刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化

嚴(yán) 晨，殷嫦嫦，王子瑤，殷 明

(南昌大學(xué) 1.第二附屬醫(yī)院骨科、2.研究生院醫(yī)學(xué)部，江西 南昌 330006；3.九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室，江西 九江 332000)

刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化

嚴(yán) 晨1,2，殷嫦嫦3，王子瑤1,2，殷 明1

(南昌大學(xué) 1.第二附屬醫(yī)院骨科、2.研究生院醫(yī)學(xué)部，江西 南昌 330006；3.九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室，江西 九江 332000)

TFAE；hUCMSCs；增殖；Col1a1；OPN；成骨分化

骨缺損臨床上常見(jiàn)，治療起來(lái)比較棘手，經(jīng)濟(jì)花費(fèi)多，常出現(xiàn)骨不連、骨不愈合、畸形、功能障礙等。隨著人口老齡化、高能量暴力損傷逐年增多，大段骨缺損發(fā)生率也不斷上升。骨組織工程技術(shù)治療大段骨缺損是一種嶄新的方法，試圖減少骨缺損治療并發(fā)癥及經(jīng)濟(jì)費(fèi)用，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。生長(zhǎng)誘導(dǎo)因子是骨組織工程中的因素之一，在骨修復(fù)過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。一些外源性成骨生長(zhǎng)誘導(dǎo)因子已應(yīng)用于臨床來(lái)促進(jìn)骨修復(fù)，但其價(jià)格昂貴，劑量難以控制，長(zhǎng)期大量應(yīng)用可產(chǎn)生一定的毒副作用，使得其廣泛應(yīng)用受到一定約束。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，一些傳統(tǒng)中藥具有一定促成骨分化潛能，可替代外源性成骨生長(zhǎng)誘導(dǎo)因子或作為補(bǔ)充[1]。

刺頭復(fù)葉耳蕨( arachniodes exilis )為鱗毛蕨科復(fù)葉耳蕨屬植物，多年來(lái)，作為一種民間用藥，用于治療急性黃疸型肝炎、腰腿疼、關(guān)節(jié)炎、燒傷等，已被證明具有抗菌及抗炎作用[2]。Zhou等[3]研究發(fā)現(xiàn)，刺頭復(fù)葉耳蕨的乙醇提取物具有潛在的抗氧化和護(hù)肝作用，在治療肝臟疾病方面具有一定的潛能。刺頭復(fù)葉耳蕨提取物成分復(fù)雜，各種提取物的生物學(xué)作用尚不清楚，其中黃酮及多酚類衍生提取物研究頗多，具有一定的價(jià)值。Li等[4]研究發(fā)現(xiàn)，刺頭復(fù)葉耳蕨提取物總黃酮能通過(guò)活化MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常人肝LO2細(xì)胞增殖影響較小，特別是在低濃度時(shí)。Wu等[1]研究報(bào)道黃酮類化合物淫羊藿能夠促進(jìn)BMSCs成骨分化。Song等[5]研究證實(shí)淫羊藿促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖，并能夠通過(guò)雌激素受體(ER)介導(dǎo)激活ERK及JNK信號(hào)途徑，促進(jìn)成骨分化。本研究探討TFAE對(duì)hUCMSCs增殖及成骨分化的作用，為藥物的開(kāi)發(fā)利用及骨缺損的治療提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料

1.1 臍帶 人臍帶由九江市婦幼保健院提供，產(chǎn)婦及胎兒健康。產(chǎn)婦及家屬對(duì)本研究知情同意, 并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 TFAE由九江學(xué)院藥學(xué)院提供(采用超聲輔助的乙醇浸提法及聚酰胺純化提取，蘆丁樣結(jié)構(gòu)化合物含量為75%)，α-MEM培養(yǎng)基、Hyclone胎牛血清(Hyclone公司 美國(guó))，CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(上海經(jīng)科化學(xué))，ALP測(cè)定試劑盒(上海榮盛生物)，hUCMSCs成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒、茜素紅染色液(廣州賽業(yè)生物科技)，GREENspin組織/細(xì)胞RNA提取試劑盒(北京莊盟)，HiFiscriptcDNA 第一鏈合成試劑盒、Goat Anti-Rabbit IgG、HRP(北京康為世紀(jì))，基因引物(上海生工生物工程)，2×Tap Master Mix(上海近岸)，總蛋白提取試劑盒(北京普利萊)，兔抗人GAPDH、Col1a1、OPN多克隆抗體(Abcam 美國(guó))。

1.3 主要儀器 倒置熒光顯微鏡(Nikon日本)，酶標(biāo)儀(Bio-Tek 美國(guó))，PCR儀(杭州博日科技有限公司)，SIM凝膠成像系統(tǒng)(SIM公司 美國(guó))，電泳儀(Bio-RAD 美國(guó))。

2 方法

2.1 hUCMSCs分離、培養(yǎng) 本研究團(tuán)隊(duì)已建立了hUCMSCs分離、培養(yǎng)及純化、鑒定的實(shí)驗(yàn)研究條件[6]。無(wú)菌條件下分離臍帶中的華通氏膠，將其剪成體積約3～5 mm3大小，接種于10 cm2塑料皿中，加入含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d更換一次培養(yǎng)基。待細(xì)胞融合達(dá)80%～90%后，消化接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞融合達(dá)80%～90%后，按1 ∶3傳代培養(yǎng)，取P3代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性 實(shí)驗(yàn)分為5組：0 mg·L-1TFAE組(對(duì)照組)，1 mg·L-1TFAE組，5 mg·L-1TFAE組，10 mg·L-1TFAE組，20 mg·L-1TFAE組。取P3代hUCMSCs按5×103/孔接種于96孔板中，每孔200 μL培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，更換含不同濃度的TFAE等量培養(yǎng)基。各濃度組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔和1個(gè)空白孔(只含藥物不含細(xì)胞)。分別作用24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37℃孵育2 h后取出，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔吸光度OD(A)值，各組吸光度OD=A細(xì)胞-A藥空白，細(xì)胞活性/%=(1-OD實(shí)驗(yàn)/OD對(duì)照)×100%。

2.3 茜素紅染色 配制完全成骨誘導(dǎo)液：將hUCMSCs成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒中的各組分充分混合。實(shí)驗(yàn)分4組：空白對(duì)照組(常規(guī)培養(yǎng)基)，陽(yáng)性對(duì)照組(0 mg·L-1TFAE的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基)，1 mg·L-1TFAE組(1 mg·L-1TFAE的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基)，5 mg·L-1TFAE組(5 mg·L-1TFAE的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基)。取第3代hUCMSCs按2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞融合達(dá)60%～70%，按照分組更換常規(guī)培養(yǎng)基或含不同濃度的TFAE成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每3天換液一次，誘導(dǎo)14 d后行茜素紅染色，培養(yǎng)板拍照及倒置相差顯微鏡下觀察并計(jì)算每組10個(gè)視野鈣結(jié)節(jié)數(shù)量，求平均值。

2.4 AMP法測(cè)定ALP活力 分組及培養(yǎng)、誘導(dǎo)方法同“2.3”，誘導(dǎo)3、7 d后，按ALP測(cè)定試劑盒(AMP法)使用說(shuō)明書(shū)步驟操作于405 nm處酶標(biāo)儀檢測(cè)各組每分鐘吸光度平均變化值A(chǔ)/min，共3 min，根據(jù)公式：ALP活力(U/L)=A/min×F(F=2 713)，計(jì)算各組ALP活力。

2.5 RT-PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因表達(dá)水平 分組及培養(yǎng)、誘導(dǎo)方法同“2.3”，誘導(dǎo)14 d后，按GREENspin組織/細(xì)胞快速提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，按HiFiscriptcDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按2×Tap Master Mix說(shuō)明行DNA擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(共25 μL)：2×Tap Master Mix 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引流1 μL，CDNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL，將擴(kuò)增產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，SIM凝膠成像系統(tǒng)拍照，條帶用Image J 軟件分析其灰度值。目的基因：Col1a1、OPN、Runx2、Osx，內(nèi)參：GAPDH?；蛞镄蛄屑爱a(chǎn)物大小見(jiàn)Tab 1。

2.6 Western blot檢測(cè)成骨標(biāo)記蛋白表達(dá)水平 分組及培養(yǎng)、誘導(dǎo)方法同“2.3”，誘導(dǎo)14 d后，按總蛋白抽提試劑盒操作說(shuō)明提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，每孔蛋白上樣量30 μg，進(jìn)行聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，一抗GAPDH(1 ∶4 000)、Col1a1(1 ∶1 000)、OPN(1 ∶1 000)孵育，1×TBTS洗膜3次，二抗(1 ∶6 000)孵育，1×TBTS洗膜3次，暗室中膠片曝光、顯影、定影，膠片拍照，條帶用Image J軟件分析其灰度值。

Tab 1 Gene primer sequence and product length

Fig 1 Cellular morphology observation(×100)

A：Primary hUCMSCs cultured for 5 days；B：Primary hUCMSCs cultured for 12 days；C: hUCMSCs at passage 1 cultured for 2 days；D：hUCMSCs at passage 3 cultured for 3 days

3 結(jié)果

3.1 hUCMSCs形態(tài)學(xué)觀察 臍帶組織貼壁培養(yǎng)3～5 d后，鏡下可見(jiàn)少許細(xì)胞爬出(Fig 1A)，培養(yǎng)10～14 d，組織塊周?chē)L(zhǎng)滿成纖維樣細(xì)胞(Fig 1B)，經(jīng)傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞呈均一的長(zhǎng)梭形或紡錘形，排列緊密，呈魚(yú)群樣或旋渦狀分布(Fig 1C、D)。

3.2 細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果 CCK-8檢測(cè)結(jié)果分析顯示：與對(duì)照組相比，低濃度TFAE組(1 mg·L-1TFAE組、5 mg·L-1TFAE組)細(xì)胞活性明顯增強(qiáng)(P<0.05或P<0.01)，而高濃度TFAE組(10 mg·L-1TFAE組、20 mg·L-1TFAE組)細(xì)胞活性明顯減弱(P<0.05或P<0.01)，說(shuō)明在一定濃度范圍內(nèi)，TFAE促進(jìn)hUCMSCs增殖，在范圍外時(shí)則抑制其增殖(Fig 2)。

Fig 2 Effect of TFAE on proliferation in hUCMSCs(±s,n=4)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3.3 茜素紅染色結(jié)果 茜素紅染色結(jié)果及分析顯示：誘導(dǎo)14 d后，陽(yáng)性對(duì)照組及不同濃度TFAE組均有鈣結(jié)節(jié)形成，而空白對(duì)照組未見(jiàn)鈣結(jié)節(jié)，與陽(yáng)性對(duì)照組，1 mg·L-1TFAE組及5 mg·L-1TFAE組顏色加深及鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯增多，差異有顯著性(P<0.01)，說(shuō)明一定濃度的TFAE能促進(jìn)hUCMSCs鈣結(jié)節(jié)形成，促進(jìn)成骨分化(Fig 3)。

3.4 ALP檢測(cè)結(jié)果 AMP法檢測(cè)ALP結(jié)果分析顯示：誘導(dǎo)3、7 d后，與空白對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、1 mg·L-1TFAE組及5 mg·L-1TFAE組ALP活力明顯增強(qiáng)(P<0.05或P<0.01)，與陽(yáng)性對(duì)照組，1 mg·L-1TFAE組及5 mg·L-1TFAE組ALP活力也明顯增強(qiáng)，差異顯著(P<0.05或P<0.01)，且7 d時(shí)各組hUCMSCs的ALP活力均高于3 d時(shí)對(duì)應(yīng)各組(Fig 4)。

3.5 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果分析顯示：誘導(dǎo)14 d后，與空白對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、1 mg·L-1TFAE組及5 mg·L-1TFAE組成骨相關(guān)基因Col1a1、OPN、Runx2、OsxmRNA表達(dá)量明顯增加(P<0.01)，與陽(yáng)性對(duì)照組，1 mg·L-1LTFAE組及5 mg·L-1TFAE組Col1a1、OPN、Runx2、OsxmRNA表達(dá)量也明顯增加，差異有顯著性(P<0.05或P<0.01)(Fig 5)。

3.6 Western blot檢測(cè)結(jié)果 Western blot檢測(cè)結(jié)果分析顯示：誘導(dǎo)14 d后，與空白對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、1 mg·L-1TFAE組及5 mg·L-1TFAE組Col1a1、OPN蛋白表達(dá)量明顯增加(P<0.05或P<0.01)，與陽(yáng)性對(duì)照組，1 mg·L-1TFAE組及5 mg·L-1TFAE組Col1a1、OPN蛋白表達(dá)量也明顯增加，差異有顯著性(P<0.01)(Fig 6)。

4 討論

hUCMSCs來(lái)源于人臍帶華通膠組織，是一種多能干細(xì)胞，具有強(qiáng)大的增殖及分化潛能，在一定條件下可分化成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰島樣細(xì)胞等[7-11]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是目前組織工程技術(shù)中研究較多，應(yīng)用較廣的干細(xì)胞。隨著hUCMSCs的發(fā)現(xiàn)及深入研究，其具有比BMSCs更大的優(yōu)勢(shì)，臍帶屬于醫(yī)療廢物，因此hUCMSCs來(lái)源無(wú)創(chuàng)、廣泛，易獲取，可塑性更強(qiáng)，易培養(yǎng)擴(kuò)增、免疫原性極低，凍存復(fù)蘇生物性狀不改變，傳代培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞增殖及分化能力影響極小，與骨組織工程支架具有良好的相容性，是未來(lái)具有廣闊應(yīng)用前景的種子細(xì)胞。

Fig 3 Effect of TFAE on calcium nodules formation in hUCMSCs(±s, n=4)**P<0.01 vs control；##P<0.01 vs positive control

Fig 4 Effect of TFAE on ALP activity in hUCMSCs(±s,n=4)

*P<0.05，**P<0.01vscontrol；#P<0.05，##P<0.01vspositive control

黃酮類化合物廣泛存在大自然植物體內(nèi)，具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、護(hù)肝、防治癌癥等作用。刺頭復(fù)葉耳蕨是我國(guó)民間傳統(tǒng)中藥，歷史悠久。研究報(bào)道刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮提取物TFAE具有促進(jìn)肝細(xì)胞再生、抗病毒及殺傷癌細(xì)胞作用[3-4]。 有研究發(fā)現(xiàn)多種黃酮類化合物如黃芩苷、淫羊藿有促進(jìn)細(xì)胞增殖及成骨分化作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的TFAE(1、5 mg·L-1)能夠促進(jìn)hUCMSCs增殖，高濃度TFAE抑制其增殖(10、20 mg·L-1)，說(shuō)明一定濃度范圍TFAE能促進(jìn)干細(xì)胞增殖，因此本實(shí)驗(yàn)取1、5 mg·L-1濃度的TFAE研究其在hUCMSCs成骨分化中的作用。

Fig 5 Effect of TFAE on expression level of osteogenesis-related gene Col1a1,OPN,Runx2,Osx mRNA in hUCMSCs(±s, n=4)

**P<0.01vscontrol；#P<0.05，##P<0.01vspositive control

ALP、Runx2、Osx、Col1a1、OPN及鈣結(jié)節(jié)形成是評(píng)估成骨分化的重要標(biāo)志[13]，ALP的表達(dá)活性是成骨細(xì)胞分化的一個(gè)明顯的特征，促進(jìn)磷酸鹽形成，在成骨分化早期，ALP表達(dá)豐富，在基質(zhì)沉淀期，鈣化的成骨細(xì)胞中，ALP表達(dá)下降[14]。Runx2是轉(zhuǎn)錄因子Runxx家族成員之一，作為一種成骨細(xì)胞的特異轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)成骨及骨組織重建起著非常重要的作用，決定著干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)多種成骨相關(guān)基因的表達(dá)[15]，有研究報(bào)道Runx2基因缺失小鼠，成骨受損，而Runx2過(guò)表達(dá)導(dǎo)致新骨形成[16-17]。Osx位于Runx2基因下游，也是一種重要的調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子，在成骨分化及骨形成過(guò)程中起到非常重要的作用[18-19]。Runx2、Osx是成骨分化早期標(biāo)志[20]。Col1a1、OPN與成骨分化晚期相關(guān)，表達(dá)在成熟的成骨細(xì)胞中[1]，晚期階段，成骨細(xì)胞最終形成鈣結(jié)節(jié)，而鈣結(jié)節(jié)的形成是MSCs成骨分化的最直接的證據(jù)。本研究一系列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，hUCMSCs誘導(dǎo)后，與陽(yáng)性對(duì)照相比，低濃度TFAE組鈣結(jié)節(jié)形成明顯增多，ALP活力明顯增強(qiáng)，Runx2、Osx、Col1a1、OPNmRNA及Col1a1、OPN蛋白表達(dá)上調(diào)，成骨分化能力明顯增強(qiáng)。

Fig 6 Effect of TFAE on expression level of osteogenesis-specific protein Col1a1，OPN in hUCMSCs(±s, n=4)

*P<0.05，**P<0.01vscontrol；##P<0.01vspositive control

綜上所述，低濃度的TFAE具有促進(jìn)hUCMSCs增殖及成骨分化作用，TFAE中成分較多，具體是什么成分發(fā)揮作用及作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。hUCMSCs也是組織工程領(lǐng)域中理想的種子細(xì)胞，應(yīng)用前景廣闊。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)在九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室實(shí)驗(yàn)室完成，感謝實(shí)驗(yàn)室全體成員對(duì)本實(shí)驗(yàn)的支持與幫助！)

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[20]Li Y, Yan M, Wang Z, et al. 17beta-estradiol promotes the odonto/osteogenic differentiation of stem cells from a pical papilla via mitogen-activated protein kinase pathway[J].StemCellResTher, 2014, 5(6):125.

Total flavonoids from arachniodes exilis promotes osteogenic differentiation of hUCMSCs

YAN Chen1,2, YIN Chang-chang3, WANG Zi-yao1,2, YIN Ming1

(1.DeptofOrthopedics，theSecondAffiliatedHospitaltoNanchangUniversity,2.MedicalGraduateSchoolofNanchangUniversity,Nanchang330006,China；3.DeptofBiochemistry,SchoolofBasicMedicineofJiujiangCollege,JiujiangJiangxi332000,China)

Aim To study the role of the total flavonoids from arachniodes exilis(TFAE) in osteogenic differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUCMSCs).Methods hUCMSCs were isolated and cultured by tissue explants adherent method, hUCMSCs at passage 3 were used to do the experiment, hUCMSCs were treated by different concentrations of TFAE, and cellular viability was measured by CCK 8 assay; alkaline phosphatase(ALP) activity was tested by AMP method; calcium nodule formation was detected by alizarin red staining; expression level of osteogenesis-related gene type I collagen enzyme a1(collagen type Ia1, Col1a1)， osteopontin(OPN), Runx2, Osterix(Osx) mRNA was measured by RT-PCR; expression level of Col1a1,OPN protein was measured by Western blot.Results Certain concentration of TFAE(1 mg·L-1, 5 mg·L-1) promoted cellular proliferation, calcium nodules were more, ALP activity was enhanced; expression level of osteogenesis-related gene Col1a1, OPN, Runx2, OsxmRNA and Col1a1, OPN protein was up-regulated.Conculsion A certain concentration of TFAE promotes proliferation and osteogenic differentiation of hUCMSCs.>)

TFAE; hUCMSCs; proliferation; Col1a1; OPN; osteogenic differentiation

時(shí)間：2017-3-13 8:38

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170324.1247.042.html

2016-12-15,

2017-01-14

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81160226)

嚴(yán) 晨(1986-)，男，碩士生，研究方向：創(chuàng)傷與骨腫瘤，E-mail:yanchen8623@163.com； 殷 明(1958-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向：脊柱與腫瘤，通訊作者：E-mail: yinming0791@aliyun.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.04.021

A

1001-1978(2017)04-0557-06

R284.1；R329.24；R394.2；R714.56；R977.3；R977.6摘要：目的 研究刺頭復(fù)葉耳蕨總黃酮(total flavonoids from arachniodes exilis，TFAE)在人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)成骨分化中的作用。方法 采用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)hUCMSCs，取P3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同濃度的TFAE處理hUCMSCs，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性；AMP法測(cè)定堿性磷酸酶(ALP)活力，茜素紅染色檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)形成；RT-PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因I型膠原酶a1(collagen type I alpha1, Col1a1)、骨橋蛋白(osteopotin, OPN)、Runx2、Osterix(Osx)mRNA表達(dá)水平，Western blot檢測(cè)Col1a1、OPN蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 在一定濃度范圍內(nèi)，TFAE(1、5 mg·L-1)促進(jìn)細(xì)胞增殖；鈣結(jié)節(jié)數(shù)量增多；ALP活力增強(qiáng)，成骨相關(guān)基因Col1a1、OPN、Runx2、OsxmRNA及Col1a1、OPN蛋白表達(dá)水平上調(diào)。結(jié)論 一定濃度的TFAE促進(jìn)hUCMSCs增殖及成骨分化。