器用于免標記生物傳感的可行性與有效性，表明此微環(huán)生物傳感器可以對生物分子進行定量檢測。

采用同樣原理，利用微環(huán)諧振器對Her2溶液進行檢測，結果如圖7所示。在實驗中，前20 min通入PBS溶液時，曲線處于平穩(wěn)狀態(tài)；20 min后通入5 μg/mL Her2抗原溶液，曲線偏移約130 pm，說明抗原抗體結合，導致微環(huán)諧振腔覆蓋層折射率發(fā)生改變，從而導致共振譜線發(fā)生漂移。將修飾有相同抗體的芯片浸沒在不含Her2抗原的PBS溶液中，共振譜線沒有發(fā)生明顯漂移，說明Her2抗原與固定的Her2抗體可以發(fā)生特異性結合。

4結 論

本研究構建與微環(huán)諧振器集成的微流體通道系統(tǒng)，只需要30 μL反應溶液，大大降低了實驗成本。同時，以不同濃度的乙醇為測試對象，研究了微環(huán)諧振器對均質(zhì)溶液的傳感性能，此傳感芯片的檢測靈敏度為76.09 nm/RIU，檢出限為525×10Symbolm@@ 4 RIU。利用此傳感方法對IgG和Her2進行實時免疫監(jiān)測，可以檢測500 ng/mL IgG標準樣品。本方法具有小面積、易集成、靈敏度高等優(yōu)點。本研究結果表明，光波導微環(huán)諧振器可以實現(xiàn)生物傳感，對生物分子進行實時監(jiān)測。

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AbstractThe microfluidic channels integrated with microring resonator were designed. The salt coalescence on chip surface caused by liquid volatilization in open environment was avoided and only 30 μL of reaction solution was consumed. These channels significantly reduced the experiment cost. The design， fabrication and characterization of a highly sensitive and labelfree silicononinsulator （SOI） microring optical resonator integrated with the microfluidic channels were demonstrated. The radius of the microring was 5 μm and the straight waveguide with a width of 450 nm was employed in the microring resonator. The microring resonator device had many advantages such as high sensitivity， labelfree and realtime detection. Using different concentrations of ethanol solution with known refractive indices， the refractive index detection sensitivity was 76.09 nm/RIU and the volume refractive index detection limit was 5.25×10Symbolm@@ 4 RIU. We also demonstrated the labelfree quantitative specific detections of human immunoglobulin G （IgG） solutions using an antibodymodified microring resonator by measuring the resonance wavelength shift resulting from refraction index changes causing by the immobilization of antibodies and specific recognition between antibodies and antigens， respectively. The results showed that the microring optical resonator could realtime monitor the reaction between biological molecules， the resonator could be used in the quantitative detection and biological sensing.

Keywords2Silicon microring optical resonator； Biosensor； Microfluidics； Evanescent wave； Immunoglobulin G

（Received 2 September 2016； accepted 15 February 2017）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 1162780010， 11502265， 11472266）