Phenylphthalazines化合物PU1424的利尿作用分析

郭 珮,冉建華,李 靜,何 菲,樊春華,田 寬

(重慶醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織細胞工程與干細胞研究室；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室；3.神經(jīng)科學(xué)研究中心,重慶 400016)

Phenylphthalazines化合物PU1424的利尿作用分析

郭 珮1,2,冉建華2,3,李 靜1,何 菲2,3,樊春華2,3,田 寬2,3

(重慶醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織細胞工程與干細胞研究室；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室；3.神經(jīng)科學(xué)研究中心,重慶 400016)

目的 檢測Phenylphthalazines化合物PU1424對大鼠的利尿作用，以及利尿后對電解質(zhì)平衡、糖脂代謝及肝臟、腎臟功能的影響。方法 以♂ SD大鼠為研究對象，隨機分為溶劑對照組、PU1424組和氫氯噻嗪(hydrochlorothiazide，HCTZ)組，連續(xù)給藥后每6 h收集尿液，末次給藥后取血。采用冰點滲透儀檢測大鼠尿液的滲透壓；尿素檢測試劑盒檢測尿素水平；全自動生化儀分析尿液及血漿的離子水平、血糖、血脂和肝腎功能指標(biāo)。結(jié)果 PU1424和HCTZ分別增加大鼠尿量為對照組的1.52倍和1.78倍，降低尿滲透壓為對照組的61.5%和50.4%，降低尿尿素濃度為對照組的57.1%和56.8%，飲水量增加為對照組的1.42倍和1.56倍。PU1424和HCTZ的利尿作用降低了尿液中的電解質(zhì)水平，但對血漿電解質(zhì)平衡無明顯影響。PU1424組大鼠的血糖、血脂水平與溶劑對照組相比無明顯差異，而HCTZ升高了血糖和總膽固醇。PU1424和HCTZ對大鼠血清中尿素、肌酐水平無明顯影響，PU1424對大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶/谷草轉(zhuǎn)氨酶(谷丙/谷草)、堿性磷酸酶和總蛋白、白蛋白水平無明顯影響，HCTZ可升高血清谷丙/谷草比值。結(jié)論 新型利尿藥候選化合物PU1424利尿作用明顯，且不影響機體的電解質(zhì)平衡、血糖血脂水平和肝臟、腎臟功能。

利尿藥；小分子抑制劑；Phenylphthalazines；PU1424；尿素通道；電解質(zhì)平衡

利尿藥(diuretics)是臨床常用于治療心、腎功能衰竭所致的水腫以及高血壓等非水腫性疾病的藥物，主要通過增加腎臟對電解質(zhì)及水的排出發(fā)揮作用[1-2]。目前的利尿藥根據(jù)作用部位和效能分為三類：高效能和中效能利尿藥分別通過特異性抑制髓袢升支的Na+/K+/2Cl-共同轉(zhuǎn)運體和遠曲小管的Na+/Cl-共同轉(zhuǎn)運體，選擇性抑制NaCl的重吸收、降低腎的尿濃縮功能達到利尿的效果，但存在引起電解質(zhì)紊亂的風(fēng)險。低效能利尿藥作用于集合管和遠曲小管，通過拮抗醛固酮起到排鈉保鉀的利尿作用，長期使用可引起高血鉀的不良反應(yīng)[3-4]。鑒于臨床對利尿藥的廣泛需求，開發(fā)不影響電解質(zhì)代謝的新型利尿藥具有重要意義。近年來，隨著人們對尿素通道蛋白(urea transporters, UTs)家族在尿濃縮機制中作用及機制認識的不斷深入，為以尿素通道蛋白為靶點的新型利尿藥物開發(fā)指引了新的方向[5-7]。本課題組前期通過體外模型篩選出PU1424，具有特異、高效抑制尿素通道蛋白轉(zhuǎn)運尿素的作用，且無明顯的細胞毒性[8]。因此，本研究通過動物實驗驗證其在體內(nèi)的利尿效果，以及對機體代謝和肝臟、腎臟功能的影響，為利尿藥物的研發(fā)提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥品和主要試劑 PU1424來自美國圣地亞哥ChemDiv公司；氫氯噻嗪(H2910，Sigma)；2-羥丙基-β-環(huán)糊精(128446, Sigma)； 尿素檢測試劑盒(Roche，QuantichromTMurea assay kit-DIUR-500)；全波長紫外分光光度儀(BIOTEK, MQX200)。

1.2 主要儀器 全自動化生化分析儀(AU-2700，OLYMPUS)；電子天平(Santorius)，超低溫冰箱(Thermo Scientific，700)；低溫離心機(Eppendorf)；冰點滲透壓儀(Gonotec)；標(biāo)準(zhǔn)外科手術(shù)器械(國產(chǎn))等。

2 方法

2.1 實驗動物分組及給藥 實驗動物采用♂ SD大鼠，(200±50) g，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實驗中心，實驗嚴(yán)格按照動物倫理學(xué)委員會要求執(zhí)行。

8～12周齡♂ SD大鼠隨機分為3組：2-羥丙基-β-環(huán)糊精(2-HP-β-CD)溶劑對照組、PU1424組和氫氯噻嗪(hydrochlorothiazide，HCTZ)組為陽性對照，每組6只，體質(zhì)量(200±50)g。大鼠分組后分別于代謝籠中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，保持室溫24℃～28℃，相對濕度50%～70%，自由飲食、飲水。

PU1424用濃度為40%(103g·L-1)的2-羥丙基-β-環(huán)糊精(2-HP-β-CD)水溶液制成混懸液。按照參考文獻方法給藥[7-8]，d1 7:00 A.M.，腹部按摩排空大鼠膀胱，各組大鼠背部皮下分別注射100 mg·kg-1的PU1424，同體積的HCTZ和溶劑對照，然后在24:00 P.M.和d 2 6 ∶00 A.M.、12 ∶00 A.M.、18 ∶00 P.M.分別給各組大鼠注射50 mg·kg-1的PU1424、同體積的HCTZ和溶劑對照。注射后每6 h收集尿液至相應(yīng)EP管，且計算出在此期間的大鼠飲水量。末次給藥3 h后，戊巴比妥鈉麻醉大鼠(40 mg·kg-1)，心臟穿刺取血，全血室溫靜置30 min，5 000 r·min-1離心15 min，取上清備用。

2.2 檢測指標(biāo)及方法

2.2.1 尿液稱重及濃度檢測 將收集的尿液按1 g=1 mL的公式進行重量和體積折算。尿素試劑盒檢測尿液、血清中尿素濃度。將冰箱中取出的試劑盒平衡至室溫，臨用前20 min內(nèi)準(zhǔn)備足量的A、B等量混合工作液,按每孔100 μL用量計算。尿素標(biāo)準(zhǔn)品梯度：取6個0.2 mL EP管，尿素標(biāo)準(zhǔn)品(50 mg·dL-1)各管分別加入：① 尿素標(biāo)準(zhǔn)液10 μL；② 尿素標(biāo)準(zhǔn)液8 μL+ddH2O 2 μL；③ 尿素標(biāo)準(zhǔn)液6 μL+ddH2O 4 μL；④ 尿素標(biāo)準(zhǔn)液4 μL+ddH2O 6 μL；⑤ 尿素標(biāo)準(zhǔn)液2 μL+ddH2O 8 μL；⑥ ddH2O 10 μL。待測樣本：各管分別取標(biāo)準(zhǔn)液5 μL，樣本5 μL。尿素標(biāo)準(zhǔn)品梯度與待測樣本依次加入潔凈的96孔板，各孔加入100 μL工作液(50 μL A液+50 μL B液)。室溫孵育20 min，用全波長紫外分光光度儀于520 nm處測出OD值。根據(jù)尿素標(biāo)準(zhǔn)品梯度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和前面的蛋白定量結(jié)果，換算出尿液、血清中的尿素濃度。

2.2.2 滲透壓檢測 用冰點滲透壓儀檢測尿液和血清的滲透壓值。

2.2.3 生物化學(xué)指標(biāo)檢測 全自動生化分析儀檢測血清指標(biāo)：血脂指標(biāo)包括甘油三酯(TG)、膽固醇(T-CHO)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)；血糖濃度；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT/ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT/AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、血清Na+、K+、Cl-、肌酐(Cr)、尿酸(UA)水平；以及尿液Na+、K+、Cl-、Cr、UA水平。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 本實驗采用SPSS22.0版本統(tǒng)計軟件包處理。進行獨立樣本t檢驗，相關(guān)分析檢驗水平設(shè)定P<0.05。

3 結(jié)果

3.1 PU1424和HCTZ降低大鼠的尿濃縮能力 PU1424組和HCTZ組大鼠的尿量明顯增加，分別達到溶劑對照組尿量的1.52倍和1.78倍(P<0.01, Fig 1A)，并且HCTZ組大鼠的尿量比PU1424組增加了17.2%(P<0.05, Fig 1A)。與此同時，PU1424組和HCTZ組大鼠的飲水量相應(yīng)增加為溶劑對照組的1.42倍和1.56倍(P<0.01, Fig 1B)，HCTZ組大鼠的飲水量比PU1424組增加了20.3%(P<0.05, Fig 1B)。PU1424和HCTZ組大鼠的平均尿滲透壓分別降低為對照組的61.5%和50.4%，且HCTZ組較PU1424組降低了17.9%(P<0.01,P<0.05, Fig 1C)。尿尿素濃度分別降低為對照組的57.1%和56.8%(P<0.01,Fig 1C，1D)。與PU1424相比，HCTZ尿量和飲水量增加得更多。研究結(jié)果證明(Fig 1)，PU1424能夠降低尿濃縮能力發(fā)揮利尿作用，但稍弱于HCTZ。

3.2 PU1424和HCTZ對電解質(zhì)水平的影響 根據(jù)此前尿滲透壓值、尿尿素濃度和排尿量計算出24 h總滲透性分子的排泄量、尿素排泄量和非尿素溶質(zhì)的排泄量。結(jié)果顯示(Fig 2)，與對照組比較，連續(xù)給予PU1424后尿素排泄量及非尿素排泄量均無明顯變化，而HCTZ對照組總滲透性分子排泄量及非尿素排泄量均明顯高于溶劑對照組和PU1424組(P<0.01,P<0.05,Fig 2)。如連續(xù)給藥后尿液及血清中與尿濃縮相關(guān)的主要離子水平(Na+、K+、Cl-)的檢測結(jié)果顯示(Tab 1)，PU1424組與HCTZ組大鼠尿液中Na+、K+、Cl-水平均明顯降低(P<0.01)；與溶劑對照組比較，PU1424組與HCTZ組血清中Na+、K+、Cl-水平均無差異(P>0.05)。研究結(jié)果提示，在較短時間段內(nèi)PU1424的利尿作用降低了尿液中的電解質(zhì)水平，但對血漿電解質(zhì)平衡無明顯影響。

Tab 1 Blood and urinary electrolyte in control, PU1424 or HCTZ treated rats(±s，n=6,mmol·L-1)

**P<0.01vscontrol

Fig 1 Effect of PU1424 and HCTZ on the urinary concentrating ability in rats(±s,n=6)

A:Urea output;B:Water intake;C:Urinary osmolality(Uosm);D:Urine urea concentration(Uurea).#P<0.05vsPU1424treated group.**P<0.01vscontrol

Fig 2 Effect of PU1424 and HCTZ on renal handling of urea in rats(±s,n=6)

#P<0.05vsPU1424treated group;**P<0.01vscontrol.

3.3 PU1424和HCTZ對機體血糖和血脂的影響 3組大鼠的血糖、血脂指標(biāo)具體見表(Tab 2)。與溶劑對照組比較，PU1424組的血糖水平稍有升高但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，HCTZ組的血糖水平明顯高于溶劑對照組(P<0.01)和PU1424組(P<0.05)。大鼠血脂檢測結(jié)果顯示，PU1424組與溶劑對照組的LDL-C水平相當(dāng)，PU1424組的T-CHO、TG、HDL-C水平較PU1424組稍有升高但無統(tǒng)計學(xué)意義；HCTZ組大鼠血清T-CHO和TG水平明顯高于溶劑對照組(P<0.01)和PU1424組(P<0.05)。結(jié)果顯示，PU1424在短期作用時間內(nèi)對體內(nèi)糖代謝和脂代謝無明顯影響，而HCTZ可升高血糖和總膽固醇。

Tab 2 Blood glucose and lipoid levels in control,PU1424 or HCTZ treated rats(±s，n=6,mmol·L-1)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsPU1424treated group

3.4 PU1424和HCTZ對大鼠肝臟和腎臟功能的影響 血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶/谷草轉(zhuǎn)氨酶(谷丙/谷草)、堿性磷酸酶和總蛋白、白蛋白的水平是反應(yīng)肝功能的常用指標(biāo)。結(jié)果顯示(Fig 3A、B和C)，連續(xù)給予PU1424處理后，大鼠血清谷丙/谷草、堿性磷酸酶和總蛋白水平均無明顯變化(P>0.05)。連續(xù)給予HCTZ后，除血清谷丙/谷草比值有明顯升高外(P<0.05和P<0.05)，堿性磷酸酶和總蛋白水平亦均無明顯變化(P>0.05)。研究結(jié)果證明PU1424對大鼠的肝功能無明顯的影響。

Fig 3 Effect of PU1424 or HCTZ on AST/ALT ratio, ALP activity and albumin level in rats(±s,n=6)

A:AST/ALT ratio;B:ALP activity;C:Total protein level;D:Albumin level.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsPU1424treated group.

血清中尿素、肌酐水平顯示，連續(xù)給予PU1424處理后，PU1424處理組和HCTZ組的大鼠血清尿素(Fig 4A)、肌酐(Fig 4B)水平均無明顯改變(P>0.05)，提示兩者對腎功能都無影響。

4 討論

利尿藥一直作為一線降壓藥治療高血壓，噻嗪類利尿藥作為最廣泛應(yīng)用的利尿藥已有超50年的歷史。然而，長期使用包括噻嗪在內(nèi)的利尿藥帶來一系列的副作用，如電解質(zhì)紊亂和機體代謝障礙[2-3]。目前，電解質(zhì)紊亂等不良反應(yīng)已經(jīng)成為限制這些利尿藥臨床應(yīng)用的最大問題，所以研發(fā)不引起電解質(zhì)紊亂的新型利尿藥是利尿藥物研發(fā)領(lǐng)域的熱點。因而在體外實驗篩選出Phenylphthalazines化合物PU1424具有特異、高效抑制尿素通道蛋白轉(zhuǎn)運尿素、且無明顯細胞毒性的基礎(chǔ)下[8]，對新型利尿候選化合物PU1424進行體內(nèi)利尿效果的驗證，結(jié)果顯示其可通過增加尿量、降低尿滲透壓發(fā)揮利尿作用，不影響機體中主要電解質(zhì)(Na+、K+、Cl-)、血糖、血脂代謝的明顯改變，且對血清中谷丙/谷草、堿性磷酸酶和總蛋白、白蛋白的水平等肝臟功能指標(biāo)和尿素、肌酐水平等腎臟功能指標(biāo)均無明顯影響，具有新型利尿藥研究和開發(fā)的價值。

正常人每天形成的原尿約180升，經(jīng)過尿濃縮過程后導(dǎo)致排出的終尿量只有1.5升左右。在這一過程中，腎髓質(zhì)通過逆流倍增、逆流交換的腎內(nèi)尿素循環(huán)機制使得尿素濃度呈現(xiàn)由外髓向內(nèi)髓組織逐漸增加的趨勢，因此，尿素作為腎髓質(zhì)的主要溶質(zhì)與腎皮質(zhì)的氯化鈉共同形成不同部位的滲透壓梯度，通過滲透性調(diào)節(jié)達到有效吸收水和某些溶質(zhì)而濃縮尿液的作用[9-11]。在這一循環(huán)過程中，除內(nèi)髓的直小血管升支內(nèi)皮細胞以微孔方式通透尿素外，腎臟其余各部分均由尿素通道(urea transporters，UTs)介導(dǎo)尿素的通透性[10]。尿素通道蛋白作為特異性通透尿素的膜通道蛋白，包括UT-A和UT-B兩個亞家族，表達于腎臟的不同部位，如UT-A1、UT-A3 和UT-A4分布于腎臟集合管上皮細胞，UT-A2 分布于腎臟髓袢降支細段，UT-B 分布于腎臟直小血管降支內(nèi)皮細胞[9-11]，分別介導(dǎo)相應(yīng)部位的尿素通透，共同參與腎內(nèi)尿素循環(huán)過程，并在尿濃縮機制中發(fā)揮重要作用。

Fig 4 Effect of PU1424 or HCTZ on kidney functions in rats(±s,n=6)

A:Serum urea level;B:Serum creatinine level

UT-B敲除小鼠的研究結(jié)果顯示[12]，敲除小鼠的腎臟體質(zhì)重比、腎小球濾過率以及尿中主要溶質(zhì)(Na+、K+、Cl-)的清除率均無明顯變化；但出現(xiàn)尿量增加、尿滲透壓降低、尿中尿素濃度降低等改變，提示其尿濃縮能力下降。UT-Al/UT-A3基因敲除小鼠尿量比野生型小鼠高3倍，尿濃縮能力降為野生型小鼠的35%[13]。因此，選擇性抑制尿素通道蛋白功能，可達到不影響其它電解質(zhì)的尿素選擇性利尿作用；采用小分子化合物對尿素通道蛋白進行化學(xué)性敲除，對于避免絕大多數(shù)高血壓藥物長期使用引起電解質(zhì)紊亂的不良反應(yīng)具有重要意義。

以尿素通道蛋白為靶點的利尿藥物研究已成為目前利尿藥的重要研究方向，Verkman采用的紅細胞篩選模型因其簡單、準(zhǔn)確的特性使得高通量小分子化合物的藥物篩選成為了可能[14]。本研究的前期實驗通過高通量紅細胞模型篩選出對UT-B和UT-Al均有抑制作用的Phenylphthalazines化合物PU1424，其對人和小鼠紅細胞膜通透尿素抑制作用的半數(shù)有效劑量分別為0.03 μmol·L-1和1.5 μmol·L-1，提示其對人尿素通道蛋白的抑制作用比小鼠更敏感，效果更強；并且還具有抑制作用可逆性、有效劑量濃度范圍內(nèi)無細胞毒性等優(yōu)勢，是較好的候選化合物[8]。因此，需要對PU1424的體內(nèi)利尿作用以及對電解質(zhì)水平、機體代謝的影響進行驗證。

多次給藥結(jié)果顯示，PU1424可以明顯增加大鼠的尿量至對照組的1.52倍，伴隨著尿滲透壓和尿尿素濃度分別降低為對照組的61.5%和57.1%，尿液中Na+、K+、Cl-的濃度降低明顯，提示PU1424能夠降低尿濃縮能力發(fā)揮利尿作用，且尿尿素的排出多于尿滲透壓的降低，顯示其可能是尿素滲透性利尿作用；盡管HCTZ的利尿作用強于PU1424，但其尿尿素的排出少于尿滲透壓的降低(Fig 2)，且尿液中Na+、K+、Cl-的濃度降低更為明顯，提示其促進Na+、K+、Cl-等其它溶質(zhì)的排泄作用更強，可能會引起電解質(zhì)失衡。實驗中PU1424和HCTZ均未引起血清Na+、K+、Cl-水平明顯改變，但因觀察時間較短，還需要后期進行長期用藥對大鼠血清電解質(zhì)影響的觀察。對大鼠體內(nèi)代謝的結(jié)果顯示，PU1424對大鼠的血糖、血脂水平明顯影響，而HCTZ可升高血糖和總膽固醇，與文獻報道一致[15]。與此同時，盡管PU1424和HCTZ均不影響大鼠腎功能；但連續(xù)給予HCTZ可升高血清谷丙/谷草比值，影響肝功能，而PU1424對大鼠血清谷丙/谷草、堿性磷酸酶和總蛋白水平均無影響。綜上所述，PU1424在體外抑制尿素通道蛋白轉(zhuǎn)運尿素的作用在體內(nèi)實驗得到了驗證，結(jié)合前期研究得出主要通過尿素滲透性利尿發(fā)揮作用，且在本實驗的觀察時間段內(nèi)不影響電解質(zhì)水平、機體糖脂代謝和肝臟、腎臟功能，具有藥物開發(fā)的價值。

(致謝：此研究主要在重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織細胞工程與干細胞研究室及解剖學(xué)教研室實驗室完成，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥理學(xué)系楊寶學(xué)教授課題組對實驗過程進行了課題指導(dǎo)等工作，特此感謝！)

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Analysis on diuretic effect of a phenylphthalazines compound PU1424

GUO Pei1,2,RAN Jian-hua2,3,LI Jing1,HE Fei2,3,FAN Chun-hua2,3,TIAN Kuan2,3

(1.LaboratoryofStemCellsandTissueEngineering,CollegeofBasicMedicine;2.DeptofAnatomy;3.NeuroscienceResearchCenter，ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Aim To study on the diuretic effect of a phenylphthalazines compound PU1424and its influence on electrolyte balance, glucose and lipid metabolism, hepatic and renal functions.Methods Male Sprague Dawley rats were randomly divided into solvent control group，PU1424treated group and HCTZ treated group. Urine was collected per 6 h and blood samples were collected at the end of drug administration. Urinary osmolality was measured by Freezing Point Osmometer; urea concentration was measured by Urea Detection Kit; ion level, blood glucose level, blood lipid level, hepatic and renal function were analyzed by Automatic Biochemical Analyzer.Results Compared to the solvent control group, and urine output of rats treated with PU1424and HCTZ was increased as 1.52 times and 1.78 times and water intake increased as 1.42 times and 1.56 times respectively. Urine osmolalities were decreased as 61.5% and 50.4% of the control group, and urine urea concentration was decreased as 57.1% and 56.8% of the control group. Urinary electrolytes were decreased by administration of PU1424and HCTZ compared to the intact plasma electrolytes. The blood glucose levels and blood lipid levels of rats treated with PU1424had no changes, while the blood glucose and total cholesterol were increased by administration of HCTZ. The urea nitrogen, creatinine, alkaline phosphatase and total protein were intact by administration of PU1424and HCTZ except the alanine/straw ration increased by HCTZ.Conclusion New diuretic candidate compound PU1424displays significant diuretic effect with electrolyte balance, blood glucose level, blood lipid level, hepatic and renal function intact.

diuretics; small-molecule inhibitor; Phenylphthalazines; PU1424; urea transport; electrolyte balance

時間：2017-3-13 8:38

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170324.1247.032.html

2016-12-10,

2017-01-14

重慶市科技計劃項目(No cstc2015jcyjA10036); 重慶市渝中區(qū)科委項目(No 20120202); 重慶市教委科技項目(No KJ120330)

郭 珮(1991-)，女，碩士生，研究方向：白血病基礎(chǔ)與臨床,E-mail:930029089@qq.com; 冉建華(1974-)，女，博士，教授，研究方向：尿素通道蛋白生理功能及藥物開發(fā)，通訊作者，E-mail:ranjianhua2013@163.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.04.016

A

1001-1978(2017)04-0529-06

R-332；R916.4；R983.1