枇杷葉熊果酸對大鼠肝星狀細(xì)胞增殖抑制作用及對PPAR-γ、TGF-β1 表達(dá)的影響

張揚武，羅偉生，陳 姍，黃 瑞，譚全肖，王仕衍，張 夏，禤傳鳳

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃科，廣西 南寧 530001)

枇杷葉熊果酸對大鼠肝星狀細(xì)胞增殖抑制作用及對PPAR-γ、TGF-β1 表達(dá)的影響

張揚武，羅偉生，陳 姍，黃 瑞，譚全肖，王仕衍，張 夏，禤傳鳳

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃科，廣西 南寧 530001)

目的 研究枇杷葉熊果酸對大鼠肝星狀細(xì)胞增殖的抑制作用及對PPAR-γ、TGF-β1表達(dá)的影響，探討枇杷葉熊果酸抗肝纖維化的可能作用機制。方法 體外培養(yǎng)HSC-T6細(xì)胞，隨機分為空白組，羅格列酮對照組，枇杷葉熊果酸低、中、高濃度組，分別干預(yù)24、48、72 h后，運用CCK-8法檢測各組細(xì)胞的增殖情況；ELISA法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的Ⅰ型膠原蛋白含量；Real-time PCR法檢測各組PPAR-γ、TGF-β1 mRNA的表達(dá)；免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測各組PPAR-γ、TGF-β1蛋白的表達(dá)。結(jié)果 CCK-8結(jié)果顯示，隨著熊果酸作用時間的延長，藥物對細(xì)胞的增殖的抑制率增高(P<0.01)；ELISA結(jié)果顯示，隨著熊果酸藥物濃度的增加，上清中的Ⅰ型膠原蛋白含量下降(P<0.01)；Real-time PCR結(jié)果顯示，隨著熊果酸藥物濃度增加，PPAR-γ mRNA的表達(dá)量增加，TGF-β1 mRNA的表達(dá)量下降(P<0.01)；免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，隨著熊果酸藥物濃度增加，PPAR-γ 蛋白的表達(dá)增強，TGF-β1 蛋白的表達(dá)減弱(P<0.01)。以上作用具有劑量-效應(yīng)關(guān)系，高濃度組作用較對照組強。結(jié)論 枇杷葉熊果酸能夠抑制HSC-T6細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞外基質(zhì)分泌，該機制可能與上調(diào)PPAR-γ 表達(dá)，下調(diào)TGF-β1表達(dá)有關(guān)。

枇杷葉熊果酸；肝星狀細(xì)胞；肝纖維化；膠原；細(xì)胞外基質(zhì)；細(xì)胞因子

肝纖維化是由于多種致病因素形成的慢性肝實質(zhì)炎癥、壞死導(dǎo)致肝臟纖維結(jié)締組織的過度沉積、異常增生的一種慢性肝臟疾病。肝纖維化的進(jìn)程中，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的分泌起著關(guān)鍵作用。熊果酸(ursolic acid，UA)是枇杷葉的功能物質(zhì)之一，而且相對其它含有UA的中草藥含量豐富。前期研究表明[1]，UA具有降低轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的mRNA及蛋白表達(dá)，抑制TGF-β1與其受體的結(jié)合[2]，誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞凋亡并降低Bcl2/Bax比值，激活天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate-specific proteinase-3，Caspase-3)相關(guān)蛋白[3]的作用。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ ,PPAR-γ)是存在于HSC里的一種配體激活轉(zhuǎn)錄因子。PPAR-γ通過阻斷TGF-β1/TβR-Ⅰ信號，抑制Smad磷酸化，進(jìn)一步抑制Smad靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制ECM生成[4]。UA是否也可通過激活PPAR-γ而抑制TGF-β1及其信號通路下游因子的表達(dá)而發(fā)揮抗肝纖維化的作用？因此，本實驗通過體外培養(yǎng)HSC-T6細(xì)胞，運用CCK-8法檢測UA對HSC-T6細(xì)胞的增殖情況，ELISA法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的(Collagen Ⅰ,Col Ⅰ)含量，Real-time PCR法檢測各組PPAR-γ、TGF-β1 mRNA的表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測各組PPAR-γ、TGF-β1蛋白的表達(dá)，探討UA抗肝纖維化的可能作用機制。

1 材料

1.1 細(xì)胞系 HSC-T6細(xì)胞購自中國科學(xué)院昆明動物研究所細(xì)胞庫。

1.2 藥物與試劑 枇杷葉熊果酸(批號：160623)購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；羅格列酮(批號：HY-17386)購自MCE上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司；FBS、DMEM高糖培養(yǎng)基購自加拿大維森特公司；CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司；Col-Ⅰ ELISA試劑盒購自基爾頓(上海)生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、PPAR-γ、TGF-β1、GAPDH內(nèi)參引物均購自寶生物工程 (大連) 有限公司;PPAR-γ、TGF-β1第一抗體購自美國Abcam公司；兔SP檢測試劑盒、DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(371-184L，蘇州)；低速離心機(DL-5M，湖南)；恒溫水浴槽(SY-1220，美國)；倒置顯微鏡(IX71，日本)；生物安全柜(BSC-1600IIA2，蘇州)；超微量紫外可見分光光度計(UV1901PC，上海)；酶標(biāo)儀(Epoch Biotek，美國)；實時熒光定量PCR儀(PIKOREAL，美國)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6運用10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基置于5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4天傳代1次，取處于對數(shù)期生長期的細(xì)胞用于實驗。實驗分組為：空白組、羅格列酮對照組、UA低、中、高濃度組。

2.2 CCK-8法檢測HSC-T6細(xì)胞增殖 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為2×107·L-1,吹懸打勻后以每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板，設(shè)置空白對照組(無藥培養(yǎng)基)、羅格列酮對照組[4](15 μmol·L-1羅格列酮) 、UA低濃度組(10 μmol·L-1UA)、UA中濃度組(25 μmol·L-1UA)、UA高濃度組(40 μmol·L-1UA)，每組設(shè)定5個復(fù)孔。細(xì)胞接板24 h完全貼壁后棄去舊培養(yǎng)基，分別加入不同藥物的工作液，干預(yù)24、48、72 h后棄培養(yǎng)基，加入新的完全培養(yǎng)基后每孔加入10 μL的CCK-8溶液，置于37℃培養(yǎng)箱孵育1 h，多功能酶標(biāo)讀數(shù)儀上測定450 nm處的OD值。按以下公式計算不同藥物濃度對HSC-T6細(xì)胞的增殖抑制率：抑制率(IR)/%=[(空白對照組OD值-實驗組OD值)/(空白對照組OD值-空白孔OD值)]×100%，根據(jù)不同藥物濃度對細(xì)胞增殖的能力，選擇后續(xù)實驗藥物最佳作用時間。

2.3 ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Col-Ⅰ含量 取處于對數(shù)期細(xì)胞以10×107·L-1密度，每孔2.5 mL接種于6孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔，細(xì)胞貼壁后按CCK-8法中的各組藥物濃度干預(yù)細(xì)胞72 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。先在各小試管中稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，然后設(shè)置空白孔、待測樣品孔進(jìn)行加樣，溫育30 min，用30倍濃縮液稀釋后進(jìn)行洗滌，每孔加入酶標(biāo)試劑后再進(jìn)行溫育30 min，重復(fù)洗滌后加入顯色劑顯色15 min，加入終止液終止反應(yīng)，以空白孔調(diào)零于450 nm波長依次測量各孔的吸光度(OD值)。以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度。

2.4 Real-time PCR法檢測細(xì)胞內(nèi)PPAR-γ、TGF-β1 mRNA的表達(dá) 細(xì)胞按10×107·L-1密度，每孔2.5 mL接種于6孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔，細(xì)胞貼壁后按CCK-8法中的各組藥物濃度干預(yù)72 h后TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ說明書進(jìn)行Real -time PCR檢測，以GAPDH引物為內(nèi)參。GAPDH上游5′-ATGGGAAGCTGGTCATCAAC-3′，GAPDH下游5′-GTGGTTCACACCCATCACAA-3′；PPAR-γ上游5′-CTGTTTTATGCTGTTATGGGT-3′；PPAR-γ下游5′-GTCAAAGGAATGGGAGTGGTC-3′；TGF-β1上游5′-CTGGGGCCCTGCCCCTACAT-3′，TGF-β1下游5′-CTTGGGCTTGCGACCCACGT-3′。兩步法反應(yīng)條件如下：95℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃ 30 s，44個循環(huán)。讀取Ct值，以2-△△Ct表示目的基因mRNA的表達(dá)水平(-△△Ct計算公式：-△△Ct XY=Ct XY-Ct GAPDH Y-Ct X對照，其中X代表基因，Y代表處理因素)。

2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測細(xì)胞內(nèi)PPAR-γ、TGF-β1蛋白的表達(dá) 采用免疫組化SP法，將對數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞接種于放有蓋玻片的6孔板中，每組設(shè)2個復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁生長后，不同藥物分組干預(yù)。藥物與細(xì)胞共孵育72 h后，取出蓋玻片置于載玻片上，用4%多聚甲醛固定，3% H2O2消除內(nèi)源性過氧化氫酶，正常血清封閉后分別加入鼠抗人PPAR-γ、TGF-β1單克隆抗體，4℃孵育過夜，隨后加入生物素二抗工作液及辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，經(jīng)DAB顯色，脫水、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。結(jié)果判讀：在每組的2 片細(xì)胞蓋玻片中隨機選取6個有意義的高倍鏡視野進(jìn)行觀察，可見細(xì)胞質(zhì)呈特異性棕褐色陽性染色，陽性表達(dá)率/%=(500個細(xì)胞內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)/500個細(xì)胞數(shù))×100%[5]。

3 結(jié)果

3.1 HSC-T6細(xì)胞的增殖情況 不同藥物濃度分別干預(yù)5組細(xì)胞24、48、72 h后CCK-8分析發(fā)現(xiàn)，UA具有劑量-效應(yīng)關(guān)系抑制HSC-T6細(xì)胞的增殖，在72 h抑制率達(dá)到最大；與對照組比較，UA高濃度組抑制作用較強，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，中、低濃度組的抑制率較低(P<0.05)。后續(xù)實驗采用72 h干預(yù)時間。見Tab 1。

3.2 各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液Col-Ⅰ含量比較 藥物干預(yù)細(xì)胞72 h后，與空白組比較，Col-Ⅰ含量明顯低于空白組(P<0.01)；與對照組比較，UA高濃度組Col-Ⅰ含量低于對照組(P<0.01)，低、中濃度組Col-Ⅰ含量高于對照組(P<0.01)。見Tab 2。

Tab 1 Effect of different group on OD value of HSC-T6 cells(± s，n=5)

*P<0.05,**P<0.01vsblank;#P<0.05,##P<0.01vscontrol

Tab 2 Comparison of content of Col-Ⅰ in different groups(±s，n=3)

**P<0.01vsblank;##P<0.01vscontrol

3.3 各組細(xì)胞PPAR-γ、TGF-β1 mRNA的表達(dá)比較 藥物干預(yù)細(xì)胞72 h后，與空白組比較，藥物干預(yù)組中PPAR-γ mRNA的表達(dá)量均明顯增加(P<0.01)，TGF-β1 mRNA的表達(dá)量均降低(P<0.05)；與對照組比較，UA高濃度組PPAR-γ mRNA的表達(dá)量明顯高于對照組(P<0.01)，低濃度組明顯低于對照組(P<0.01)，中濃度組表達(dá)量低于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與對照組比較，UA低濃度組TGF-β1 mRNA的表達(dá)量明顯增加(P<0.01)，UA中濃度組TGF-β1 mRNA的表達(dá)量增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，高濃度組表達(dá)量降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見Fig 1、Fig 2。

3.4 各組細(xì)胞PPAR-γ、TGF-β1蛋白的表達(dá)差異 藥物干預(yù)72 h后，不同組別細(xì)胞中均出現(xiàn)棕褐色染色，與空白組比較，藥物干預(yù)組PPAR-γ蛋白的表達(dá)量均增加，TGF-β1蛋白的表達(dá)量均減少(P<0.01)；與對照組比較，UA低、中濃度組PPAR-γ蛋白的表達(dá)量均低于對照組，UA高濃度組高于對照組(P<0.01)；與對照組比較，UA低、中濃度組TGF-β1蛋白的表達(dá)量均高于對照組，UA高濃度組低于對照組(P<0.01)。見Tab 3、Fig 3、4。

**P<0.01vsblank group;##P<0.01vscontrol group

Fig 2 Comparison of TGF-β1 mRNA expression in different groups(±s，n=3)

*P<0.05,**P<0.01vsblank group;##P<0.01vscontrol group

Tab 3 Percentage of PPAR-γ protein and TGF-β1 protein expression in different groups(±s，n=6)

**P<0.01vsblank;##P<0.01vscontrol

4 討論

肝纖維化是各種肝病發(fā)展成肝硬化的必經(jīng)病理過程。在我國常以乙型或丙型病毒性肝炎遷延不愈所致，30%慢性丙型肝炎患者最終出現(xiàn)嚴(yán)重的肝纖維化或肝硬化病變。肝病的治療重點轉(zhuǎn)移到如何控制肝病的進(jìn)展，防止肝纖維化以致肝硬化的發(fā)生、發(fā)展已成為國內(nèi)外生物醫(yī)學(xué)研究的熱點之一[6]。肝纖維化的特征表現(xiàn)為以膠原為主的ECM的降解減少，合成增多，沉積于肝內(nèi)過度表達(dá)從而造成假小葉的形成與肝小葉的結(jié)構(gòu)重建，而HSC的活化與增殖是ECM產(chǎn)生的主要來源，在肝纖維疾病的進(jìn)程中起著絕對作用[7]。肝纖維化狀態(tài)下ECM的質(zhì)和量會發(fā)生明顯變化，Ⅰ型膠原在肝臟中的含量比正常值高3～8 倍。所以我們可以認(rèn)為HSC 細(xì)胞的分泌功能以Ⅰ 型膠原表達(dá)水平的測定來直接地反映[8]。前期實驗研究表明，UA在體內(nèi)具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗癌、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)靜、肝損傷保護等多種藥理作用[9]，但在抗肝纖維化的報道還比較少。本實驗中，UA對HSC-T6細(xì)胞的抑制率隨著濃度升高而升高，與對照組比較，UA高濃度干預(yù)組抑制率更高，說明UA具有明顯的抑制HSC-T6細(xì)胞增殖的作用，并呈劑量-效應(yīng)的關(guān)系。ELISA測定各組細(xì)胞上清液Ⅰ型膠原含量實驗中發(fā)現(xiàn)，UA能夠使Ⅰ型膠原降解，在UA高濃度組中該作用最為明顯，說明UA能夠抑制HSC-T6細(xì)胞中的膠原分泌。

Fig 3 Expression of PPAR-γ protein in different groups(×200)

Fig 4 Expression of TGF-β1 protein in different groups(×200)

肝纖維化的形成是一個多因素、多細(xì)胞參與的復(fù)雜過程。肝纖維化過程中，HSC的激活是其中心環(huán)節(jié)。PPAR-γ在配體作用下通過啟動或參與復(fù)雜的信號通路發(fā)揮眾多生物效應(yīng)，但目前對PPAR-γ與TGF-β-Smad信號交聯(lián)及其對下游因子在肝纖維化細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路中作用知之甚少。有研究表明，PPAR-γ活化后對c-Ski始發(fā)于轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)，并提示c-Ski可能是PPAR-γ的又一靶基因[10]。c-Ski是TGF-β的smad途徑的阻遏子，其可以通過阻止smad2、smad3磷酸化，以及阻止磷酸化smad3與smad4結(jié)合形成有活性的smad復(fù)合物及募集大量輔抑制子而阻斷TGF-β/smad途徑對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[11]。TGF-β激活能夠促進(jìn)HSC增殖、產(chǎn)生膠原，同時抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解，加速肝纖維化發(fā)展。羅格列酮可作為PPAR-γ的特異性誘導(dǎo)劑，通過上調(diào)PPAR-γ表達(dá)，下調(diào)TGF-β表達(dá)而抑制HSC細(xì)胞的活化，實現(xiàn)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)[12]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，UA能夠使HSC-T6細(xì)胞中的PPAR-γ基因和蛋白表達(dá)水平上調(diào)，下調(diào)TGF-β1基因和蛋白的表達(dá)，并且存在劑量依賴性，這可能是UA抗肝纖維的分子機制之一。

綜上所述，UA能夠抑制HSC-T6細(xì)胞增殖，降解ECM的沉積，說明UA具有抗肝纖維化的作用，其中機制可能與上調(diào)PPAR-γ表達(dá)，下調(diào)TGF-β1表達(dá)有關(guān)。肝纖維化的調(diào)控機制非常復(fù)雜，UA抗肝纖維化的作用機制有待進(jìn)一步研究，為UA抗肝纖維化提供實驗依據(jù)。

(致謝：本研究全部在廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院分子生物學(xué)實驗室完成，特此感謝!)

[1] Murakami S, Takashima H, Sato-Watanabe M, et al. Ursolic acid, an antagonist for transforming growth factor(TGF)-beta1[J].FEBSLett,2004,566(1-3):55-9.

[2] 歐陽燦暉,朱 萱,張焜和,等.熊果酸對肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1和α-SMA表達(dá)的影響[J]. 世界華人消化雜志，2009,17(22):2237-43.

[2] Ouyang C H, Zhu X, Zhang K H, et al.Effects of ursolic acid on the expression of transforming growth factor-β1 and alphasmooth muscle actin in fi brotic liver in rats[J].WorldChinJDigestol,2009,17(22):2237-43.

[3] 申月明,朱 萱,張昆和,等.熊果酸對肝星狀細(xì)胞增殖與凋亡的影響[J]. 中華肝臟病雜志，2008,16(4): 298-301.

[3] Shen Y M, Zhu X, Zhang K H, et al. Effect of ursolic acid on proliferation and apoptosis of hepatic stellate cellsinvitro[J].ChinJHepatol,2008,16(4): 298-301.

[4] 蔡玲燕，劉 菲. PPARγ對肝纖維化中肝星狀細(xì)胞相關(guān)信號通路的影響[J].國際內(nèi)科學(xué)雜志，2009，36(7)：417-9.

[4] Cai L Y, Liu F. Effect of PPARγ on signal transduction of hepatic stellate cells in liver fibrosis[J].IntJInternMed，2009，36(7)：417-9.

[5] 謝金玲，趙 川，李俊萱，等. 白花丹醌對人肝癌細(xì)胞HepG2侵襲和凋亡的影響[J].中國藥理學(xué)通報，2016，32(5)：687-91.

[5] Xie J L, Zhao C, Li J X, et al.Effect of plumbagin on invasion and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell line HepG2[J].ChinPharmacolBull,2016,32(5):687-91.

[6] Garcia-Tsao G,Sanyal A J,Grace N D, et al. Prevention and management of gastroesophageal varices and variceal hemorrhage in cirrhosis[J].Hepatology, 2007,46(6): 922-38.

[7] Xu T, Ni M M, Xing-Li, et al.NLRC5 regulates TGF-β1-induced proliferation and activation of hepatic stellate cells during hepatic fibrosis[J].BiochemCellBiol,2016,1(70):92-104.

[8] Friedman S L. Molecular regulation of hepatic fibrosis, an integrated cellular response to tissue injury[J].JBiolChem,2000,275(4):2247-50.

[9] Kiran M S, Viji R I, Sameer Kumar V B, et al. Modulation of angiogenic factors by ursolic acid[J].BiochemBiophysResCommun,2008,371(3):556-60.

[10]李工博，李 軍，曾益軍，等.PPARγ對TGFβ/smad信號通路阻遏子c-Ski的上調(diào)[J].生理學(xué)報，2011，63(1)：62-8.

[10]Li G B, Li J, Zeng Y J,et al. PPARγ up-regulates TGFβ/smad signal pathway repressor c-Ski[J].ActaPhysiolSin，2011，63(1)：62-8.

[11]Macias-silva M, Li W, Leu J I,et al.Up-regulated transcriptional repressors SnoN and Ski bind Smad proteins to antagonize transforming growth factor-beta signals during liver regeneration[J].JBiolChem,2002,277(32): 28483-90.

[12]康 誼,曾艷麗,魏君鋒,等. 羅格列酮抑制大鼠肝纖維化機制研究[J].中華實用診斷與治療雜志,2013,27(07):676-9.

[12]Kang Y, Zeng Y L, Wei J F, et al. Mechanism of rosiglitazone inhibiting liver fibrosis in rats[J].JChinPractDiagnTher,2013,27(07):676-9.

Effects of ursolic acid from loquat leaves on proliferation inhibition and expression of PPAR-γ, TGF-β1 in rat hepatic stellate cells

ZHANG Yang-wu, LUO Wei-sheng, CHEN Shan, HUANG Rui,TAN Quan-xiao, WANG Shi-yan, ZHANG Xia, XUAN Chuan-feng

(DeptofStomachandSpleen,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530001,China)

Aim To investigate the effects of ursolic acid from loquat leaves on proliferation inhibition and expression of PPAR-γ 、TGF-β1 in rat hepatic stellate cells, so as to explore the mechanism of anti-hepatic fibrosis of UA.Methods HSC-T6 cells were randomly divided into blank group, rosiglitazone control group, the low, medium and high concentration of UA group to detect the cell proliferation inhibition by CCK-8 after 24,48,72 h. The content of type collagen Ⅰ in cell culture supernatant of each group was examined by ELISA. The expression of PPAR-γ mRNA, TGF-β1 mRNA in HSC-T6 cells exposured were examined by real-time quantitative PCR. Effects on HSC-T6 PPAR-γ and TGF-β1 protein from each group were detected by immunocytochemical method.Results CCK-8 results showed that the inhibitory rate of UA on cell proliferation increased with the prolongation of drug action time(P<0.01). ELISA results showed that with the increase of the concentration of UA, the content of type Ⅰ collagen content decreased(P<0.01). Real-time PCR results showed that with the increase of the concentration of UA, and the expression of PPAR-γ mRNA increased, the expression of TGF-β1 mRNA decreased(P<0.01). The results of immunocytochemistry showed that the expression of PPAR-γ protein was increased, and the expression of TGF-β1 protein was decreased with the increase of the concentration of UA(P<0.01).All effects mentioned above were dose-dependent. Moreover, the effects in the high concentration groups were stronger than those in control group.Conclusion UA can inhibit the proliferation of HSC-T6 cells, Which may be associated with the up-regulation of PPAR-γ expression and the down-regulation of TGF-β1 expression．

ursolic acid from loquat leaves;hepatic stellate cells; liver fibrosis; collagen;extracellular matrix; cytokine

時間：2017-3-13 8:38

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170324.1247.028.html

2016-12-20,

2017-01-14

國家自然科學(xué)基金地區(qū)資助項目(No 81360530)；國家自然科學(xué)基金地區(qū)資助項目(No 81660779)；廣西中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生科研創(chuàng)新重點項目(No YJS201617)

張揚武(1987-)，男，碩士生，研究方向：消化系統(tǒng)疾病的臨床和基礎(chǔ)，E-mail：1013194142@qq.com； 羅偉生(1959-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：消化系統(tǒng)疾病的臨床和基礎(chǔ)，通訊作者，E-mail：4011188@qq.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.04.014

A

1001-1978(2017)04-0517-05

R-332；R284.1；R322.47；R329.24；R392.12；R575.202.2；R977.6